專利名稱：：一種殺蚊球形芽孢桿菌漂浮劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種生物制劑的制備方法，具體地說，涉及一種殺蚊球形芽孢桿菌(Bacz7/w^/^eWcwj，簡稱Bs)漂浮劑及其制備方法。屬于生物農(nóng)藥中微生物殺蟲劑的生產(chǎn)工藝和制劑化技術(shù)。
背景技術(shù)：
：殺蚊球形芽孢桿菌(5ac///^^/zaen'cz^簡稱Bs)是廣泛存在于自然環(huán)境中的有益微生物，其菌體代謝產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)伴孢體，對紋子的幼蟲孑孓有非常高的殺滅活性。殺蚊球形芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌以色利亞種(即B.t.i)被世界衛(wèi)生組織(WHO)確定為對蚊蟲進(jìn)行生物防治的兩種有益細(xì)菌，國內(nèi)外有數(shù)個B.s菌株被用于工業(yè)化生產(chǎn)和蚨蟲防治，如世界衛(wèi)生組織向全世界推薦的Bs2362菌株和C3-41菌株。大量研究結(jié)果表明，殺紋球形芽孢桿菌所產(chǎn)生的殺蚊活性物質(zhì)對熱非常敏感，長時間處于45'C以上就會失活，由于其熱敏性太強(qiáng)，所以工業(yè)化生產(chǎn)殺蚊球形芽孢桿菌的原粉(或母粉)比較困難。有關(guān)殺蚊球形芽孢桿菌原粉的生產(chǎn)工藝過程未見國外有公開的報(bào)道。國內(nèi)有關(guān)專家為克服這一困難，進(jìn)行過殺蚊球形芽孢桿菌熱保護(hù)劑的篩選，但一直未見有公開的文獻(xiàn)發(fā)表和專利申請。目前國內(nèi)生產(chǎn)殺蚨球形芽孢桿菌的方法有兩種，一種是不生產(chǎn)粉劑，只生產(chǎn)水劑，由此避開熱失活問題；另一種是釆取常規(guī)的噴霧干燥方法，發(fā)酵之后遇過碟片離心機(jī)離心，收集菌漿然后用噴霧干燥塔生產(chǎn)出殺蚨球形芽孢桿菌的原粉。生產(chǎn)水劑的方法雖然簡單，收率也很高，但是產(chǎn)品效價低，體積大，運(yùn)輸不方便，而且產(chǎn)品易腐敗，保質(zhì)期較短。殺蚊球形芽孢桿菌產(chǎn)品有一定的國際巿場，但以水劑出口顯得很不合適。以噴霧干燥法生產(chǎn)原粉的辦法對蘇云金芽孢桿菌產(chǎn)品的生產(chǎn)是成熟可行的，但對殺紋球形芽孢桿菌卻不合適，因?yàn)閲婌F干燥法無論是進(jìn)口溫度還是出口溫度都大大超過本產(chǎn)品的失活溫度。所以釆用噴霧干燥法生產(chǎn)殺蛺球形芽孢桿菌不僅能耗大，成本高，而且效價損失也很大，其損失率達(dá)到50%以上。為了探索一條生產(chǎn)殺蚊球形芽孢桿菌固體產(chǎn)品(或者說干燥產(chǎn)品)的途徑，而且保證生產(chǎn)過程中效價損失率低，能耗小，運(yùn)輸成本低，本發(fā)明人對殺蚨球形芽孢桿菌發(fā)酵后處理生產(chǎn)工藝進(jìn)行了反復(fù)研究，最終完成了本申請。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種殺蚊球形芽孢桿菌(&"7/"s印/iMn'cw)漂浮劑，釆用低溫后處理工藝，保持殺蚊球形芽孢桿菌高活性，并達(dá)到持久的防治效果。