專利名稱：：新除草劑抗性基因的制作方法相關(guān)申請的交叉參考本申請要求2004年4月30日提交的U.S.臨時申請序列No.60/567,052的優(yōu)先權(quán)。
背景技術(shù)：
：雜草可以迅速耗盡土壤中作物和其他目的植物所需的有價值的養(yǎng)分。目前有多種類型的除草劑用于控制雜草。一種特別流行的除草劑是草甘膦。已經(jīng)開發(fā)了對草甘膦具有抗性的作物，如玉米、大豆、蕓苔、棉花、甜菜、小麥、草坪和稻。因此可以例如對積極種植草甘膦抗性作物的田地噴灑草甘膦以控制雜草而不顯著損害作物植物。隨著二十世紀(jì)九十年代中期遺傳改造的草甘膦耐性作物(GTC)的引入，在農(nóng)業(yè)中前所未有地使種植者能夠以簡單、便利、靈活并廉價的工具控制廣譜闊葉和禾本科雜草。因此，生產(chǎn)者們迅速采用了GTC，并在很多情況下放棄了公認(rèn)最佳的農(nóng)業(yè)實踐，如作物輪作、除草劑作用方式輪作、罐混、在化學(xué)和栽培雜草控制中摻入機械控制。目前在美國和西半球其他地方可以購買到草甘膦耐性大豆、棉花、玉米和蕓苔。取決于全球市場的接受度，更多的GTC(如小麥、稻、甜菜、草坪等等)正準(zhǔn)備引入。許多其他草甘膦抗性物種正在實驗至開發(fā)階段(如苜蓿、甘蔗、向日葵、甜菜、豌豆、胡蘿卜、黃瓜、萵苣、洋蔥、草莓、西紅柿和煙草、林業(yè)物種如白楊、香楓和園藝物種如金盞花、牽牛花和秋海棠，參閱“isb.vt.edu/cfdocs/fieldtests1.cfm，2005”站點)。此外，近年來草甘膦的費用已經(jīng)大幅降低至幾乎沒有常規(guī)雜草控制程序能在價格和性能上與草甘膦GTC系統(tǒng)有效競爭。草甘膦已經(jīng)在滅生(burndown)和其他非作物地區(qū)成功用于完全植被控制超過15年。在許多情況下(如對于GTC)，可以在連續(xù)的3、5、10直至15年中每年使用草甘膦1-3次。這些情況已經(jīng)導(dǎo)致對草甘膦和GTC技術(shù)的過度依賴，并在天然雜草物種中對草甘膦天然更具耐性或已經(jīng)發(fā)展出對抗草甘膦除草劑活性的機制的植物施加了高選擇壓。僅用草甘膦的雜草控制程序的廣泛使用正導(dǎo)致對草甘膦抗性植物的選擇，并且正在選擇固有地比多數(shù)靶物種更能耐受草甘膦的雜草物種后代(即雜草演替)。(Ng等，2003；Simarmata等，2003；Lorraine-Colwill等，2003；Sfiligoj，2004；Millar等，2003；Heap，2005；Murphy等，2002；Martin等，2002)。盡管草甘膦已經(jīng)在全球廣泛使用超過15年，但僅有少數(shù)雜草被報道已發(fā)展出對草甘膦的抗性(Heap，2005)，然而它們中的大多數(shù)都鑒定于過去的3-5年。抗性雜草包括闊葉和禾本科雜草——瑞士黑麥草(Loliumrigidum)、多花黑麥草(Loliummultiflorum)、牛筋草(Eleusineindica)、豚草(Ambrosiaartemisiifolia)、小飛蓬(Conyzacanadensis)、野塘蒿(Conyzabonariensis)和長葉車前(Plantagolanceolata)。此外，在廣泛使用GTC之前并不是農(nóng)業(yè)問題的雜草現(xiàn)在開始盛行，并且難于用GTC(包括＞80％的美國棉花和大豆地區(qū)和＞20％的美國玉米地區(qū))控制(Gianessi，2005)。這些雜草演替主要與(但不僅與)難于控制的闊葉雜草一起出現(xiàn)。一些實例包括藥薯(ipomea)、莧屬(Amaranthus)、藜屬(Chenopodium)、蒲公英屬(Taraxacum)和鴨跖草科(Commelina)物種。