專利名稱：包括用含3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸的共存培養(yǎng)基培養(yǎng)植物組織的共存步驟的提高植物 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請要求2007年2月28日提交的日本國專利申請2007-49161的優(yōu)先權(quán)。
本發(fā)明涉及提高利用土壤桿菌的植物轉(zhuǎn)化的效率的方法。
背景技術(shù)：
作為主要谷類即玉米、稻等單子葉植物的轉(zhuǎn)化方法，傳統(tǒng)上已知有電穿孔法、粒子槍法等。但是，這些物理基因?qū)敕椒ù嬖谌缦聠栴}導(dǎo)入了多拷貝的基因，基因的插入不是完好形式，轉(zhuǎn)化植物多見畸形、不育，等等。
利用土壤桿菌細(xì)菌的基因?qū)敕ㄗ鳛殡p子葉植物的轉(zhuǎn)化法有著普遍的應(yīng)用。土壤桿菌屬細(xì)菌的宿主僅限于雙子葉植物，認(rèn)為其不能寄生在單子葉植物中(非專利文獻(xiàn)1)，但正在嘗試用土壤桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物。
Grimsley等人報告稱在土壤桿菌的T-DNA中插入玉米條紋病毒(Maizestreak vims)的DNA,再將其接種至玉米生長點(diǎn)，確認(rèn)了玉米條紋病毒的感染。而在僅接種玉米條紋病毒的DNA時，不能確認(rèn)上述感染癥狀，可以解釋成以上現(xiàn)象表明土壤桿菌能夠向玉米中導(dǎo)入DNA(非專利文獻(xiàn)2)。但是，病毒在未整合入核基因組的情況下仍具有增殖可能性，該結(jié)果并不能說明T-DNA整合到核上。Grimsley等人進(jìn)一步揭示感染效率以接種至玉米的莖頂部生長點(diǎn)時為最高(非專利文獻(xiàn)3),其感染需要土壤桿菌的質(zhì)粒的VirC基因(非專利文獻(xiàn)4)。
Gould等人用針損傷玉米的生長點(diǎn)后，接種帶有卡那霉素抗性基因和GUS基因的強(qiáng)病原性土壤桿菌EHA1，用卡那霉素選^^處理后的生長點(diǎn)，結(jié)果得到了顯示抗性的植物。為了確認(rèn)其子代的種子中具有導(dǎo)入的基因而進(jìn)行了 Southren分析，結(jié)果對于一部分種子確認(rèn)了導(dǎo)入基因(非專利文獻(xiàn)5)。這提示在用卡那霉素對經(jīng)土壤桿菌處理的生長點(diǎn)進(jìn)行選擇而得到的植
3物體中，混合存在有轉(zhuǎn)化細(xì)胞和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞(嵌合現(xiàn)象)。
Mooney等人嘗試了使用土壤桿菌對小麥的胚導(dǎo)入卡那霉素抗性基因。首先，通過用酶處理胚使其細(xì)胞壁損傷，然后接種土壤桿菌。處理后的愈傷組織中增殖出極少數(shù)的認(rèn)為具有卡那霉素抗性的愈傷組織，但這些愈傷組織不能再生成植物體。此外，在通過Southren分析來確認(rèn)卡那霉素抗性基因的存在時，在所有抗性愈傷組織中均觀察到導(dǎo)入基因的結(jié)構(gòu)突變(非專利文獻(xiàn)6)。
Raineri等人在損傷稻的胚盤后，用強(qiáng)病原性的土壤桿菌A281 (pTiBo542)處理了稻的8個品種，在曰本晴、藤坂5號這2個品種中觀察到腫瘤狀組織的增殖。而且，將帶有下述質(zhì)粒的土壤桿菌接種于稻胚，觀察到卡那霉素抗性愈傷組織的增殖，所述質(zhì)粒是在從T-DNA中除去激素合成基因而得的Ti質(zhì)粒中插入卡那霉素抗性基因和GUS基因而得到的。在該抗性愈傷組織中，確認(rèn)到了 GUS基因的表達(dá)，但不能獲得轉(zhuǎn)化植物。這些可以解釋為土壤桿菌的T-DNA被導(dǎo)入到稻的細(xì)胞中(非專利文獻(xiàn)7)。
如上述，有研究報告揭示在稻、玉米、小麥等稻科作物中也能夠利用土壤桿菌進(jìn)行基因?qū)?。然而，其都存在再現(xiàn)性的問題，此外，關(guān)于導(dǎo)入基因的確認(rèn)是不完全的、沒有給出有說服力的結(jié)果(非專利文獻(xiàn)8)。
Chan等人報告將在2，4-D共存下培養(yǎng)了 2天的稻未成熟胚損傷后，在含馬鈴薯懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基中對其接種了帶有叩t II基因和GUS基因的土壤桿菌。在含G418培養(yǎng)基上培養(yǎng)經(jīng)過處理的未成熟胚，結(jié)果由誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織得到了再分化植物體。在通過Southren分析確認(rèn)再分化植物體及其子代植物體中的GUS基因的存在時，確認(rèn)了無論是再分化本代還是子代植物體中均存在導(dǎo)入基因(非專利文獻(xiàn)9)。該結(jié)果支持用土壤桿菌轉(zhuǎn)化稻，但轉(zhuǎn)化效率非常低，僅為1.6%，相對于供試的250個未成熟胚，顯示正常生長的再生植物體只有1個個體。為了摘出稻的未成熟胚，需要大量勞力，因此很難說這樣的低轉(zhuǎn)化效率到達(dá)了實用水平。
近年來，有報告稱通過利用具有強(qiáng)病原性土壤桿菌的一部分病原性基因的超級二元載體，即使在稻、玉米等單子葉植物中，也能夠進(jìn)行穩(wěn)定、高效率的轉(zhuǎn)化(非專利文獻(xiàn)10和11)。這些報告認(rèn)為，利用土壤桿菌進(jìn)行的轉(zhuǎn)化除了能夠?qū)崿F(xiàn)穩(wěn)定、高效率的轉(zhuǎn)化之外，還具有下述優(yōu)點(diǎn)所得轉(zhuǎn)化植物的突變少，導(dǎo)入基因的拷貝數(shù)少、且多為完好形式。繼在稻、 米中取得成功之后，還有報告稱在主要谷類即小麥(非專利文獻(xiàn)12)、大麥(非專利文獻(xiàn)13)和蜀黍(非專利文獻(xiàn)14)中利用土壤桿菌進(jìn)行了轉(zhuǎn)化。
Ishida等人(1996)以玉米自交系(inbred )為材料利用土壤桿菌進(jìn)行了轉(zhuǎn)化。其后，相繼又有關(guān)于利用土壤桿菌轉(zhuǎn)化玉米的報告(非專利文獻(xiàn)15-21)。作為改善利用土壤桿菌轉(zhuǎn)化玉米的效率的嘗試，有在N6基本培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)化選擇細(xì)胞(非專利文獻(xiàn)20)、在培養(yǎng)基中添加AgN03和羧芐西林(非專利文獻(xiàn)20、 22)、在共存培養(yǎng)基中添加半胱氨酸(非專利文獻(xiàn)21)，等等。Ishida等人(2003)(非專利文獻(xiàn)22)報告通過用含AgN03和羧卡西林的培養(yǎng)基選擇共存培養(yǎng)后的玉米未成熟胚，提高了玉米的轉(zhuǎn)化效率。
通過如上述地改變培養(yǎng)基組成、選擇標(biāo)記基因，提高了利用土壤桿菌轉(zhuǎn)化玉米的效率，并擴(kuò)大了適應(yīng)品種。但是，其效率仍比與玉米同屬單子葉作物的稻要低，在考察分離出的新基因的效果的實驗研究中、以及在通過基因重組制作新玉米品種等情況下，希望開發(fā)出具有更高轉(zhuǎn)化效率的方法。
