專利名稱：牙的制造方法及由該方法得到的牙的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及牙的制造方法及由該方法得到的牙。
背景技術(shù)：
牙是具有最外層為牙釉質(zhì)、其內(nèi)層為象牙質(zhì)的硬組織，進而在象牙質(zhì) 的內(nèi)側(cè)具有產(chǎn)生象牙質(zhì)的牙本質(zhì)細胞、進一步在中心部具有牙髄的器官。 另外，牙有時因齲齒或牙周病等而失去，牙的有無嚴重影響外觀和對食物 的味覺，并且從維持健康和維持高品質(zhì)生活的觀點出發(fā)，正在開發(fā)各種牙 的再生技術(shù)。
例如，J.Dent.Res.,2002,Vol.81(10)，pp.695-700中公開了下述內(nèi)容，將從
牙胚分離的上皮細胞或間充質(zhì)的牙囊細胞等細胞與生物體吸收性的載體 一起移植到大鼠的腹腔內(nèi)，由此再生牙樣組織。
作為牙胚的再生方法，例如日本特開2004-331557號公報中記載了在纖 維芽細胞增殖因子等生理活性物質(zhì)的存在下培養(yǎng)由生物體分離的牙胚細 胞。另外，日本特開2004-357567號公報中提出了將從生物體分離的牙胚細 胞與能分化上述細胞的細胞中的至少一種與含有纖維蛋白的載體一起培 養(yǎng)的方案，此處，含有纖維蛋白的載體使用牙胚的目標形狀的載體，形成 具有特定形態(tài)的"牙"。
另一方面，從再生醫(yī)療的觀點出發(fā)，著眼于至今被廢棄的生物體試樣 的再利用。特別是根據(jù)疾病等的不同切取的組織不同，生產(chǎn)時成為廢棄對 象的臍帶或羊膜等組織作為能參與干細胞的存在或細胞分化的器官而受 到關(guān)注。
作為著眼于該羊膜的技術(shù)，例如日本特開2006-6249號公報中公開了使 來自羊膜的上皮細胞或間質(zhì)細胞在未分化的情況下大量增殖的技術(shù)。通過 該方法增殖的細胞具有類似于未分化的胚性干細胞的多分化能力，因此，對于再生醫(yī)療等是有用的。
另外，日本特開2004-253682號公報中記載了由人羊膜間充質(zhì)細胞層及 人羊膜上皮細胞層分離側(cè)群細胞(side population cell)作為干細胞。記載 了該細胞至少能分化為神經(jīng)細胞，作為由神經(jīng)細胞產(chǎn)生的物質(zhì)的供給源是 有用的。

發(fā)明內(nèi)容
但是，再生的牙或牙胚起組織的作用時，構(gòu)成組織的多種細胞必須配 置于適當?shù)南鄬ξ恢?細胞配置)。即使簡單使用羊膜，也難以提供作為組 織而有效的牙。
因此，本發(fā)明的目的在于提供羊膜的新用途，同時提供制造保持了特 有的細胞配置的牙的牙。
本發(fā)明是鑒于上述情況得到的，提供牙的制造方法及使用該方法得到 的牙。
本發(fā)明的第一方案在于提供牙的制造方法，其包括下述步驟使下述 第1細胞集合體和下述第2細胞集合體按照不發(fā)生混合而密接的方式配置 于支撐載體的內(nèi)部，所述第1細胞集合體實質(zhì)上僅包含來自羊膜的間充質(zhì)
細胞及上皮細胞中的任意一方，所述第2細胞集合體實質(zhì)上僅包含所述來 自羊膜的間充質(zhì)細胞及上皮細胞中的任意另一方；
在所述支撐載體的內(nèi)部培養(yǎng)所述第1及第2細胞集合體。
本發(fā)明的第二方案提供由上述制造方法得到的牙。
根據(jù)本發(fā)明，可以提供羊膜的新用途，同時可以提供保持了特有的細 胞配置的牙。


是概念地表示本發(fā)明實施例的使用來自牙胚的間充質(zhì)細胞和 上皮細胞的牙胚再構(gòu)筑順序的圖，表示細胞配置前的凝膠微滴(gel drop) 的情況圖。是概念地表示本發(fā)明實施例的使用來自牙胚的間充質(zhì)細胞和上
4皮細胞的牙胚再構(gòu)筑順序的圖，是表示將第一細胞集合體配置于凝膠微滴 內(nèi)的情況圖。是概念地表示本發(fā)明實施例的使用來自牙胚的間充質(zhì)細胞和上 皮細胞的牙胚再構(gòu)筑順序的圖，是表示將第二細胞集合體配置于凝膠微滴 內(nèi)的情況圖。是概念地表示本發(fā)明實施例的使用來自牙胚的間充質(zhì)細胞和 上皮細胞的牙胚再構(gòu)筑順序的圖，是表示將配置有第一細胞集合體及第二 細胞集合體的凝膠微滴固化的情況圖。是本發(fā)明實施例的再構(gòu)成牙胚的器官培養(yǎng)后的HE染色像。圖中 的標尺表示25iiim。是重疊本發(fā)明實施例的再構(gòu)成牙胚的器官培養(yǎng)后的熒光顯微鏡 照片像與微分干涉顯微鏡像的圖。圖中的標尺表示10(Him。
具體實施例方式
本發(fā)明牙的制造方法包括下述工序使下述第1細胞集合體和下述第2 細胞集合體按照不發(fā)生混合而密接的方式配置于支撐載體的內(nèi)部，所述第 l細胞集合體實質(zhì)上僅包含來自羊膜的間充質(zhì)細胞及上皮細胞中的任意一 方，所述第2細胞集合體實質(zhì)上僅包含所述來自羊膜的間充質(zhì)細胞及上皮 細胞中的任意另一方(以下稱為配置工序)；在所述支撐載體的內(nèi)部培養(yǎng)所 述第1及第2細胞集合體的工序(以下稱為培養(yǎng)工序)。
上述制造方法中，優(yōu)選所述羊膜來自羊膜致密層。