本發(fā)明的另一目的是提供一種殺蚊球形芽孢桿菌漂浮劑的制備方法，該方法釆用低溫后處理工藝，避免了菌種在高溫下失活的缺陷，而且保證生產(chǎn)過程中效價損失率低，能耗小，運(yùn)輸成本低，可工業(yè)化生產(chǎn)。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種殺紋球形芽孢桿菌(^z"7/m^/^en'c^)漂浮劑，其由如下步驟制備而成先將滅蚊球形芽孢桿菌發(fā)酵濾液釆用膜濃縮法進(jìn)行濃縮，然后用多孔載體物質(zhì)進(jìn)行吸附，再與緩釋劑混合，并在4050'C干燥成母粒，最后包裹疏水劑。為了將菌體與發(fā)酵液中的水分離，本發(fā)明釆用微孔濾膜進(jìn)行過濾去水。本發(fā)明所述膜濃縮法中所釆用的濾膜為醋酸纖維素酯膜(CA)、無機(jī)陶瓷膜或聚偏二氟乙烯膜(PVDF),經(jīng)比較確認(rèn)無機(jī)陶瓷膜最好，根據(jù)殺蚊球形芽孢桿菌的活性蛋白的分子量大小，確定膜的孔徑為50~謂nm。為實(shí)現(xiàn)低溫干燥，本發(fā)明不按照先生產(chǎn)原粉，后生產(chǎn)制劑的工藝路線，而是直接生產(chǎn)漂浮劑母粒，通過漂浮劑的多孔載體吸收水份，吸附菌體和殺紋活性物質(zhì)，并以此增加物料的通透性，擴(kuò)大有利于水份蒸發(fā)的孔隙度和蒸發(fā)面積。所述的多孔載體物質(zhì)為珍珠巖、玉米芯顆粒、膨化的白炭黑，最優(yōu)選為玉米芯顆粒。玉米芯顆粒材料具有漂浮性好，吸附量大，材料環(huán)保無污染，價格便宜等優(yōu)點(diǎn)。試驗(yàn)了不同粒徑大小的玉米芯顆粒的效果，優(yōu)選結(jié)果表明l2mm粒徑的玉米芯顆粒為最好。對l2mm玉米芯顆粒的用量進(jìn)行試驗(yàn)，當(dāng)菌漿含固量達(dá)到20~25%時，玉米芯用量(W/W)4.550。/。可以達(dá)到低溫干燥的目的，最優(yōu)為7.5~8.5%。本發(fā)明選擇母粒的干燥溫度，從40~50°C，每差1°C設(shè)置一個處理，反復(fù)比較結(jié)果表明42。C至46。C均為可行的選擇，但以45'C為最優(yōu)。濕母粒的干燥機(jī)械以沸騰床最好，鼓風(fēng)式的控溫干燥箱也可選用。為了保證漂浮劑的漂浮時間和緩釋性能，本發(fā)明人對漂浮母粒包裹上緩釋劑。所述緩釋劑選用香豆膠、阿拉伯樹膠、P-環(huán)狀糊精等，優(yōu)選為香豆膠。本發(fā)明試驗(yàn)了不同的香豆膠含量，優(yōu)選結(jié)果香豆膠與菌漿質(zhì)量比為0.0050.009:1，最優(yōu)為0.007:1。香豆膠以40g香豆膠/lL水的比例溶成香豆膠水溶液后進(jìn)行涂布成母粒。玉米芯顆粒吸附菌體和殺蚊活性物質(zhì)之后，在水中漂浮時間會大大縮短，吸附的活性物質(zhì)會很快釋放出來，持效時間僅僅幾天，達(dá)不到通常對滅紋漂浮劑的要求。為此，本發(fā)明用多種疏水劑對漂浮劑母粒進(jìn)行包裹。這些疏水劑包括棕櫚油，石蠟，紫膠等，同時還試驗(yàn)了單層包裹和多層包裹。經(jīng)比較最后選定雙層包裹方案最好，材料為一層石蠟，一層紫膠，先包裹石蠟層，再包裹紫膠層和先包裹紫膠層再包裹石蠟層兩種包裹順序都可行。紫膠包裹時應(yīng)先將紫膠用乙醇溶解，紫膠與溶劑的比例為50ml乙醇/g紫膠。石蠟的包裹條件為5(TC的溫度下加入丙酮，丙酮的用量為3ml丙酮/g石蠟。