麥草畏(Dicamba) (3,6-二氯-2-曱氧基苯曱酸)與2,4-D(2,4-二氯苯氧基乙酸)一樣作為植物激素的生長素在植物組織培養(yǎng)中使用。在玉米的組織培養(yǎng)中也使用麥草畏。Duncan等報告分別用含4.5|iM的2，4-D和15pM的麥草畏的培養(yǎng)基培養(yǎng)玉米的未成熟胚，與2,4-D相比，使用含麥草畏的培養(yǎng)基時具有再分化能力的愈傷組織的形成率高(非專利文獻(xiàn)23)。但是，近年報告的利用土壤桿菌進(jìn)行的玉米轉(zhuǎn)化中，幾乎所有的未成熟胚培養(yǎng)均是使用含2,4-D的培養(yǎng)基進(jìn)行的(非專利文獻(xiàn)15-21、 24和25)。 Frame等報告分別用含2,4-D和麥草畏的培養(yǎng)基進(jìn)行利用土壤桿菌的玉米轉(zhuǎn)化，使用含麥草畏的培養(yǎng)基時的轉(zhuǎn)化效率高。但是，F(xiàn)rame等所比較的培養(yǎng)基中，2,4-D的濃度為6.75(iM,而麥草畏的濃度與之不同，為15nM,是2，4-D的濃度的2倍以上，而且除2,4-D和麥草畏以外，在組成上也存在差異。于是，討論認(rèn)為產(chǎn)生轉(zhuǎn)化效率差異的原因是含麥草畏的培養(yǎng)基的硝酸銀濃度比含2,4-D的培養(yǎng)基高，而沒有記述生長素的差異帶來的效果(非專利文獻(xiàn)26)。
如上述，在利用土壤桿菌的玉米轉(zhuǎn)化中，采用目前的方法雖可穩(wěn)定地獲得轉(zhuǎn)化植物，但與同為單子葉作物的稻相比，轉(zhuǎn)化效率低，希望開發(fā)出能夠以更高效率獲得轉(zhuǎn)化體的方法。
專利文獻(xiàn)1:特開2000-342255專利文獻(xiàn)2 專利文獻(xiàn)3 專利文獻(xiàn)4
專利文獻(xiàn)5 專利文獻(xiàn)6
特開2000-342256 特開2000-23675 特開2000-342253 WO2005/017169 WO2005/017152
非專利文獻(xiàn)1: De Cleene, M. and De Ley, J. (1976) The host range of crown gall. Bot. Rev. 42: 389-466.
非專利文獻(xiàn)2: Grimsley, N.， Horn, T., Davis, J.W. and Horn, B. (1987) Agrobacterium-mediated delivery of infectious maize streak virus into maize plants. Nature 325: 177-179.
非專利文獻(xiàn)3: Grimsley, N.H.， Ramos, C.， Hein， T. and Horn, B. (1988) Meristematic tissues of maize plants are most susceptible to Agroinfection with maize streak virus. Bio/technology 6: 185-189.
非專利文獻(xiàn)4: Grimsley, N., Horn, B., Ramos, C., Kado, C. and Rogowsky, P. (1989) DNA transfer from Agrobacterium to Zea mays or Brassica by agroinfection is dependent on bacterial virulence functions. Mol. Gen. Genet. 217: 309-316.
非專利文獻(xiàn)5: Gould, J.， Devey, M.， Hasegawa, O.， Ulian, E,C.， Peterson, G. and. Smith, R.H. (1991) Transformation of Zea mays L using Agrobacterium tumefaciens and shoot apex. Plant Physiol. 95: 426-434.
非專利文獻(xiàn)6: Mooney, P.A.， Goodwin, P.B., Dennis, E.S. and Llewellyn, D丄(1991) Agrobacterium tumefaciens-gene transfer into wheat tissues. Plant Cell, Tissues and Organ Culture 25: 209-218.
非專利文獻(xiàn)7: Raineri, D.M.， Bottino, P., Gordon, M.P. and Nester， E.W. (1990) Agrobacterium-mediated transformation of rice (Oryza sativa L.). Bio/technology 8: 33-38.
非專利文南矢 8: Potrycus, I (1990) Gene transfer to cereals: an assessment. Bio/technology 8: 535-542.
非專利文獻(xiàn)9: Chan, M-T., Chang, H-H., Ho, S-L., Tong， W-F. and Yu, S-.M. (1993) Agrobacterium-mediated production of transgenic rice plants expressing a chimeric a-amylase promoter / p-glucuronidase gene. Plant Mol.
6Biol. 22: 491-506.
非專利文獻(xiàn)10: Hiei, Y., Ohta, S.， Komari, T. and Kumashiro, T. (1994) Efficient transformation of rice (Oryza sativa L) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. The Plant Journal 6: 271-282.
非專利文獻(xiàn)11: Ishida, Y" Saito， H" Ohta， S., Hiei， Y" Komari, T. and Kumashiro, T. (1996) High efficiency transformation of maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens. Nature Biotechnology 14: 745-750.
非專利文獻(xiàn)12: Cheng, M., Fry, J. E., Pang, S., Zhou, H.， Hironaka, C. M., Duncan, D. R.， Conner, T. W.， Wan, Y. (1997) Genetic transformation of wheat mediated by Agrobacterium tumefaciens. Plant Physiol. 115: 971-980.
非專利文獻(xiàn)13: Tingay， S., McElroy, D.， Kalla， R" Fieg, S., Wang, M" Thornton, S.， Brettell, R. (1997) Agrobacterium tumefaciens-mediated barley transformation. Plant J. 11: 1369-1376.
非專利文獻(xiàn)14: Zhao， Z,Y., Cai， T" Tagliani, L., Miller, M,， Wang, N" Peng, H., Rudert, M., Schoeder, S., Hondred, D., Seltzer, J., Pierce, D. (2000) Agrobacterium-mediated sorghum transformation. Plant Mol. Biol. 44 : 789-798.