另外，上述制造方法中，所述上皮細胞優(yōu)選來自牙胚、皮膚、粘膜及 牙肉中的至少一種的上皮細胞，更優(yōu)選來自牙胚。
另外，在上述制造方法中，優(yōu)選實質(zhì)上含有所述來自羊膜的間充質(zhì)細 胞的第1細胞集合體或第2細胞集合體為包含單一細胞的細胞集合體，更優(yōu) 選所述第1細胞集合體及第2集合體均為單一細胞集合體。
本制造方法中，由于使由來自羊膜的間充質(zhì)細胞和上皮細胞分別形成 的細胞集合體按照不發(fā)生混合而密接的方式配置于支撐載體內(nèi)部進行培 養(yǎng)，所以可以通過緊密的接觸狀態(tài)有效地重現(xiàn)細胞間相互作用，可以有效重現(xiàn)內(nèi)側(cè)為象牙質(zhì)、外側(cè)為牙釉質(zhì)的牙所特有的細胞配置，形成作為組織 的牙。
另外，作為用于制造牙的材料，通過使用至今大多被廢棄的羊膜、特 別是來自羊膜的間充質(zhì)細胞，可以新創(chuàng)造出牙材料的候補材料，另一方面， 可以提供羊膜的新利用方案。
本發(fā)明中，所謂"牙"，是指在內(nèi)側(cè)連續(xù)地具有象牙質(zhì)及在外側(cè)連續(xù)地 具有牙釉質(zhì)層的組織，是指具有牙冠或牙根的具備方向性的組織。牙的方 向性可以由牙冠或牙根的配置來特定。牙冠或牙根可以基于形狀或組織染 色等通過肉眼觀察來確認。所謂牙冠，是指具有牙釉質(zhì)與象牙質(zhì)的層結(jié)構(gòu) 的部分，牙根不存在牙釉質(zhì)層。
象牙質(zhì)及牙釉質(zhì)可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過組織染色等形象且容易 地確定。另外，牙釉質(zhì)可以通過芽釉質(zhì)細胞的存在來確定，芽釉質(zhì)細胞的 存在可以通過有無牙釉質(zhì)蛋白來確認。另一方面，象牙質(zhì)可以通過牙本質(zhì) 細胞的存在來確定，牙本質(zhì)細胞的存在可以通過有無牙本質(zhì)涎蛋白來確 認。牙釉質(zhì)蛋白與牙本質(zhì)涎蛋白的確認可以通過該領(lǐng)域中周知的方法容易 地實施，例如可以舉出原位雜交、抗體染色等。
另外，牙的方向性可以通過牙冠或牙根的配置來確定。牙冠或牙根可 以基于形狀或組織染色等通過肉眼觀察來確認。
本發(fā)明中，"牙胚"及"牙芽"是根據(jù)后述的發(fā)生階段而區(qū)別得到的物質(zhì) 中在沒有特別說明時使用的表現(xiàn)。所謂此時的"牙胚"，是指決定將來成為
牙的牙的初始胚，是在牙的產(chǎn)生階段中從通常所用的蕾狀期(Bud stage)至 鐘狀期(Bell stage)的階段，特別是未確認作為牙的硬組織的特征即象牙質(zhì)、 牙釉質(zhì)蓄積的組織。另外，所謂"牙芽"，是指由本發(fā)明中所用的"牙胚"的 階段過渡而來的、從開始蓄積作為牙的硬組織特征即象牙質(zhì)、牙釉質(zhì)的階 段開始到牙從牙肉開始萌芽發(fā)揮通常作為牙的功能前的階段的組織。
由牙胚向牙的產(chǎn)生經(jīng)由蕾狀期、帽狀期、鐘狀前期及后期的各個階段 來進行。此處，在蕾狀期，處于上皮細胞包裹間充質(zhì)細胞的狀態(tài)。至鐘狀 前期及鐘狀后期時，上皮細胞部分形成外側(cè)的牙釉質(zhì)，間充質(zhì)細胞部分在 內(nèi)部形成象牙質(zhì)。因此，通過上皮細胞與間充質(zhì)細胞的細胞間相互作用，
6由牙胚形成牙。
需要說明的是，本發(fā)明中，所謂"間充質(zhì)細胞"，是指來自間充質(zhì)組織 的細胞，所謂"上皮細胞"，是指來自上皮組織的細胞。
另外，本發(fā)明中，所謂"牙周組織"，是指牙的主要形成外層的牙槽骨 及牙根膜。牙槽骨及牙根膜可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過組織染色等形象且 容易地特定。
以下，說明本發(fā)明的牙的制造方法。
本發(fā)明牙的制造方法的配置工序中，使第1細胞集合體與第2細胞集合 體接觸地配置于支撐載體的內(nèi)部。
此處，第1細胞集合體及第2細胞集合體分別實質(zhì)上僅包含間充質(zhì)細胞 或僅包含上皮細胞。實質(zhì)上僅包含間充質(zhì)細胞的細胞集合體含有上述牙形 成用間充質(zhì)細胞。含有該牙形成用間充質(zhì)細胞的細胞集合體可以根據(jù)上述 制造方法的調(diào)制工序來調(diào)制，另一方面，實質(zhì)上僅包含上皮細胞的細胞集 合體可以與實質(zhì)上由間充質(zhì)細胞得到的細胞集合體獨立地調(diào)制(第l細胞調(diào)
制工序及第2細胞調(diào)制工序)。
另外，所謂"細胞集合體"，是指細胞密集的狀態(tài)，可以為組織的狀態(tài)， 也可以為單一細胞的狀態(tài)。另外，所謂"實質(zhì)上"，是指盡量不含有作為對 象的細胞以外的細胞。本發(fā)明中，實質(zhì)上包含羊膜間充質(zhì)細胞的細胞集合 體包含單一細胞，相對于此，包含上皮細胞的細胞集合體可以為一部分組 織或單一細胞的集合體。上皮細胞及間充質(zhì)細胞均為包含單一細胞的細胞 集合體，由于培養(yǎng)后同時能形成多顆牙，故而優(yōu)選。