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的另一目的，本發(fā)明的一種殺蚊球形芽孢桿菌(萬ad〃ww;^am'cws)漂浮劑的制備方法，其包括如下步驟先將滅蚊球形芽孢桿菌發(fā)酵濾液采用膜濃縮法進(jìn)行濃縮，然后用多孔載體物質(zhì)進(jìn)行吸附，再與緩釋劑混合，并在405(TC干燥成母粒，最后包裹疏水劑而成。其中，所述膜濃縮法中所采用的濾膜為醋酸纖維素酯膜(CA)、無機(jī)陶瓷膜和聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，優(yōu)選為無機(jī)陶瓷膜，膜的孔徑為50~畫nm。所述的多孔載體物質(zhì)為珍珠巖、玉米芯顆粒、膨化的白炭黑，最優(yōu)選為玉米芯顆粒，粒徑為l2mm。當(dāng)菌漿含固量達(dá)到2025%時，玉米芯用量(W/W)4.550。/。可以達(dá)到低溫干燥的目的，最優(yōu)為7.5~8.5%。本發(fā)明干燥溫度優(yōu)選為45°C。濕母粒的干燥機(jī)械以沸騰床最好，鼓風(fēng)式的控溫干燥箱也可選用。所述緩釋劑選用香豆膠、阿拉伯樹膠、P-環(huán)狀糊精等，優(yōu)選為香豆膠。本發(fā)明試驗(yàn)了不同的香豆膠含量，優(yōu)選結(jié)果香豆膠與菌漿質(zhì)量比為0.0050.009:1,最優(yōu)為0.007:1。香豆膠以40g香豆膠/lL水的比例溶成香豆膠水溶液后進(jìn)行涂布成母粒。所述疏水劑包括棕櫚油，石蠟，紫膠等，可采用單層包裹和多層包裹。經(jīng)比較最后選定雙層包裹方案最好，材料為一層石蠟，一層紫膠，先包裹石蠟層，再包裹紫膠層和先包裹紫膠層再包裹石蠟層兩種包裹順序都可行。紫膠包裹時應(yīng)先將紫膠用乙醇溶解，紫膠與溶劑的比例為50ml乙醇/g紫膠。石蠟的包裹條件為5(TC的溫度下加入丙酮，丙酮的用量為3ml丙酮/g石蠟。本發(fā)明所述殺紋球形芽孢桿菌母粒低溫生產(chǎn)工藝可生產(chǎn)殺蚊球形芽孢桿菌漂浮劑，活性成份的損失率(即效價損失率)僅10%左右，固形物回收率達(dá)到95%左右。而且該工藝保證生產(chǎn)過程中效價損失率低，能耗小，運(yùn)輸成本低。經(jīng)測定，本發(fā)明漂浮劑一次投藥4mg/L在水中持續(xù)殺滅致乏庫蚊(0//"/加'^"力效果可長達(dá)28天以上(室內(nèi)測定)。圖l為本發(fā)明所述殺蚊球形芽孢桿菌母粒低溫生產(chǎn)工藝及漂浮劑生產(chǎn)工藝路線示意圖。具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1滅蚊球形芽孢桿菌發(fā)酵成功之后加鹽酸調(diào)pH5.0，經(jīng)過三足式離心機(jī)去渣(篩網(wǎng)網(wǎng)眼為60目，離心機(jī)轉(zhuǎn)速為1000rpm)。取75kg發(fā)酵濾液，在功率為45w，膜面積為0.3m2，膜孔徑為100nm的無機(jī)陶瓷膜組件中濃縮，運(yùn)行溫度35'C,運(yùn)行時間6小時25分鐘，經(jīng)濃縮排出清液66.3kg，放出菌漿，并用少許清水沖洗存留在膜及管道內(nèi)中的菌漿，收集菌漿8.6kg，同時用稀鹽酸調(diào)PH值4.8。