非專利文獻(xiàn)15: Deji, A" Sakakibara， H" Ishida， Y., Yamada, S" Komari, T.， Kubo, T., Sugiyama, T. (2000) Genomic organization and transcriptional regulation of maize ZmRRl and ZmRR2 encoding cytokinin-inducible response regulators. Biochim. et Biophys. Acta 1492: 216-220.
非專利文獻(xiàn)16: Negrotto， D., Jolley， M., Beer, S., Wenck, A. R., Hansen, G. (2000) The use of phosphomannose-isomerase as a selection marker to recover transgenic maize plants (Zea mays L.) via Agrobacterium transformation. PlantCell Reports 19: 798-803.
非專利文獻(xiàn)17: Nomura, M., Sentoku, N., Nishim腦，A.， Lin， J隱H" Honda， C.， Taniguchi, M.， Ishida, Y., Ohta， S., Komari, T.， Miyao-Tokumori, M., Kono-M濕kami, Y.， Tajima, S,, Ku, M. S. B., Matsuoka, M. (2000a) The evolution of C4 plants: acquisition of cis-regulatory sequences in the promoter of C4-type pyruvate, orthophosphate dikinase gene. Plant J. 22: 211 -221.非專利文獻(xiàn)18: Nomura, M" Katayama， K" Nishimura, A" Ishida, Y" Ohta, S., Komari, T., Miyao-Tokutomi, M.， Tajima, S.， Matsuoka, M. (2000b) The promoter of rbcS in a C3 plant (rice) directs organ-specific, light-dependent expression in a C4 plant (maize), but does not confer bundle sheath cell-specific expression. Plant Mol. Biol. 44: 99-106.
非專利文獻(xiàn)19: Taniguchi, M., Izawa， K.， Ku, M. S. B., Lin, J-H., Saito, H., Ishida， Y., Ohta, S.， Komari, T., Matsuoka, M., Sugiyama, T. (2000) The promoter for the maize C4 pyruvate, orthophosphate dikinase gene directs cell-and tissue-specific transcription in transgenic maize plants. Plant Cell Physiol. 41: 42-48.
非專利文獻(xiàn)20: Zhao, Z.-Y., Gu， W., Cai, T., Tagliani, L., Hondred, D,, Bond, D., Schroeder, S.， Rudert, M.， Pierce, D. (2001) High throughput genetic transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens in maize. Mol. Breed. 8: 323-333,
非專利文獻(xiàn)21: Frame, B.R.， Shou, H,， Chikwamba, R.K.， Zhang， Z.， Xiang, C., Fonger, T.M., Pegg, S.E.K., U, B., Nettleton， D.S.， Pei, D., Wang, K. (■2002) Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of maize embryos using a standard binary vector system. Plant Physiol. 129: 13-22.
非專利文獻(xiàn)22: Ishida， Y" Saito， H" Hiei, Y., Komari, T. (2003) Improved protocol for transformation of maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens. Plant Biotechnology 20: 57-66.
非專利文獻(xiàn)23: Duncan, D.R., Williams, M.E., Zehr， B.E.， Widholm, J.M. (:1985) The production of callus capable of plant regeneration from immature embryos of numerous Zea mays genotypes. Planta 165: 322-332.
非專利文獻(xiàn)24: Zhang, W., Subbarao， S.， Addae, P., Shen, A., Armstrong, C., Peschke, V.， Gilbertson, L. (2003) Cre/lox-mediated marker gene excision in transgenic maize (Zea mays L.) plants. Theor. Appl. Genet. 107:1157-1168.
非專利文獻(xiàn) 25 : Huang, X. and Wei, Z. (2005) Successful Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize elite inbred lines. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 83: 187-200.
非專利文獻(xiàn)26: Frame, B.R., McMurray， J.M.， Fonger， T.M., Main, M丄.，Taylor, K.W.， Tomey, F丄，Paz, M.M., Wang, K. (2006) Improved Agrobacterium-mediated transformation of three maize inbred lines using MS salts. Plant Cell Rep. 25: 1024-1034.
非專利文獻(xiàn)27: Komari, T., Hiei, Y" Saito, Y.， Murai, N,, Kumashiro, T. (1996) Vectors carrying two separate T-DNAs for co-transformation of higher plants mediated by Agrobacterium tumefaciens and segregation of transformants free from selection markers. The Plant Journal 10: 165-174.
非專利文獻(xiàn)28: Komari, T.， Saito， Y.， Nakakido, F., Kumashiro， T. (1989) Efficient selection of somatic hybrids in Nicotiana tabacum L. using a combination of drug-resistance merkers introduced by transformation. Theor. Appl. Genet. 77: 547-552.
非專利文獻(xiàn)29: Sambrook, J., Fritsch, E.F.， Maniatis， T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed.， Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
非專利文獻(xiàn)30: Linsmaier， E., Skoog， F. (1965) Organic growth factor requirements of tobacco tissue culture. Physiol. Plant. 18: 100-127.
非專利文獻(xiàn)31: Chu, C.-C. (1978) The N6 medium and its applications to anther culture of cereal crops. In:Proc. Symp. Plant Tissue Culture. Peking: Science Press, pp 43-50.
非專利文獻(xiàn)32: Watson， B.， Currier, T.C., Gordon, M. P.， Chilton, M.-D. and Nester, E. W.(1975) Plasmid required for virulence of Agrobacterium tumefaciens. J Bacteriol， 123， 255-264.