第1細胞集合體與第2細胞集合體均可以為上皮細胞及間充質(zhì)細胞，構(gòu) 成該細胞集合體的細胞數(shù)量根據(jù)動物的種類、支撐載體的種類、硬度及大 小而不同，相對于l個細胞集合體，通常為1(^ 1()S個，可以優(yōu)選為103 108個。
用于本發(fā)明的間充質(zhì)細胞為來自羊膜的間充質(zhì)細胞。羊膜是構(gòu)成一部 分胎盤且在子宮內(nèi)包裹胎兒的器官，其通常在分娩時作為排泄物被廢棄。 本發(fā)明中，只要是羊膜，其獲得途徑?jīng)]有特別限定，優(yōu)選利用分娩時作為 廢棄物的羊膜。羊膜包含羊膜上皮細胞層、羊膜基底膜層和比上述層厚的羊膜致密層這三層。本發(fā)明的來自羊膜的間充質(zhì)細胞只要是來自其中的羊膜致密層的間充質(zhì)細胞即可。
來自羊膜的間充質(zhì)細胞可以使用表面抗原蛋白等從整個羊膜組織中個別地選擇來自羊膜的間充質(zhì)細胞，由于可以減少混入其他細胞，優(yōu)選由上皮細胞層分離后的羊膜致密層來調(diào)制。
從其他細胞層分離羊膜致密層可以基于膜的厚度或形態(tài)使用剪刀等從其他細胞層中物理地分離，也可以使用酶處理從上皮細胞層或基底膜層等化學地分離。作為用于得到致密層的酶，只要是可以分離上皮細胞層的酶即可，可以優(yōu)選使用例如用于分離上皮細胞層的胰蛋白酶或用于溶解基底膜層的分散酶等。上述酶可以單獨或組合多種進行使用?？梢詫⑼ㄟ^上述酶處理除去上皮細胞層及基底膜層后得到的細胞層作為羊膜致密層。
用于酶處理的處理溫度或處理時間以及根據(jù)情況采用的離心分離或攪拌的條件能基于使用的酶的酶活性適當設定，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以實施目標酶處理。上述酶處理可以對應于組織狀態(tài)反復進行或組合多種酶來進
行。作為使用酶處理的處理，可以參見公知文獻例如J.Neurosci.Res.78,208-214,2004等。
作為羊膜致密層得到羊膜間充質(zhì)細胞時，使用酶處理或攪拌等，進一步將羊膜致密層制成單一細胞。作為能用于將羊膜致密層制成單一細胞的酶，可以舉出膠原酶或分散酶、木瓜蛋白酶等酶。上述酶可以單獨使用或組合多種進行使用。本領(lǐng)域技術(shù)人員能容易地設定上述酶的濃度或處理條件。
另外，實質(zhì)上包含間充質(zhì)細胞的細胞集團只要含有來自羊膜的間充質(zhì)細胞即可，也可以含有其他間充質(zhì)細胞。
作為上述間充質(zhì)細胞以外的其他間充質(zhì)細胞，可以舉出來自于牙胚及牙胚以外的間充質(zhì)細胞。作為來自于牙胚以外的間充質(zhì)細胞，是來自生物體內(nèi)的其他間充質(zhì)組織的細胞，可以優(yōu)選舉出不含有血液細胞的骨髄細胞或間充質(zhì)干細胞，更優(yōu)選舉出來自于口腔內(nèi)間充質(zhì)細胞或顎骨內(nèi)部的骨髄細胞、頭部神經(jīng)嵴細胞的間充質(zhì)細胞、能產(chǎn)生所述間充質(zhì)細胞的間充質(zhì)前體細胞或其干細胞等。
作為間充質(zhì)細胞使用來自羊膜以外的間充質(zhì)細胞時，組合的其他間充質(zhì)細胞的來源或牙形成能力不同，但為了確實地得到具有目標細胞配置的
牙，優(yōu)選來自羊膜的間充質(zhì)細胞在至少50質(zhì)量％以上，較優(yōu)選在約75質(zhì)量。/。以上，更優(yōu)選在90質(zhì)量％以上。如果為50質(zhì)量％以上，則與來自其他組織的間充質(zhì)細胞的牙形成能力大小無關(guān)，可以確實地得到目標牙，故而優(yōu)選。
為了重現(xiàn)在生物體內(nèi)的細胞配置、有效形成具有特有的結(jié)構(gòu)及方向性的牙，用于本制造方法的上皮細胞優(yōu)選為來自牙胚，其中，從細胞的分化階段的不成熟性和均質(zhì)性的觀點考慮，優(yōu)選來自蕾狀期至帽狀期的細胞。
另夕卜，可以為來自牙胚以外的上皮細胞，這可以舉出來自生物體內(nèi)的其他上皮系組織的細胞?？梢詢?yōu)選舉出皮膚或口腔內(nèi)粘膜或牙肉的上皮細胞，更優(yōu)選皮膚或粘膜等分化的例如能生出角化或角化不全的上皮細胞的不成熟的上皮系前體細胞、例如未角化的上皮細胞或其干細胞等。
為了調(diào)制細胞集合體而從組織中分離各細胞時，牙胚及其他組織可以從下述各種動物的顎骨等中采集哺乳動物的靈長類，例如人、猴等；有蹄類，例如豬、牛、馬等；小型哺乳類的嚙齒類，例如小鼠、大鼠、兔等。牙胚及組織的采集通?？梢灾苯討猛ǔＳ糜诓杉M織的條件，可以在無菌狀態(tài)下取出，保存在適當?shù)谋４嬉褐?。需要說明的是，作為人的牙胚，除可以舉出第3臼齒，即所謂的智齒的牙胚之外，還可以舉出胎兒牙胚，但從利用自身組織的觀點來看，優(yōu)選使用智齒牙胚。
由組織、例如牙胚調(diào)制上述細胞時，首先，將從周圍組織分離的牙胚根據(jù)形狀分為牙胚間充質(zhì)組織與牙胚上皮組織。此時，由于牙胚組織能在顯微鏡下從結(jié)構(gòu)上區(qū)分，所以可以通過用解剖用剪刀或鑷子等切斷或剝下等容易地分離。另外，從牙胚組織分離牙胚間充質(zhì)組織及牙胚上皮組織可以根據(jù)其形狀用注射針、鎢針、鑷子等切斷或剝下容易地進行。
為了從周圍組織容易地分離牙胚細胞及/或從牙胚組織分離上皮組織及間充質(zhì)組織，可以優(yōu)選使用酶。作為用于上述用途的酶，可以舉出分散酶、膠原酶、胰蛋白酶等。