將此菌漿按重量比7.8%加入粒徑為1-2111111的干燥玉米芯顆粒0.67kg,在槽式混合機(jī)中將二者充分混勻，再將60.2g香豆膠溶于1.4L清水成香豆膠水溶液，將香豆膠水溶液倒入槽式混合機(jī)中，與附著菌漿的載體充分混勻，物料呈豆渣狀。置于45'C鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)干燥，經(jīng)12小時得到干透的母粒2.71kg。對所得干母粒進(jìn)行檢測，其含水量3.16%，效價4582ITU/mg，活性成分收率(效價回收率)為91.02%，固形物回收率96.07。/。。實(shí)施例2滅蚨球形芽孢桿菌發(fā)酵成功之后加鹽酸調(diào)pH5.0,經(jīng)過三足式離心機(jī)去渣(篩網(wǎng)網(wǎng)眼為40目，離心機(jī)轉(zhuǎn)速為1000rpm)。取75kg發(fā)酵濾再將68.8g香豆膠溶于1.4L清水成香豆膠水溶液，將香豆膠水溶液倒入槽式混合機(jī)中，與附著菌漿的載體充分混勻，物料呈豆渣狀。置于45。C鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)干燥，經(jīng)13.5小時得到干透的母粒3.846kg。對所得干母粒進(jìn)行檢測，其含水量3.23%,效價3760ITU/mg，活性成分收率(效價回收率)為89.86%,固形物回收率96.39%。實(shí)施例3滅蚊球形芽孢桿菌發(fā)酵成功之后加鹽酸調(diào)pH5.0，經(jīng)過三足式離心機(jī)去渣(篩網(wǎng)網(wǎng)眼為60目，離心機(jī)轉(zhuǎn)速為1000rpm)。取75kg發(fā)酵濾液，在功率為45w,膜面積為0.3m2,膜孔徑為100nm的無機(jī)陶瓷膜組件中濃縮，運(yùn)行溫度37'C,運(yùn)行時間6小時18分鐘，經(jīng)濃縮排出清夜66.5kg，放出菌漿，并用少許清水沖洗存留在膜及管道內(nèi)中的菌漿，收集菌漿8.6kg，同時用稀鹽酸調(diào)PH值4.8。將此菌漿按重量比9.0%加入粒徑為l-2mm的干燥玉米芯顆粒0.7432kg,在槽式混合機(jī)中將二者充分混勻，再將68.8g香豆膠溶于1.4L清水成香豆膠水溶液，將香豆膠水溶液倒入槽式混合機(jī)中，與附著菌漿的載體充分混勻，物料呈豆渣狀。置于45'C鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)干燥，經(jīng)12小時得到干透的母粒2.83kg。對所得干母粒進(jìn)行檢測，其含水量3.07%,效價4496ITU/mg,活性成分收率(效價回收率)為90.86%，固形物回收率95.98%。實(shí)施例4按照本工藝路線，釆用雙疏水層結(jié)構(gòu)。干母粒紫膠石蠟=3.5:0.02:0.2(質(zhì)量比)。一取實(shí)施例l的干母粒350g倒入槽式混合機(jī)中。二將2g紫膠先溶于100ml乙醇溶液，再將紫膠的乙醇溶液倒入槽式混合機(jī)中充分混勻成a。三在50。C下，將20g石蠟中加入60ml丙酮，倒入槽式混合機(jī)中與a充分混句成b。四將b移至控溫鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)在45°C條件下干燥0.5小時成漂浮劑產(chǎn)品c。對所得c進(jìn)行性能檢測，其含水量3.65%。效價4286ITU/mg。實(shí)施例5按照本工藝路線，釆用雙疏水層結(jié)構(gòu)。