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的問題
本發(fā)明的目的是提供一種與傳統(tǒng)公知的土壤桿菌法相比、提高植物 轉(zhuǎn)化效率的方法。 解決問題的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明人等為解決上述問題進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過采用包 含用含3,6-二氯-2-曱氧基苯曱酸(麥草畏)的共存培養(yǎng)基培養(yǎng)接種了土壤桿 菌的植物組織的共存步驟的轉(zhuǎn)化方法，與使用2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)的傳統(tǒng)方法相比，植物的轉(zhuǎn)化效率提高，從而想到了本發(fā)明。本發(fā)明優(yōu)選 以以下描述的方式實施，但不限于此。
本發(fā)明提供一種提高植物轉(zhuǎn)化效率的方法，該方法包括用含3,6-二氯-2-
曱氧基苯曱酸的共存培養(yǎng)基培養(yǎng)接種了 土壤桿菌的植物組織的共存步驟。
在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，共存培養(yǎng)基中不含有除3,6-二氯-2-曱氧基苯 曱酸以外的生長素類。
此外，在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，共存培養(yǎng)基中的3,6-二氯-2-曱氧基苯 曱酸的濃度為0.5-3.0mg/l。
此外，在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，與僅使用2，4-二氯苯氧基乙酸作為共存 培養(yǎng)基中的生長素類的情況相比較，植物的轉(zhuǎn)化效率提高1.3倍以上、更優(yōu) 選2.4倍以上。
此外，在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，接種土壤桿菌的植物組織來源于單子 葉植物的組織；在更優(yōu)選的方式中，接種土壤桿菌的植物為玉米、小麥或 大麥。接種土壤桿菌的單子葉植物的組織為未成熟胚、愈傷組織、花芽或 完熟種子的發(fā)芽部位，最優(yōu)選為未成熟胚(未熟胚)。
而且，在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，植物組織經(jīng)過熱處理和/或離心處理。 此外，在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，共存培養(yǎng)基還包含硝酸銀和/或硫酸銅。 在本發(fā)明的其它方式中，本發(fā)明提供一種轉(zhuǎn)化植物的制備方法，該制 備方法包含以下步驟
(i) 用含3,6-二氯-2-曱氧基苯曱酸的共存培養(yǎng)基培養(yǎng)接種了 土壤桿菌的 植物組織的共存步驟；
(ii) 用含生長素的培養(yǎng)基培養(yǎng)(i)中所得的組織、并對轉(zhuǎn)化體進(jìn)行藥物選 擇的選擇步驟；和，
(iii) 用含選擇藥物的再分化培養(yǎng)基培養(yǎng)(ii)中選擇出的組織、使之再分 化的再分化步驟。
以下具體說明本發(fā)明的構(gòu)成。
本發(fā)明提供一種提高植物轉(zhuǎn)化效率的方法，其包括共存步驟——用含 3，6-二氯-2-曱氧基苯曱酸的共存培養(yǎng)基培養(yǎng)接種了土壤桿菌的植物組織。
使用土壤桿菌進(jìn)行的植物組織轉(zhuǎn)化通常按以下步驟進(jìn)行 即，(i)接種 步驟將土壤桿菌接種到植物組織、(ii)共存步驟用含2,4-二氯笨氧基乙 酸(2，4-D)的共存培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)、(iii)選擇步驟用含2,4-D和選擇藥物的選擇培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)、和(iv)再分化步驟用含選擇藥物的再分化培養(yǎng)基
進(jìn)行培養(yǎng)。
在如上述的傳統(tǒng)轉(zhuǎn)化方法中，許多情況下在共存步驟中使用2,4-D作為 生長素類，基本上沒有用其它生長素類替代2,4-D、或與2,4-D同時在共存 培養(yǎng)基中使用的情況。而且,在本說明書中，"生長素"和"生長素類"包括本 技術(shù)領(lǐng)域公知的天然來源的生長素和人工合成的生長素，包括例如2,4-D、 麥草畏、4-氨基-3,5,6-三氯2-吡啶曱酸(毒莠定，picloram)、 2,3，5-三碘苯曱 酸(TIBA)、 2,4,5-三氯苯氧基乙酸(2,4,5-T)、吲哚乙酸(AA)、吲哚丁酸(IBA) 和萘乙酸(NAA)等。
在本發(fā)明中，以在共存培養(yǎng)基中含有3,6-二氯-2-曱氧基苯曱酸(麥草畏) 為特征之一，通過這樣來提高植物的轉(zhuǎn)化效率。在本發(fā)明的更優(yōu)選方式中， 共存培養(yǎng)基中不含3,6-二氯-2-甲氧基苯曱酸(麥草畏)以外的生長素類。
植物是否被轉(zhuǎn)化，可以采用公知的各種方法來確定。例如通過使轉(zhuǎn)化 的基因為GUS(P-葡糖醛酸糖苷酶)基因、螢光素基因或者GFP基因等報告 基因，采用簡便公知的方法目測觀察這些報告基因的表達(dá)部位，可以確認(rèn) 有無轉(zhuǎn)化。此外，可以利用抗生素抗性基因、除草劑抗性基因等選擇標(biāo)記 基因的表達(dá)，通過用含抗生素或者除草劑的培養(yǎng)基培養(yǎng)植物細(xì)胞、或者用 抗生素溶液、除草劑溶液處理植物，以其抗性的表達(dá)為指標(biāo)，來確認(rèn)有無 轉(zhuǎn)化。
為了更切實地確定是否發(fā)生了轉(zhuǎn)化，例如可以這樣進(jìn)行采用Southren 雜交法確認(rèn)導(dǎo)入基因整合到植物染色體上、以及確認(rèn)導(dǎo)入基因在子代植物 中的表達(dá)(遺傳給子代)等。Southren雜交法可以按公知方法進(jìn)行，例如按分 子克隆(Molecular Cloning)(非專利文獻(xiàn)29)中記載的方法進(jìn)行。此外，子代 植物中表達(dá)的確認(rèn)，可以通過考察GUS基因等報告基因的表達(dá)、除草劑耐 性基因等選擇標(biāo)記基因的表達(dá)的方法來施行。具體而言，可以按非專利文 獻(xiàn)ll記載的方法進(jìn)行，但不限于此。