9構(gòu)成細胞集合體的細胞可以由采集的組織調(diào)制為單一細胞的狀態(tài)。調(diào)制工序中，為了能容易地分散為單一細胞，可以使用酶。作為上述酶，可以舉出分散酶、膠原酶、胰蛋白酶等。此時，由上皮組織分離上皮細胞時，
優(yōu)選膠原酶處理后進行胰蛋白酶處理和DNase處理。另一方面，由間充質(zhì)組織分離間充質(zhì)細胞時，優(yōu)選同時用膠原酶與胰蛋白酶處理，最終進行DNase處理。此時進行DNase處理的原因在于，防止因酶處理導致一部分細胞受到破壞，因細胞膜溶解時釋放到溶液中的DNA而發(fā)生細胞凝集，從而細胞回收量降低。
另外，為了分別得到充分的細胞數(shù)，構(gòu)成細胞集合體的細胞可以在配置工序前經(jīng)過預培養(yǎng)。細胞的培養(yǎng)可以直接使用通常用于培養(yǎng)動物細胞的溫度等條件。
作為用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基，可以使用通常用于培養(yǎng)動物細胞的培養(yǎng)基、例如Dulbcco，s Modifed Eagle Medium(DMEM)等?？梢栽谠撆囵B(yǎng)基中添加用于促進細胞增殖的血清，或者可以添加例如FGF、 EGF、 PDGF等細胞增殖因子或轉(zhuǎn)鐵蛋白等已知血清成分來代替血清。另外，添加血清時的濃度可以根據(jù)此時的培養(yǎng)狀態(tài)進行適當變更，但通?？梢詾?0容量％。細胞的培養(yǎng)中應用通常的培養(yǎng)條件，例如在37"C的溫度下、濃度為5。/。的C02的培養(yǎng)箱內(nèi)的培養(yǎng)。另外，可以適當添加鏈霉素等抗生素。
配置工序中的細胞集合體的配置是將上述第1及第2細胞集合體配置在能保持細胞的接觸狀態(tài)的支撐載體內(nèi)部。此時，各細胞集合體不會彼此混合。由于如上按照不發(fā)生混合的方式配置所述各細胞集合體，所以在細胞集合體間形成邊界線。在本說明書中，將該配置形態(tài)適當表達為"間隔化"。
作為此處所用的支撐載體，只要是能在內(nèi)部培養(yǎng)細胞的支撐載體即可，優(yōu)選為與上述培養(yǎng)基的混合物。作為上述支撐載體，可以舉出膠原、纖維蛋白、層粘連蛋白、細胞外基質(zhì)混合物、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、乳酸/乙醇酸共聚物(PLGA)、賽璐瑪特斯(日文ir々7卜U夕7，商品
名)、麥比璐蓋璐(日文^匕、才一々y》，商品名)、瑪頭利蓋璐(曰文
7卜u y》，商品名)等。上述支撐載體具有將細胞配置在內(nèi)部時能基本維持配置位置的硬度即可，可以舉出凝膠狀、纖維狀、固體狀的支撐載體。此處，所謂能維持細胞位置的硬度，通常為可用作三維培養(yǎng)的硬度、即在可以保持細胞配置的同時不阻礙由增殖導致肥大化的硬度即可，可以容易
地確定。例如，在膠原蛋白的情況下，以最終濃度為2 3mg/ml的濃度使用能提供適當?shù)挠捕取?br> 需要說明的是，此處，支撐載體具有第1及第2細胞集合體可以在載體內(nèi)部生長的程度的厚度即可，可以根據(jù)目標組織的大小等適當設定。
另外，支撐載體具備使細胞不分散、能保持細胞的接觸狀態(tài)的保持力即可。此處所說的"接觸狀態(tài)"，優(yōu)選在各細胞集合體中、或細胞集合體間，確實地使細胞相互作用的緊密(高密度)的狀態(tài)。
所謂高密度的狀態(tài)，是指與構(gòu)成組織時的密度同等程度的狀態(tài)，例如，為細胞集合體的情況下，在細胞配置時為5xl(^ lxl0MVml，為了在無損細胞活性的情況下確實地使細胞相互作用，優(yōu)選為lxl()S lxl(f個/ml，最優(yōu)選為2xl()S 8xl08個/ml的密度。以上述細胞密度調(diào)制細胞集合體時，通過離心使細胞凝集并沉淀，可以在無損細胞存活的情況下簡便地高密度化，所以優(yōu)選。上述離心可以在無損細胞存活的相當于300 1200xg、優(yōu)選為500 1000xg的離心力的旋轉(zhuǎn)數(shù)下進行3 10分鐘。在低于300xg進行離心時，細胞沉淀不充分，有時細胞密度降低，另一方面，在高于1200xg下離心時，有時細胞受到損傷，所以均不優(yōu)選。
通過離心分離來調(diào)制高密度的細胞時，通常在用于離心分離細胞的管等容器中調(diào)制單一細胞的混懸液后進行離心分離，將作為沉淀物的細胞殘留，盡可能除去上清液即可。從完全除去上清液的觀點來看，此時所用的管等容器優(yōu)選為進行過硅涂布的容器。
利用離心分離得到沉淀物時，將沉淀物直接配置到支撐載體的內(nèi)部即可。此時，優(yōu)選目標細胞以外的成分(例如，培養(yǎng)液、緩沖液、支撐載體等)的量在與細胞容量相等的量以下，最優(yōu)選不含有目標細胞以外的成分。上述高密度的細胞集合體中，細胞緊密接觸，有效地發(fā)揮細胞間相互作用。
以組織的狀態(tài)使用時，優(yōu)選進行酶處理等以除去對象細胞以外的結(jié)合組織等。目標細胞以外的成分較多時，例如，它們的量在與細胞容量相等的量以上時，不能充分發(fā)揮細胞間相互作用，所以不優(yōu)選。