干母粒石蠟紫膠=3.5:0.2:0.02(質(zhì)量比)。一取實(shí)施例l的干母粒350g倒入槽式混合機(jī)中。二在50。C下，將20g石蠟中加入60ml丙酮，倒入槽式混合機(jī)充分混勻成al。三將2g紫膠先溶于100ml乙醇溶液，再將紫膠的乙醇溶液倒入槽式混合機(jī)中，與al充分混勻成bl，四將bl移至控溫鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)在45'C條件下干燥0.5小時成漂浮劑產(chǎn)品c1。對所得cl進(jìn)行性能檢測，其含水量3.61%。效價4259ITU/mg。實(shí)驗(yàn)例l按照實(shí)施例4的工藝，將配比換成干母粒石蠟紫膠=3.5:0丄0.01(質(zhì)量比)制備成漂浮劑C2;干母粒石蠟=3,5:0.3(質(zhì)量比)制備漂浮劑C3。將C，C2，C3進(jìn)行殺蚊活性測定，并選用效價為200ITU/mg的水懸劑為對照l，效價為700ITU/mg的粉劑為對照2，清水為對照3。以4L塑料桶為容器，每桶裝入3L過夜自來水。漂浮時間為漂浮率為50%以上的天數(shù)，防效為加入紋幼蟲48小時后的死亡率。結(jié)果統(tǒng)計(jì)如表l-.表l本發(fā)明的BS漂浮劑與BS水懸劑(對照2)持效性比較<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>通過上表可以看出，通過本工藝制備的漂浮劑C在漂浮時間最長，防治效果與其他產(chǎn)品和對照差不多，但持效期明顯長于其他產(chǎn)品和對分別取膜工藝，噴粉工藝，絮凝離心工藝所得產(chǎn)品進(jìn)行效價收率和成本比較。噴粉工藝處理方法將25kg發(fā)酵液經(jīng)過直接噴粉處理，得到0.52kg干粉。膜工藝處理方法將25kg同一批發(fā)酵液經(jīng)過本發(fā)明工藝濃縮，干燥。得到0.81kg干的漂浮劑母粉。本實(shí)驗(yàn)釆用生物測定的方法來檢測結(jié)果，考慮膜濃縮干燥工藝的產(chǎn)品為干燥的菌粉附著于載體上，直接測定會由于緩釋而干擾測定結(jié)果，因此，本試驗(yàn)將膜工藝處理后的產(chǎn)品進(jìn)行濕磨成粉以后進(jìn)行測定。濕磨的目的在于避免磨碎的過程中產(chǎn)生熱量而引起的活性成分損失。絮凝離心濃縮處理方法將lkg與上述發(fā)酵液同一批次的發(fā)酵液中加入3%。的絮凝劑氯化鋁，以3000r/min處理5分鐘。分別收集上清液和沉淀。收集上清液880g，沉淀120g,濃縮倍數(shù)8.33倍。對上述三種方法濃縮生產(chǎn)的試驗(yàn)產(chǎn)品分別測定其濃度倍數(shù)，總活性收得率，比較結(jié)果列于表2中。表2BS發(fā)酵液三種濃縮方法優(yōu)缺點(diǎn)比較濃縮工藝干燥工藝濃縮倍數(shù)總活性收率(%)一次性投資成本運(yùn)行成本污染物直接噴粉12.78高高粉塵和噪音污染絮凝離心鼓風(fēng)干燥8.3367.3低高有含有部分活性成分的濾液產(chǎn)生，COD值18000mg/L膜濃縮鼓風(fēng)干燥8.6291.8中低有幾乎不含活性成分的濾液產(chǎn)生，COD值2500mg/L通過上表可以看出，本發(fā)明工藝在活性收率和運(yùn)行成本上明顯優(yōu)于傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。