轉(zhuǎn)化效率可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員 一般使用的計算方法來確定。例如， 可以通過用轉(zhuǎn)化了的植物數(shù)除以接種了土i裏桿菌的外植體(explant)數(shù)而 算出的值來求出。
在本發(fā)明中，"植物的轉(zhuǎn)化效率提高"是指與如上述的共存培養(yǎng)基中僅 包含2，4-D作為生長素的傳統(tǒng)的利用土壤桿菌的轉(zhuǎn)化方法相比較，轉(zhuǎn)化效率有所提高。使用本發(fā)明的方法，則與使用2，4-D的方法相比，轉(zhuǎn)化效率在實 施例1中提高至1.3倍，在實施例2中提高至2.4倍。因此，根據(jù)本發(fā)明， 轉(zhuǎn)化效率優(yōu)選提高至1.3倍以上、更優(yōu)選2.0倍以上、更優(yōu)選2.4倍以上。 以下，對本發(fā)明的提高植物轉(zhuǎn)化效率的方法的各步驟進(jìn)行說明。
(n土壤桿菌的接種步驟
本發(fā)明中使用的植物組織接種土壤桿菌。本說明書中使用的"接種"是 指使土壤桿菌與植物組織接觸，本技術(shù)領(lǐng)域中各種接種土壤桿菌的方法 是公知的。作為本方法，可以列舉出例如在將土壤桿菌懸浮在液體培養(yǎng) 基中而得到的懸濁液中加入植物組織的方法、將土壤桿菌的懸濁液直接滴 加到共存培養(yǎng)基上的植物組織上的方法、向植物組織中注入土壤桿菌懸濁 液的方法、和將植物組織浸漬在土Jt裏桿菌懸濁液中并減壓的方法等。然而， 本發(fā)明中使用的接種了 土壤桿菌的植物組織并不限于采用這些方法接種了 土壤桿菌的植物組織。
在該土壤桿菌的接種步驟中，為了改善利用土壤桿菌的轉(zhuǎn)化效率，可 以使土壤桿菌的懸濁液中包含例如乙酰丁香酮(acetosyringone )、表面活 性劑、多孔性陶資等各種添加劑。
本發(fā)明中可使用的土壤桿菌可以是公知的任何土壤桿菌。在本發(fā)明的 優(yōu)選方式中，土壤桿菌為例如LBA4404、 EHA101和AGL1、 C58C1等，但 不限于此。當(dāng)在載體方面不使用超級二元載體(非專利文獻(xiàn)IO和ll)時，從 轉(zhuǎn)化效率的觀點(diǎn)來看，優(yōu)選使用含有土壤桿菌A281(非專利文獻(xiàn)31)所具有 的Ti質(zhì)粒pTiBo542的菌抹。
公知土壤桿菌具有將插入在土壤桿菌內(nèi)的質(zhì)粒T-DNA中的基因?qū)氲?植物的基因組中的性質(zhì)。因此，可在本發(fā)明中使用的土壤桿菌具有將希望 表達(dá)的基因插入到T-DNA中而得到的質(zhì)粒。于是，通過將具有該質(zhì)粒的土 壤桿菌接種到植物組織，可以轉(zhuǎn)化植物。這樣，可以賦予組織中的植物細(xì) 胞以優(yōu)選的形狀?？稍诒景l(fā)明中使用的土壤桿菌用質(zhì)粒例如有pSB131、 U0009B、 U0017S、 pSB134、 pNB131和pIG121Hm等，但不限于此。在不 使用含Ti質(zhì)粒pT舊o542的菌林作為土壤桿菌抹的情況下，從轉(zhuǎn)化效率的觀 點(diǎn)來看，優(yōu)選使用超級二元載體(非專利文獻(xiàn)10和11)。
可在本發(fā)明中使用的植物組織所來源的植物可以是單子葉植物和雙子 葉植物，優(yōu)選為單子葉植物，更優(yōu)選為玉米、小麥、大麥，最優(yōu)選為玉米。此外，可在本發(fā)明中使用的植物組織可以是例如植物的細(xì)胞、葉、根、莖、 果實、未成熟胚、愈傷組織、花芽、完熟種子的發(fā)芽部位、其它部位的植 物組織，優(yōu)選為未成熟胚、花芽和完熟種子的發(fā)芽部位，最優(yōu)選為未成熟 胚。在本說明書中，未成熟胚是指處于受粉后的成熟過程中的未熟種子
以是在受粉后的任何時期采集的未成熟胚。優(yōu)選受粉7 14天后的未成熟胚。
為了提高轉(zhuǎn)化效率，如上述的植物組織還可以經(jīng)過各種處理。作為這
樣的處理，可以列舉出例如—熱處理(專利文獻(xiàn)1)、離心處理(專利文獻(xiàn) 2)、熱和離心處理(專利文獻(xiàn)4)以及加壓處理(專利文獻(xiàn)5)等。 (2)共存步驟
本步驟中，通過在土壤桿菌的共存下用含生長素類的培養(yǎng)基培養(yǎng)如上 述地接種了 土壤桿菌的植物細(xì)胞，來將DNA從土壤桿菌確實地導(dǎo)入植物細(xì) 胞。本步驟中使用的培養(yǎng)基在本說明書中稱為"共存培養(yǎng)基"。共存培養(yǎng)基可 以是植物細(xì)胞培養(yǎng)中通常使用的培養(yǎng)基例如以LS無機(jī)鹽類(非專利文獻(xiàn) 30)、 N6無機(jī)鹽類(非專利文獻(xiàn)31)為基本成分的培養(yǎng)基，具體地可以列舉出 LS-AS培養(yǎng)基等。
根據(jù)傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)化法，在共存培養(yǎng)基中添加2,4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D) 作為生長素類。在本發(fā)明中，共存培養(yǎng)基中包含3,6-二氯-2-曱氧基苯曱酸(麥 草畏)是其特征之一。本發(fā)明的優(yōu)選方式中，共存培養(yǎng)基中不含麥草畏以外 的生長素類。
共存培養(yǎng)基中麥草畏的量，可以與傳統(tǒng)方法中2，4-D的量相同，優(yōu)選為 0.5-3.0mg/l、更優(yōu)選為0.5-2.5mg/l、更優(yōu)逸為1.0-2.0mg/l、最優(yōu)選為1.5mg/l。
為了提高轉(zhuǎn)化效率，在共存培養(yǎng)基中，除了麥草畏以外，還可以加入 各種添加劑。這樣的添加劑有例如硝酸銀(專利文獻(xiàn)3)、硫酸銅(非專利文獻(xiàn) 6)和半胱氨酸(非專利文獻(xiàn)21 )等。
在本步驟中，共存培養(yǎng)基中可以僅含有麥草畏作為生長素類，或者也 可以含有麥草畏及其它生長素類。生長素類一般具有使植物組織脫分化的 作用，因此，在本步驟和接下來的選擇步驟中，所有植物組織的一部分或 全部成為脫分化組織(愈傷組織)。本說明書中使用的術(shù)語"脫分化 (dedifferentiation)組織"或"愈傷組織，，是指通過用含生長素、細(xì)胞分裂 素等植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的培養(yǎng)基培養(yǎng)經(jīng)分化的植物組織的一部分(外植體)而得到的組織，該組織是無定形的未分化狀態(tài)的細(xì)胞塊，其不具有作為原 來的植物組織的形態(tài)。因此，脫分化組織關(guān)系到的所有方式均在本發(fā)明的 范圍內(nèi)，包括以脫分化組織的狀態(tài)開始共存步驟的情況，以及分化的植物 組織在共存步驟中或以下的選擇步驟中全部脫分化和部分脫分化的情況，等等。