另外，第1細胞集合體與第2細胞集合體的接觸優(yōu)選第1細胞集合體與 第2細胞集合體的接觸為密接，特別優(yōu)選將第2細胞集合體擠壓于第1細胞
集合體來進行配置。另外，用培養(yǎng)液、不阻礙氧透過的固態(tài)物包裹第l細
胞集合體與第2細胞集合體的周圍對于使細胞集合體之間的接觸密接是有
效的。在粘度不同的溶液中加入高密度的細胞混懸液進行配置，并直接將 溶液固化的方式也可以容易地達到保持細胞的接觸，故而優(yōu)選。此時，以
第l細胞集合體為牙胚間充質(zhì)細胞的單一細胞集合物、以第2細胞集合體為 牙胚上皮組織時，優(yōu)選以牙胚上皮組織的釉質(zhì)結(jié)節(jié)與第l細胞集合體接觸 的方式進行配置，但并不限定于此。
支撐載體為凝膠狀或溶液狀等時，可以在配置工序后設置固化支撐載 體的固化工序。通過固化工序，配置在支撐載體內(nèi)部的細胞被固定在支撐 載體內(nèi)部。支撐載體的固化中可以直接應用通常使用的支撐載體的固化條 件。例如，在支撐載體中使用膠原等能固化的化合物時，在通常使用的條 件下，例如，在培養(yǎng)溫度下使其靜置數(shù)分鐘 數(shù)十分鐘，由此可以固化。 從而可以使支撐載體內(nèi)部的細胞間的結(jié)合固化，并且可以使該結(jié)合牢固。
本發(fā)明的制造方法的培養(yǎng)工序中，在支撐載體內(nèi)部培養(yǎng)第l細胞集合 體及第2細胞集合體。該培養(yǎng)工序中，通過彼此緊密接觸的第l細胞集合體 及第2細胞集合體，可有效地進行細胞間相互作用，從而再構(gòu)成組織，即 牙。
通過支撐載體維持第1細胞集合體與第2細胞集合體的接觸狀態(tài)進行 培養(yǎng)工序即可，該培養(yǎng)工序可以是用具有第1及第2細胞集合體的支撐載體 單獨進行的培養(yǎng)，也可以是在其他動物細胞的存在下的培養(yǎng)。
作為培養(yǎng)期間，因配置在支撐載體內(nèi)部的細胞數(shù)與細胞集合體的狀 態(tài)、以及培養(yǎng)工序的實施條件而不同，但通常為1 300天，為了形成外側(cè) 具有牙釉質(zhì)、內(nèi)側(cè)具有象牙質(zhì)的牙，優(yōu)選為1 120天，從能迅速提供的觀 點考慮，可以優(yōu)選為1 60天。進而為了制成具備牙周組織的牙，通常為1 300天，可以優(yōu)選為1 60天。
僅用支撐載體進行培養(yǎng)時，可以采用在用于培養(yǎng)動物細胞的通常條件下的培養(yǎng)。此處的培養(yǎng)通?？梢灾苯硬捎迷趧游锛毎碌呐囵B(yǎng)條件，也可 以直接采用上述條件。另外，培養(yǎng)中可以添加來自哺乳動物的血清，還可 以添加對于上述細胞增殖或分化有效的已知的各種細胞因子。作為上述細
胞因子，可以舉出FGF、 BMP等。
另外，從組織或細胞集合體的換氣或供給營養(yǎng)的觀點考慮，優(yōu)選使用 器官培養(yǎng)。器官培養(yǎng)中，通常在適合動物細胞增殖的培養(yǎng)基上平鋪多孔性 膜，在該膜上放置被支撐載體包埋的細胞集合體，進行培養(yǎng)。此處所用的 多孔性膜中，優(yōu)選為具有大量0.3 5^左右的孔的膜，具體而言，可以舉 出Cell Culture Insert(日文七/k力/^于亇一一 乂廿一 卜，商品名)、啊譯堡 啊過濾膜(日文7^y求77Y少夕一，商品名)。
在其他動物細胞的存在下進行培養(yǎng)時，由于受到來自動物細胞的各種 細胞因子等的作用，可以盡快形成具有特定細胞配置的牙，所以優(yōu)選。上 述其他動物細胞的存在下的培養(yǎng)可以使用分離細胞或培養(yǎng)細胞通過生物 體外的培養(yǎng)來進行。
另外，可以將具有第1與第2細胞集合體的支撐載體移植到生物體中， 在生物體內(nèi)進行培養(yǎng)。上述在生物體內(nèi)的培養(yǎng)由于可以盡快形成牙和牙周 組織，所以特別優(yōu)選。此時，將第1和第2細胞集合體與支撐載體一起移植 到生物體內(nèi)。
能用于該用途的動物可以優(yōu)選舉出哺乳動物，.例如人、豬、小鼠等， 更優(yōu)選來自與牙胚組織相同種類的動物。移植人牙胚組織時，優(yōu)選使用人 或變成免疫功能不全的人以外的其他哺乳動物。為了盡可能地正常產(chǎn)生動 物細胞的器官或組織，作為適合上述生物體內(nèi)生長的生物體部位，優(yōu)選腎 臟皮膜下、腸間膜、皮下移植、口腔內(nèi)等。
作為移植的生長期間，根據(jù)移植時的大小與產(chǎn)生的牙大小而不同，通 ?？梢詾? 400天。例如，移植到腎臟皮膜下的移植期間也根據(jù)移植的培 養(yǎng)物的大小和再生牙的大小而不同，但從牙的再生與在移植部位產(chǎn)生的牙 大小的觀點考慮，優(yōu)選為7 60天。
向生物體內(nèi)移植前，可以在生物體外進行培養(yǎng)(前培養(yǎng))。通過該前培 養(yǎng)使細胞間的結(jié)合和第1與第2細胞集合體之間的結(jié)合牢固，從而可以使細胞間相互作用更牢固，所以優(yōu)選。結(jié)果可以縮短總體生長期。
前培養(yǎng)的期間可以為短期，也可以為長期。在長期例如3天以上、優(yōu) 選為7天以上的情況下，可以由牙胚產(chǎn)生牙芽，所以可以縮短移植后形成 牙的時間，因此優(yōu)選。作為前培養(yǎng)期，例如，作為在腎臟皮膜下進行移植 時的器官培養(yǎng)，由于1 7天能有效再生牙，所以優(yōu)選。