權(quán)利要求1.一種殺蚊球形芽孢桿菌(Bacillussphaericus)漂浮劑，其特征在于，其由如下步驟制備而成先將滅蚊球形芽孢桿菌發(fā)酵濾液采用膜濃縮法進(jìn)行濃縮，然后用多孔載體物質(zhì)進(jìn)行吸附，再與緩釋劑混合，并在40～50℃干燥成母粒，最后包裹疏水劑。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的殺蚨球形芽孢桿菌漂浮劑，其特征在于，所述膜濃縮法中所釆用的濾膜為醋酸纖維素酯膜、無機(jī)陶瓷膜或聚偏二氟乙烯膜。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的殺紋球形芽孢桿菌漂浮劑，其特征在于，所述濾膜為無機(jī)陶瓷膜。4.根據(jù)權(quán)利要求l-3任意一項(xiàng)所述的殺蚨球形芽孢桿菌漂浮劑，其特征在于，所述的多孔載體物質(zhì)為珍珠巖、玉米芯顆粒、膨化的白炭黑。5.根據(jù)權(quán)利要求l-4任意一項(xiàng)所述殺蚊球形芽孢桿菌漂浮劑，其特征在于，所述玉米芯顆粒用量(W/W)4.5~50%。6.根據(jù)權(quán)利要求l-5任意一項(xiàng)所述殺蚊球形芽孢桿菌漂浮劑，其特征在于，所述緩釋劑選用香豆膠、阿拉伯樹膠或P-環(huán)狀糊精。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述殺蚨球形芽孢桿菌漂浮劑，其特征在于，所述香豆膠與菌漿質(zhì)量比為0.0090.005:1。8.根據(jù)權(quán)利要求l-7任意一項(xiàng)所述殺紋球形芽孢桿菌漂浮劑，其特征在于，所述疏水劑選用棕櫚油、石蠟或紫膠中的一種或多種。9.根據(jù)權(quán)利要求l-8任意一項(xiàng)所述殺蚊球形芽孢桿菌漂浮劑，其特征在于，所述疏水劑包裹時釆用單層包裹或多層包裹。10.制備權(quán)利要求l-9任意一項(xiàng)所述的殺紋球形芽孢桿菌漂浮劑的方法，其特征在于，其包括如下步驟先將滅蚊球形芽孢桿菌發(fā)酵濾液釆用膜濃縮法進(jìn)行濃縮，然后用多孔載體物質(zhì)進(jìn)行吸附，再與緩釋劑混合，并在405(TC干燥成母粒，最后包裹疏水劑而成。全文摘要本發(fā)明提供了一種殺蚊球形芽孢桿菌(Bacillussphaericus)漂浮劑，其由如下步驟制備而成先將滅蚊球形芽孢桿菌發(fā)酵濾液采用膜濃縮法進(jìn)行濃縮，然后用多孔載體物質(zhì)進(jìn)行吸附，再與緩釋劑混合，并在40～50℃干燥成母粒，最后包裹疏水劑。本發(fā)明采用低溫生產(chǎn)工藝制備殺蚊球形芽孢桿菌漂浮劑，活性成份的損失率(即效價損失率)僅10％左右，固形物回收率達(dá)到95％左右。而且該工藝保證生產(chǎn)過程中效價損失率低，能耗小，運(yùn)輸成本低。經(jīng)測定，本發(fā)明漂浮劑一次投藥4mg/L在水中持續(xù)殺滅致乏庫蚊(Culexfatigans)效果可長達(dá)28天以上(室內(nèi)測定)。文檔編號A01P7/00GK101554179SQ20081010354公開日2009年10月14日申請日期2008年4月8日優(yōu)先權(quán)日2008年4月8日發(fā)明者夏海洋,張用梅,芒李,林開春,肖鳳平,陳小龍申請人:武漢天惠生物工程有限公司