本步驟中"培養(yǎng)，，是指使植物組織著床(置床)于固體化的共存培養(yǎng)基上
或液體共存培養(yǎng)基中，使之在合適的溫度、明暗條件和時間(期間)內(nèi)生長繁 育。共存培養(yǎng)基的固體化可以通過添加本技術(shù)領(lǐng)域公知的固體化劑來進(jìn)行， 作為這樣的固體化劑，已知有例如瓊脂糖等。本步驟中的培養(yǎng)溫度可以適 宜地選擇，優(yōu)選在20。C-35。C、更優(yōu)選25。C進(jìn)行。此外，本步驟的培養(yǎng)優(yōu)選 在暗處進(jìn)行，但不限于此。本步驟的培養(yǎng)時間也可以適宜選擇，優(yōu)選為1 天-10天、更優(yōu)選為7天。 (3)選擇步驟
本發(fā)明以以上描述的共存步驟為特征。以下描述的選擇步驟和再分化 步驟為在利用土壤桿菌的植物轉(zhuǎn)化方法中通常采用的方法。因此，以下的 描述僅用于示例，本發(fā)明不受以下的描述的限定。
本步驟中，用含生長素類的培養(yǎng)基培養(yǎng)通過上述步驟得到的組織，通 過有無基因?qū)雭磉x擇轉(zhuǎn)化體。本步驟中使用的培養(yǎng)基在本說明書中稱做 "選擇培養(yǎng)基"?？勺鳛檫x擇培養(yǎng)基使用的培養(yǎng)基可以列舉出例如以LS無
機(jī)鹽類(非專利文獻(xiàn)30)、N6無機(jī)鹽類(非專利文獻(xiàn)31)為基本成分的培養(yǎng)基， 具體地有例如LSD1.5培養(yǎng)基等。按常規(guī)方法，選擇培養(yǎng)基中添加生長素類， 優(yōu)選2,4-D。在本發(fā)明中，對于本選擇步驟中使用的生長素類沒有特殊限定， 優(yōu)選為2,4-D。而且，視需要可以加入各種添加物。
轉(zhuǎn)化植物的選擇，可以通過例如用含適當(dāng)選擇藥物的選擇培養(yǎng)基培養(yǎng) 經(jīng)過上述共存步驟的植物，根據(jù)有無對選擇藥物的抗性來進(jìn)行?？稍诒静?驟中使用的選擇藥物，可以使用本技術(shù)領(lǐng)域通常使用的選擇藥物。例如， 作為選擇藥物，可以使用抗生素和/或除草劑。作為抗生素，可以使用例如 潮霉素(Hyg腿ycin)、卡那霉素或滅瘟素S(blastcidin S)等。而且，作為 除草劑，可以使用例如草胺膦(7才77^/7，^0:/, phosphinothricin )、 雙丙氨膦(bialaphos)或草甘膦(glyphosate )等。
為了進(jìn)行本選擇步驟，插入土壤桿菌中的T-DNA中的DNA，不僅要包
14含希望在植物中表達(dá)的基因，還必須包含例如對選擇藥物的抗性基因等。這樣的對選擇藥物的抗性基因在本技術(shù)領(lǐng)域是公知的。在本步驟中，例如在含潮霉素的選擇培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇的情況下，植物中必須由土壤桿菌導(dǎo)入潮霉素耐性基因。
或者，轉(zhuǎn)化植物的選擇可以基于植物細(xì)胞的糖營養(yǎng)缺陷性(糖要求性)來進(jìn)行。已知植物細(xì)胞能夠利用的糖有蔗糖、葡萄糖等，但不能利用甘露糖。因此，用僅含甘露糖作為碳源的培養(yǎng)基培養(yǎng)植物組織時，由于沒有可利用的糖，植物組織會枯死?；谔菭I養(yǎng)缺陷性的選擇正是利用了這一原
理。即，為了利用該選擇方法，插入土壤桿菌中的T-DNA中的DNA除了希望在植物中表達(dá)的基因外，還必須包含磷酸甘露糖異構(gòu)酶(phosphomannose isomerase: PMI)基因。此處，導(dǎo)入了 PMI基因的植物細(xì)胞能夠利用甘露糖作為碳源。因此，僅有用如上述的土壤桿菌轉(zhuǎn)化了的植物組織能夠在僅以甘露糖為碳源的培養(yǎng)基上生長繁育，這樣就能夠僅選擇出轉(zhuǎn)化植物組織(非專利文獻(xiàn)16)。這樣的方法也可以針對其它糖進(jìn)行。例如，導(dǎo)入了木糖異構(gòu)酶基因的植物細(xì)胞能夠利用木糖作為碳源，因此適用于這種方法。
因此，在基于糖營養(yǎng)缺陷性進(jìn)行轉(zhuǎn)化植物的選擇時，植物組織應(yīng)從土壤桿菌導(dǎo)入使得能夠利用通常植物細(xì)胞不能利用的糖類的基因。這樣的基因在本技術(shù)領(lǐng)域是公知的，可以使用例如PMI基因、木糖異構(gòu)酶基因等。此外，在選擇培養(yǎng)基中，需要排除植物細(xì)胞通常能夠使用的、培養(yǎng)基中通常包含的蔗糖和葡萄糖等，取而代之僅含通常的植物細(xì)胞不能利用的糖類作為碳源。此處，"通常的植物細(xì)胞不能利用的糖類，，是指因野生型植物細(xì)胞中不存在編碼代謝酶的基因而不能作為營養(yǎng)源的糖類，包括例如甘露糖、木糖等。
此外，可以導(dǎo)入容易檢測的基因作為篩選的指標(biāo)，通過有無該基因的表達(dá)來進(jìn)行選擇。作為這種作為篩選的指標(biāo)的基因，可以列舉出GFP基因等。檢測表達(dá)這些基因的細(xì)胞、組織的方法是本技術(shù)領(lǐng)域公知的?？梢员O(jiān)測表達(dá)如上述的基因的部位，通過切分表達(dá)部位等來進(jìn)行選擇。
本步驟可以變更培養(yǎng)基的成分組成，反復(fù)進(jìn)行多輪。例如、在多輪選擇步驟中，通過在各輪選擇步驟中提高選擇藥物的濃度，可以增強(qiáng)藥物選擇的切實可行性，提高獲得轉(zhuǎn)化了的植物體的可能性。本選擇步驟優(yōu)選進(jìn)行至少2輪、更優(yōu)選進(jìn)行3輪。此外，在進(jìn)行多輪選擇步驟的情況下，通
過切割取下用含選擇藥物的培養(yǎng)基培養(yǎng)的組織中的增殖部分，僅將該增殖部分用于下一輪選擇步驟，可以高效地獲得轉(zhuǎn)化組織。
本步驟中"培養(yǎng)，，是指使植物組織著床于固體化的選擇培養(yǎng)基上或液體選擇培養(yǎng)基中，使之在合適的溫度、明暗條件和時間(期間)內(nèi)生長繁育。選擇培養(yǎng)基的固體化可以利用諸如上述的瓊脂糖等進(jìn)行。本步驟中的培養(yǎng)溫度可以適宜地選擇，優(yōu)選在20°C-35°C、更優(yōu)選在25。C進(jìn)行。此外，本步驟的培養(yǎng)優(yōu)選在暗處進(jìn)行，但不限于此。本步驟的培養(yǎng)時間也可以適±選擇，例如，在進(jìn)行3輪選擇步驟的情況下，可以第1輪選擇進(jìn)行2周、第2輪選擇進(jìn)行3周、第3輪選擇進(jìn)行3周，共計8周。此外，多輪選擇步驟整體優(yōu)選進(jìn)行6-10周、更優(yōu)選7-9周。此外，在進(jìn)行多輪的選擇的情況下，可以變更每輪的培養(yǎng)時間、溫度和明暗條件。