由本發(fā)明的制造方法制造的牙具有內(nèi)側(cè)為象牙質(zhì)、外側(cè)為牙釉質(zhì)的牙 所特有的細胞配置(結(jié)構(gòu))，并且優(yōu)選還具備牙的前端(牙冠)與牙根的方向 性。通過至少除上述特有的細胞配置、優(yōu)選細胞配置之外，還具有方向性， 也可以發(fā)揮作為牙的機能。因此，能廣泛用作牙的代替物。特別是，使用 來自本身的牙胚的間充質(zhì)細胞與上皮細胞時，可以在避免排斥反應導致的 問題的情況下進行使用。另外，使用來自通常適合移植抗原的他人的牙胚 的細胞時，也能避免因排斥反應導致的問題。
另外，通過本發(fā)明的制造方法制造的牙可以為具有牙特有的細胞配置 的牙的集合體。
由于上述牙的集合體由具有牙特有的細胞配置的多顆牙構(gòu)成，所以可 以從聚合體中分離各個牙，按照以下所述的方式用作一個牙的移植片。結(jié) 果，可以有效制作作為移植片的牙。
為了得到由多顆牙構(gòu)成的牙的集合體，優(yōu)選第1與第2細胞集合體均由
單一細胞構(gòu)成。由此，可以存在包括多個控制牙的顆數(shù)的牙釉質(zhì)中心等因 子的部分，從而可以容易地形成多顆牙。
需要說明的是，與上述相同，培養(yǎng)工序可以為器官培養(yǎng)，也可以為在 腎臟皮膜下的培養(yǎng)，但將所得的牙用作移植片時，優(yōu)選為不與其他動物細 胞接觸、并且全部過程在體外調(diào)制的器官培養(yǎng)。
進而，本發(fā)明的制造方法中，可以將培養(yǎng)期間繼續(xù)到形成牙周組織為 止。由此，除了形成牙本身之外，將牙支持在顎骨上也可以形成固定的牙 槽骨和牙根膜等牙周組織。結(jié)果可提供一種移植后能實用的牙。
需要說明的是，為了制造牙周組織，可以在上述培養(yǎng)工序后設置分離 由上述培養(yǎng)得到的牙周組織的工序，僅得到牙周組織。分離牙周組織只要 可以分離在培養(yǎng)工序的過程中所形成的牙周組織與牙即可，可以用任意的
14方法進行，可以舉出用鑷子等進行分離或用酶進行部分消化等。
根據(jù)本發(fā)明得到的牙與牙周組織除可以用作移植片之外，還可以優(yōu)選 用于研究闡明牙的發(fā)生過程，也可以用作今后的對于產(chǎn)生與牙相關(guān)的組織 有效的研究工具。
需要說明的是，將所得的牙或牙周組織用作移植片時，優(yōu)選制造方法 的培養(yǎng)工序為不與其他動物細胞接觸并且全部過程可以在體外調(diào)制的器 官培養(yǎng)。
另外，本發(fā)明包括牙的移植方法。該移植方法包括得到上述牙的集 合體的工序；從牙的復合體分離各個牙的工序；調(diào)整分離的牙進行移植使 其具有與在移植部位的其他牙相同的方向性的工序。
由此，可以同時得到具備特有的細胞配置與方向性的多顆牙，有效實 施牙的移植。
本發(fā)明的牙可以適用于治療或處置伴有牙缺失和損傷的各種癥狀、例 如齲齒、邊緣性牙周炎(牙槽膿腫)、牙周病導致的牙缺損、事故等導致的 折損或脫落等。
艮P，本發(fā)明的治療方法包括將由本發(fā)明的制造方法得到的牙及/或牙周 組織移植到缺失及/或損傷部位的步驟。由此，可以治療及/或緩和缺失及/ 或損傷部位的上述癥狀。
本發(fā)明的其他治療方法包括在缺失及/或損傷部位僅實施本發(fā)明的培 養(yǎng)工序或?qū)嵤┡渲霉ば蚺c培養(yǎng)工序。此時，作為支撐載體，除上述載體之 外，還可以將缺失及/或損傷部位的周圍組織本身作為支撐載體。由此，利 用來自生物體內(nèi)的周邊組織的細胞因子等，可以更迅速地治療缺失及/或損 傷部位等。
實施例
以下，說明本發(fā)明的實施例，但并不限定于此。另外，只要沒有特別 說明，實施例中的％均為重量(質(zhì)量)基準。 (l)來自羊膜的間充質(zhì)細胞的調(diào)制進行知情同意，從提供的胎盤中物理地剝離羊膜組織。在15cm皿中放 入適量PBS(-)，用外科用剪刀切斷，使用鑷子進行清洗，由此從所得的羊 膜組織除去血細胞。將處理后的羊膜組織轉(zhuǎn)移到新的皿中，用PBS(-)再次 清洗后，進一步剪切后，轉(zhuǎn)移至放有25ml 0.25n/。胰蛋白酶(GIBCO公司制) 的50ml離心管中。
首先，為了除去來自羊膜的上皮細胞，如下所述地進行酶處理。使用 振蕩培養(yǎng)機，進行酶反應(200rpm、 15分鐘、37。C)后，將處理后的羊膜組 織轉(zhuǎn)移到新的放有25ml 0.25M胰蛋白酶(GIBCO公司制)的50ml離心管中， 進行酶反應(400rpm、 15分鐘、37°C)。進而，重復進行3次(共計5次)胰蛋 白酶處理，主要除去上皮細胞層。
然后，為了回收來自羊膜的間充質(zhì)細胞，在15mm皿中加入適量PBS(-)， 轉(zhuǎn)移結(jié)束了第5次胰蛋白酶處理后的羊膜組織并清洗，用剪刀切斷成約 5mm方形。將剪切后的組織試樣接著轉(zhuǎn)移到加入有酶混合液(Hank's平衡鹽 類溶液中，lmg/ml膠原酶(Sigma公司制)、0.1Q/。分散酶II(Roche公司制)、 0.0ln/o木瓜蛋白酶(Worthington公司制)、0.01。/oDNase(Sigma公司制))的50ml 離心管中，用振蕩培養(yǎng)機進行酶反應(400rpm、 l小時、37°C)。將進行了酶 處理得到的細胞混懸液用金屬過濾器過濾，將所得的過濾液轉(zhuǎn)移于50ml 離心管，進行離心(2000rpm、 IO分鐘、室溫)。丟棄離心后的上清液，將顆 粒用PBS(-)洗滌3次。用40pm的尼龍網(wǎng)過濾后，進行離心(2000rpm、 10分 鐘、室夂顯)，得到羊膜間充質(zhì)細胞。