(4)再分化歩驟
本步驟中，用培養(yǎng)基培養(yǎng)上述選擇步驟中選擇出的組織，從而使之再分化。本步驟中使用的培養(yǎng)基在本說明書中中稱做"再分化培養(yǎng)基"。再分化培養(yǎng)基不含生長素類?？梢宰鳛樵俜只囵B(yǎng)基使用的培養(yǎng)基可以列舉出例如以LS無機(jī)鹽類、N6無機(jī)鹽類為基本成分的培養(yǎng)基，具體例如有LSZ培
養(yǎng)基等。
本步驟中， 一般地，再分化培養(yǎng)基含有選擇藥物?？梢栽诒静襟E中使用的選擇藥物的定義與選擇步驟中的相同。然而，在本步驟中，并非一定要使用與選擇步驟中使用過的選擇藥物相同的選擇藥物。在這種情況下，必須從土壤桿菌向植物中導(dǎo)入2種以上的對選擇藥物的抗性基因。
本發(fā)明中"再分化"是指全部或部分脫分化的植物組織重新獲得原植物組織或植物體的性質(zhì)。在本發(fā)明中，通過共存步驟和選擇步驟中的生長素類的作用，所有接種了 土壤桿菌的植物組織的全部或一部分出現(xiàn)了脫分化。因此，通過進(jìn)行本步驟，脫分化組織發(fā)生再分化，可以獲得完整的轉(zhuǎn)化植物體。
本步驟中"培養(yǎng)，，是指使植物組織著床于固體化的再分化培養(yǎng)基上或液體再分化培養(yǎng)基中，使之在合適的溫度、明暗條件和時間(期間)內(nèi)生長繁育。再分化培養(yǎng)基的固體化可以利用諸如上述的瓊脂糖等進(jìn)行。本步驟中的培養(yǎng)溫度可以適宜地選4奪，優(yōu)選在20°C-35°C、更優(yōu)選25。C進(jìn)行。此外，本步驟的培養(yǎng)優(yōu)選在16-24小時/天的照明下進(jìn)行，但不限于此。本步驟的培養(yǎng) 時間也可以適宜選擇，優(yōu)選7天-21天，更優(yōu)選14天。
在進(jìn)行本步驟之后，可以通過本技術(shù)領(lǐng)域公知的方法容易地得到完整 的轉(zhuǎn)化植物體。因此，本發(fā)明還提供包含以下步驟的轉(zhuǎn)化植物的制備方法
(i) 用含3，6-二氯-2-曱氧基笨曱酸的共存培養(yǎng)基培養(yǎng)接種了土壤桿菌的 植物組織的共存步驟；
(ii) 用含生長素的培養(yǎng)基培養(yǎng)(i)中所得的組織、并用藥物選擇轉(zhuǎn)化體的
選擇步驟；和
(iii) 用含選擇藥物的再分化培養(yǎng)基培養(yǎng)(ii)中選擇出的組織，使之再分 化的再分化步驟。
發(fā)明的效果
根據(jù)本發(fā)明，可以提高植物的轉(zhuǎn)化效率。這樣，可以高效率地獲得轉(zhuǎn) 化了的植物體，可以降低獲得該植物體的成本。


圖1為圖表，顯示了共存培養(yǎng)基中生長素的種類對玉米轉(zhuǎn)化效率的影 響。各區(qū)提供33-35個未成熟胚。縱軸表示轉(zhuǎn)化效率(各區(qū)中，所得的GUS 陽性植物數(shù)/接種未成熟胚數(shù))，橫軸表示共存培養(yǎng)培養(yǎng)基中所含的生長素的 種類。共存培養(yǎng)基中的生長素濃度均為1.5mg/l。
圖2顯示了土壤桿菌菌林LBA4404(U0009B)所攜帶的質(zhì)粒U0009B的 結(jié)構(gòu)。
質(zhì)粒名U0009B.prj 質(zhì)粒大小12347bp
圖3為圖表，顯示了共存培養(yǎng)基中的生長素種類對采用滴下接種法時 的玉米轉(zhuǎn)化效率的影響。各區(qū)提供25-26個未成熟胚?？v軸表示轉(zhuǎn)化效率(各 區(qū)中，所得的GUS陽性植物數(shù)/接種未成熟胚數(shù))，橫軸表示共存培養(yǎng)培養(yǎng) 基中生長素的種類。共存培養(yǎng)基中的生長素的濃度均為1.5mg/l。 實施例
以下，通過實施例說明本發(fā)明，但實施例僅為舉例，并不是對本發(fā)明 的限制。本發(fā)明的范圍應(yīng)以權(quán)利要求書的描述為準(zhǔn)。而且，本領(lǐng)域技術(shù)人 員基于本說明書的描述，可以容易地進(jìn)行修正、變更。實施例1
添加各種生長素的共存培養(yǎng)基對轉(zhuǎn)化效率的效果 材料和方法
無菌條件下采集受粉后第7-14天的玉米(品種A188)的未成熟胚(大小 1.0-1.5 mm),用LS-inf液體培養(yǎng)基(非專利文獻(xiàn)ll)清洗1次。為了提高基因 導(dǎo)入效率進(jìn)行了前處理(46。C、 3分鐘的熱處理和15,000 rpm、 IO分鐘的離 心處理)。在含100pM乙酰丁香酮的LS-inf液體培養(yǎng)基中以約1.0xl09cfu/ml 懸浮土壤桿菌菌抹LBA4404(pSB131)(非專利文獻(xiàn)ll)作為接種源。向經(jīng)過 了熱和離心處理的未成熟胚中加入接種源，攪拌30秒鐘后，室溫靜置5分 鐘。將接種土壤桿菌后的未成熟胚以胚盤向上的方式分別著床于下述共存 培養(yǎng)基，所述共存培養(yǎng)基是在含5pM AgN03和5|_tM CuS04的LS-AS培養(yǎng) 基(非專利文獻(xiàn)11、固體化劑為8g/l瓊脂糖)分別添加濃度為1.5mg/l的2,4-D、 2,4,5-T(2,4，5-三氯苯氧基乙酸)、毒莠定(Picloram, 4-氨基-3,5,6-三氯2-吡啶 曱酸)、TIBA(2,3,5-三碘苯曱酸)、麥草畏而得到的。對照培養(yǎng)基為含5pM AgN03和5|iM CuS04的LS-AS培養(yǎng)基(固體化劑為8g/l瓊脂糖)。
將25°C 、黑暗條件下培養(yǎng)7天而得到的未成熟胚著床于含5jiM AgN03、 5mg/l草胺膦(PPT)、 250mg/l羧千西林、100mg/l頭孢謹(jǐn)將(cefotaxime) 的LSDL5培養(yǎng)基(非專利文獻(xiàn)11)， 25°C、黑暗條件下培養(yǎng)10天。將未成 熟胚移植到PPT濃度為10mg/l的相同培養(yǎng)基上，相同條件下培養(yǎng)3周。用 手術(shù)刀切取觀察到增殖的愈傷組織，著床于相同組成的培養(yǎng)基上，相同條 件下培養(yǎng)3周。切取增殖的愈傷組織，著床于含10|aM CuS04、 5mg/l PPT 的LSZ培養(yǎng)基(非專利文獻(xiàn)11)， 25°C、照明下培養(yǎng)約2周。考察觀察到植 物體再分化的未成熟胚的個數(shù)，并且切取再分化出的植物的葉的 一部分， 浸漬在含0.1%的Triton X-100的O.lM磷酸緩沖液(pH 6.8)中，37。C靜置1 小時。除去磷酸緩沖液后，添加了含1.0mM5-溴-4-氯-3-吲哚基-!3-D-葡糖醛 酸(X-gluc)和20。/。曱醇的磷酸緩沖液。37。C處理24小時后，考察了GUS基 因的表達(dá)。