將羊膜間充質(zhì)細胞混懸在添加有1 Ong/ml的hLIF(Sigma公司制)、 0.2mM巰基乙醇(Sigma公司制)、10%FCS(JRH Biosciences, Lenexa， KS) 的DMEM/F12(Sigma公司制)中，以lml中約l 5xl()S個的細胞密度接種于 10cm細胞培養(yǎng)皿。直至制作再構(gòu)成牙胚之前，適時通過胰蛋白酶處理分散 細胞，進行繼代培養(yǎng)。
(2)牙胚上皮組織的調(diào)制
在顯微鏡下通過常規(guī)方法從作為Green Fluorescence Protein(EGFP)轉(zhuǎn) 基因小鼠的C57BL/6-TgN(act-EGFP)OsbC14-Y01-FM131(由理研生物資源 中心購入)的胚仔(胎齡14.5日)摘出下顎切牙牙胚。將下顎切牙牙胚組織用不含Ca"、 Mg"的磷酸緩沖液(PBS(-))洗滌，用在PBS(-)中添加了最終濃度 為1.2U/ml的分散酶II(Roche公司制)的酶液在室溫下處理12.5分鐘。然后， 用添加10。/。FCS(JRH公司帝lj)的DMEM(Sigma公司制)洗滌3次。進而，添加 DNasel溶液(Takara公司制)，使最終濃度為70U/ml，分散牙胚組織，使用 25G注射針(Terumo公司制)外科地分離牙胚上皮系組織。 (3)再構(gòu)成牙胚的制作
再構(gòu)成牙胚的制作中使用上述調(diào)制的牙胚上皮系組織和人羊膜間充 質(zhì)細胞。
用胰蛋白酶處理從皿中回收人羊膜間充質(zhì)細胞。在涂布有硅脂的1.5ml 微管(Eppendorf公司制)中放入用添加10%FCS(JRH公司制)的 DMEM(Sigma公司制)混懸的人羊膜間充質(zhì)細胞，通過離心分離以沉淀的方 式回收細胞。盡可能除去離心后的培養(yǎng)液的上清液，再次進行離心操作， 邊用實體顯微鏡觀察邊使用GELoader TipO,5-20^0ppendorf公司帝lJ)完全 除去殘留在細胞的沉淀周圍的培養(yǎng)液，準備用于再構(gòu)成牙胚制作的人羊膜 間充質(zhì)細胞。
在涂布有硅脂的皮氏培養(yǎng)皿中滴入3(^1 2mg/ml的Cdlmatrix type I-A(新田明膠公司制)，制作明膠凝膠微滴(gel dr叩)。在該溶液中，使 用0.1-10(il的吸頭(Quality Scientific plastics公司帝ij)供給0.2 0.3^上述人羊 膜間充質(zhì)細胞，制作細胞凝集塊。然后，使用10pl的吸頭，將牙胚上皮系 組織供給于相同的凝膠微滴，使用鎢針使分離到的牙胚上皮系組織原本與 間充質(zhì)組織接觸的面密接于人羊膜間充質(zhì)細胞的細胞凝集塊。然后，通過 使凝膠微滴固化，使牙胚上皮系組織與人羊膜間充質(zhì)細胞間的結(jié)合更牢 固，從而制作高密度再構(gòu)成牙胚。
參見圖l說明這點。需要說明的是，圖1中，io是凝膠微滴(支撐載體)， 12是細胞凝集塊(第1細胞集合體)，14是細胞凝集塊(第2細胞集合體)，16 表示吸頭。
利用吸頭16預先配置于凝膠微滴10(參照圖1(A))內(nèi)的細胞凝集塊12在 凝膠微滴10內(nèi)構(gòu)成球體(參見圖1(B))。然后，通過擠入另一個細胞凝集塊 14，從而球體的細胞凝集塊12被破壞，包裹另一個細胞凝集塊14(參見圖
171 (C))。然后，將凝膠微滴10固化，由此使細胞間的結(jié)合變牢固(參見圖1 (D))。
(4) 再構(gòu)成的牙胚的器官培養(yǎng)
將在凝膠中制作的高密度再構(gòu)成牙胚在CO2培養(yǎng)箱中靜置10分鐘，將 Cellmatrix type I-A(新田明膠公司制)固化。準備培養(yǎng)容器，使Cdl Culture Insert (細胞培養(yǎng)小室)(孔徑尺寸為0.4微米的PET膜;BD公司制)接觸添加 有10容量。/。FCS(JRH公司制)、0.1mg/ml的L-抗壞血酸(Sigma公司制)、2mM 的L-谷氨酰胺(GIBCO公司制)的DMEM(Sigma公司制)。將再構(gòu)成牙胚與作 為支撐載體的周圍凝膠一起轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)容器的Cdl Culture Insert的膜上， 進行器官培養(yǎng)。
對利用器官培養(yǎng)而產(chǎn)生牙的現(xiàn)象進行解析時，通常進行14天間的培 養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，用4%仲甲醛-磷酸緩沖液固定6小時后，使用4.5。/。的EDTA 溶液(pH7.2)進行24小時的中性脫灰。然后，通過常規(guī)方法進行石蠟包埋， 制作l(Him的切片。為了進行組織學解析，根據(jù)常規(guī)方法進行蘇木素-伊紅 染色(HE染色)。