結(jié)果
從用以2,4-D為生長素的對照共存培養(yǎng)基培養(yǎng)的未成熟胚中，以20.6% 的效率獲得了轉(zhuǎn)化植物。與此相對，用添加麥草畏作為生長素的共存培養(yǎng) 基培養(yǎng)的未成熟胚的轉(zhuǎn)化效率高達(dá)27.3%,可知通過以麥草畏為共存培養(yǎng)基的生長素，轉(zhuǎn)化效率得以提高。因此，可知通過使共存培養(yǎng)基中含有
麥草畏做為生長素，與使用2，4-D的傳統(tǒng)方法相比，轉(zhuǎn)化效率提高 27.3/20.6=1.33倍。另一方面，以2,4，5-T和毒莠定為生長素的培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)化 效率比對照差。從用添加TIBA的培養(yǎng)基共存培養(yǎng)的未成熟胚中，沒有得到 轉(zhuǎn)化植物(圖1)。 實施例2
共存培養(yǎng)基中的麥草畏和2，4-D對滴下接種法的轉(zhuǎn)化效率的影響 材沖+和方法
在以pSBll(非專利文獻(xiàn)27)為基本骨架的載體中增加必要的元件，構(gòu)建 了圖2、 SEQIDNO: 1的載體U0009B。在同樣采用實施例1的方法制備的 土壤桿菌菌抹LBA4404(U0009B)的接種源lml中添加約80mg的羥基磷灰 石(Bio-Rad)。為了提高基因?qū)胄蕦ξ闯墒炫?品種A188)進(jìn)行了前處理 (46°C、 3分鐘的熱處理和15，000rpm、 IO分鐘的離心處理)，將所得未成熟 胚以胚盤向上的方式著床于下述共存培養(yǎng)基，所述共存培養(yǎng)基是在含5|iM AgN03和5|aM CuS04的LS-AS培養(yǎng)基(非專利文獻(xiàn)11、固體化劑為8g/1瓊 脂糖)中分別添加1.5mg/l濃度的2,4-D或麥草畏而得到的。對照培養(yǎng)基為含 5nMAgN03和5laMCuS04的LS-AS培養(yǎng)基(固化劑為8g/1瓊脂糖)。用旋渦 混合器(Vortex Mixer)進(jìn)行攪拌，使得接種源中的羥基磷灰石均勻分散， 然后將5pi1的接種源滴加到未成熟胚上。滴下的接種源干燥后，將未成熟胚 移動到同一培養(yǎng)基上的其它位置。將培養(yǎng)器密封后，25°C、黑暗條件下進(jìn) 行7天的共存培養(yǎng)。采用以實施例1相同的方法培養(yǎng)共存培養(yǎng)后的未成熟 胚，獲得再分化植物，并且用再分化植物的葉考察了 GUS基因的表達(dá)。
結(jié)果
從用以2,4-D為生長素的對照共存培養(yǎng)基培養(yǎng)的未成熟胚中，以11.5% 的效率獲得了轉(zhuǎn)化植物。與此相對，用添加麥草畏作為生長素的共存培養(yǎng) 基培養(yǎng)的未成熟胚的轉(zhuǎn)化效率高達(dá)28.0%,可知通過以麥草畏為共存培養(yǎng) 基的生長素，在采用滴下接種法的轉(zhuǎn)化中，效率有所提高(圖3)。在采用滴 下接種法的轉(zhuǎn)化中，效率有所提高(圖3)。根據(jù)本方法，通過在共存培養(yǎng)基 中添加麥草畏，與使用2,4-D的傳統(tǒng)方法相比，轉(zhuǎn)化效率提高28.0/11.5=2.43 倍。
實施例3Southren分析
材料和方法
從實施例1中得到的顯示GUS基因表達(dá)的轉(zhuǎn)化植物的葉，按小鞠等的 方法(非專利文獻(xiàn)28)抽提了 DNA。將抽提出的DNA用制限酶BamHI處理， 采用以GUS基因為探針的Southren法進(jìn)行了導(dǎo)入基因的檢測。Southren法 按分子克隆(非專利文獻(xiàn)29)中描述的方法進(jìn)行。
結(jié)果
任何轉(zhuǎn)化體均顯示與GUS探針雜交的條帶。其模式(pattem)因轉(zhuǎn)化體而 異，這顯示導(dǎo)入基因隨機(jī)地插入到植物的染色體上。顯示GUS陽性的個 體的條帶數(shù)為l-3條，可知插入的導(dǎo)入基因的拷貝數(shù)都很少(表1)。
表l轉(zhuǎn)化當(dāng)代植物(TO)中的GUS基因的拷貝數(shù)
GUS基因的拷貝數(shù)123
T0植物個體數(shù)112權(quán)利要求
1一種提高植物轉(zhuǎn)化效率的方法，該方法包括共存步驟用含3，6-二氯-2-甲氧基苯甲酸的共存培養(yǎng)基培養(yǎng)接種了土壤桿菌的植物組織。
2.權(quán)利要求1的方法，其中，所述共存培養(yǎng)基中不含3，6-二氯-2-曱氧 基苯曱酸以外的生長素類。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中，所述共存培養(yǎng)基中的3,6-二氯-2-曱 氧基苯曱酸的濃度為0.5-3.0mg/l。
4.權(quán)利要求1-3中任一項的方法，其中 作為共存培養(yǎng)基中的生長素類的情況相比 倍。
5.權(quán)利要求1-4中任一項的方法，其中,所述植物組織來源于單子葉植 物的組織。
6.權(quán)利要求1-5中任一項的方法，其中，所述植物組織經(jīng)過了熱處理和 /或離心處理。
7.權(quán)利要求1-6中任一項的方法，其中 ,所述共存培養(yǎng)基還含有硝酸銀和/或硫酸銅。
8. —種轉(zhuǎn)化植物的制備方法，該方法包括以下步驟(i) 共存步驟，用含3,6-二氯-2-曱氧基苯曱酸的共存培養(yǎng)基培養(yǎng)接種了 土壤桿菌的植物組織；(ii) 選擇步驟用含生長素的培養(yǎng)基培養(yǎng)(i)中所得的組織，對轉(zhuǎn)化體進(jìn) 《亍藥物選擇；和(iii) 再分化步驟用含選擇藥物的再分化培養(yǎng)基培養(yǎng)(ii)中選擇出的組 織，使其再分化。，與僅使用2,4-二氯苯氧基乙酸 ，植物的轉(zhuǎn)化效率提高至少1.全文摘要
本發(fā)明的課題是提供一種與傳統(tǒng)公知的土壤桿菌法相比、提高植物轉(zhuǎn)化效率的方法。本發(fā)明的特征之一是包括用含3，6-二氯-2-甲氧基苯甲酸的共存培養(yǎng)基培養(yǎng)接種了土壤桿菌的植物組織的共存步驟。
文檔編號A01H1/00GK101668418SQ20088000656
公開日2010年3月10日 申請日期2008年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月28日
發(fā)明者樋江井佑弘, 石田佑二 申請人:日本煙草產(chǎn)業(yè)株式會社