另外，使用來自C57BL/6-TgN (act-EGFP) OsbC14-Y01-FM131小鼠 的牙胚時，進行中性脫灰后，用12.5%蔗糖(Wako公司制)處理12小時， 用25%蔗糖(Wako公司制)處理12小時，包埋于OCT compound (Miles Inc. 公司制)，用恒冷箱(Leica公司制)制作10nm的切片，用熒光顯微鏡(ZEISS 公司制)觀察。另外，為了進行組織學解析，根據(jù)常規(guī)方法進行蘇木素-伊紅染色(HE染色)。
(5) 用器官培養(yǎng)進行評價
如圖2所示，通過器官培養(yǎng)如上所述得到的再構(gòu)成牙胚形成再生牙。 該再生牙如圖2所示，從外側(cè)具有芽釉質(zhì)細胞、牙釉質(zhì)、象牙質(zhì)、牙本質(zhì) 細胞、中央具有牙髄細胞。該細胞配置與正常的牙相同。
由此可知，根據(jù)本實施例，將人羊膜間充質(zhì)細胞與牙胚上皮系組織進 行高密度間隔培養(yǎng)，間充質(zhì)細胞與上皮系組織有效地相互作用，可以形成 具有特有的組織結(jié)構(gòu)的牙。
然后，用微分千涉顯微鏡及熒光顯微鏡確認構(gòu)成形成的牙的各細胞來源。用微分干渉微鏡像進行的觀察中，可以確認與牙胚的器官培養(yǎng)相同地 牙特有的從外側(cè)具有芽釉質(zhì)細胞、牙釉質(zhì)、象牙質(zhì)、牙本質(zhì)細胞，中央具 有牙髄細胞的組織結(jié)構(gòu)。進而，如圖3所示，由用熒光顯微鏡進行的GFP
觀察可確認，位于牙釉質(zhì)外側(cè)的芽釉質(zhì)細胞為GFP陽性(圖3中明部)，位于 象牙質(zhì)內(nèi)部的牙本質(zhì)細胞與牙髄細胞為GFP陰性(圖3中暗部)。
該結(jié)果表示位于牙釉質(zhì)外側(cè)的芽釉質(zhì)細胞是來自上皮細胞的細胞，位 于象牙質(zhì)內(nèi)側(cè)的牙本質(zhì)細胞與牙髄細胞來自羊膜間充質(zhì)細胞。
如上所述，根據(jù)本發(fā)明，通過將來自羊膜的間充質(zhì)細胞與來自牙胚的 上皮細胞進行間隔培養(yǎng)，可以形成具有特有的細胞配置的牙。另外，來自 羊膜的間充質(zhì)細胞對于形成牙是有用的。
通過參考將日本專利申請第2007-49128號的公開內(nèi)容全部引用到本說 明書中。
通過參考將記載于本說明書中的所有文獻、專利申請以及技術(shù)規(guī)格引 用到本說明書中，引用程度與具體且分別記載通過參考引用各個文獻、專 利申請和技術(shù)規(guī)格的情況相同。
權(quán)利要求
1、牙的制造方法，包括下述步驟使下述第1細胞集合體和下述第2細胞集合體按照不發(fā)生混合而密接的方式配置于支撐載體的內(nèi)部，所述第1細胞集合體實質(zhì)上僅包含來自羊膜的間充質(zhì)細胞及上皮細胞中的任意一方，所述第2細胞集合體實質(zhì)上僅包含所述來自羊膜的間充質(zhì)細胞及上皮細胞中的任意另一方；在所述支撐載體的內(nèi)部培養(yǎng)所述第1細胞集合體及第2細胞集合體。
2、 如權(quán)利要求l所述的制造方法，其中，所述羊膜來自羊膜致密層。
3、 如權(quán)利要求l所述的制造方法，其中，所述上皮細胞是來自牙胚、皮膚、粘膜及牙肉中的至少一種的上皮細胞。
4、 如權(quán)利要求l所述的牙的制造方法，其中，所述上皮細胞來自牙胚。
5、 如權(quán)利要求l所述的制造方法，其中，實質(zhì)上含有所述來自羊膜的間充質(zhì)細胞的第1細胞集合體或第2細胞集合體是包含單一細胞的細胞集合體。
6、 如權(quán)利要求l所述的制造方法，其中，所述第1細胞集合體和第2集合體均為單一細胞集合體。
7、 如權(quán)利要求l所述的制造方法，其中，所述支撐載體是選自由膠原、纖維蛋白、層粘連蛋白、細胞外基質(zhì)混合物、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、乳酸/乙醇酸共聚物(PLGA)、賽璐瑪特斯(商品名)、麥比璐蓋璐(商品名)和瑪頭利蓋璐(商品名)構(gòu)成的組中的至少l種。
8、 如權(quán)利要求l所述的牙的制造方法，其特征在于，繼續(xù)所述培養(yǎng)直至形成牙周組織。
9、 一種牙，其是由權(quán)利要求l所述的牙的制造方法得到的。
全文摘要
本發(fā)明公開通過下述步驟制造牙的制造方法，所述步驟是使使下述第1細胞集合體和下述第2細胞集合體按照不發(fā)生混合而密接的方式配置于支撐載體的內(nèi)部，所述第1細胞集合體實質(zhì)上僅包含來自羊膜的間充質(zhì)細胞及上皮細胞中的任意一方，所述第2細胞集合體實質(zhì)上僅包含來自羊膜的間充質(zhì)細胞及上皮細胞中的任意另一方；在所述支撐載體的內(nèi)部培養(yǎng)所述第1及第2細胞集合體。
文檔編號A01K67/02GK101679946SQ20088000632
公開日2010年3月24日 申請日期2008年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月28日
發(fā)明者櫻川宣男, 孝 辻 申請人:株式會社器官再生工學;學校法人北里學園;日本尼德克株式會社