在種植者要面對草甘膦抗性雜草或演替到更難于控制的雜草物種的地區(qū)，種植者可以通過罐混或換用能控制遺漏雜草的其他除草劑來彌補草甘膦的弱點。在許多情況下控制闊葉逃選的一種流行且有效的罐混伴侶為2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-滴)。2，4-滴已經(jīng)在農(nóng)業(yè)和非作物條件下用于廣譜闊葉雜草控制超過60年。已有關(guān)于更具耐性物種的個案報道，但2，4-滴仍是全球最廣泛使用的除草劑之一。對進一步使用2，4-滴的限制在于它在雙子葉植物(如大豆或棉花)中的選擇性非常低，因此2，4-滴一般不用于(且一般不靠近)敏感性雙子葉作物。此外，2，4-滴在禾本科作物中的用途在某種程度上受限于可能出現(xiàn)的作物損傷的性質(zhì)。2，4-滴和草甘膦的組合已經(jīng)用于在種植免耕大豆和棉花之前提供更強的滅生處理，然而，由于這些雙子葉物種對2，4-滴的敏感性，這些滅生處理必須在種植前14-30天以前進行(Agriliance，2003)。和MCPA、2-甲-4-氯丙酸和2，4-滴丙酸一樣，2，4-滴是苯氧酸類除草劑。2，4-滴用于在許多單子葉作物(如玉米、小麥和稻)中選擇性控制闊葉雜草而不嚴(yán)重損傷目的作物植物。2，4-滴是合成的植物生長素衍生物，其作用為使正常的細胞激素內(nèi)穩(wěn)態(tài)失調(diào)，并阻礙平衡的受控生長，然而，其確切的作用模式仍不了解。2，4-滴對某些植物具有不同水平的選擇性(如雙子葉植物比禾本科植物更敏感)。不同植物對2，4-滴的不同代謝是不同水平選擇性的一種解釋。通常植物緩慢代謝2，4-滴，因此靶位點的不同活性更可能解釋植物對2，4-滴不同的應(yīng)答(WSSA，2002)。2，4-滴的植物代謝一般通過兩步代謝實現(xiàn)，一般是羥基化后接著與氨基酸或葡萄糖綴合(WSSA，2002)。隨著時間的發(fā)展，微生物種群已經(jīng)發(fā)展出降解此特定外來物的有效的替代途徑，所述途徑引起2，4-滴的完全礦化。對微生物連續(xù)應(yīng)用除草劑選擇了能利用除草劑作為碳源用于生長(從而使其在土壤中具有競爭優(yōu)勢)的微生物。因為這個原因，目前將2，4-滴配制為具有相對短的土壤半衰期，并且對其后的作物沒有遇到明顯的遺留效應(yīng)(carryovereffect)。這促進了2，4-滴的除草劑應(yīng)用。已經(jīng)廣泛研究了其降解2，4-滴能力的一種生物是真養(yǎng)雷氏菌(Ralstoniaeutropha)(Streber等，1987)。編碼礦化途徑中第一個酶促步驟的基因為tfdA。參閱U.S.專利No.6,153,401和GENBANK登錄號M16730。TfdA通過α酮戊二酸依賴性雙加氧酶反應(yīng)催化2，4-滴酸轉(zhuǎn)化成二氯苯酚(DCP)(Smejkal等，2001)。DCP與2，4-滴相比幾乎不具有除草劑活性。TfdA在轉(zhuǎn)基因植物中用于向通常對2，4-滴敏感的雙子葉植物(如棉花和煙草)中輸入2，4-滴抗性(Streber等(1989)，Lyon等(1989)，Lyon(1993)和U.S.專利No.5,608,147)。已在環(huán)境中鑒定了大量編碼能降解2，4-滴的蛋白質(zhì)的tfdA型基因并已保存于Genebank數(shù)據(jù)庫。許多同系物與tfdA類似(氨基酸同一性＞85％)并具有與tfdA相似的酶活性。然而，有大量同系物與tfdA具有顯著更低的同一性(25-50％)，但卻具有與α酮戊二酸依賴性雙加氧酶Fe+2雙加氧酶相關(guān)的特征殘基。因此這些不同的雙加氧酶的底物特異性是什么并不明確。與tfdA具有低同源性(氨基酸同一性28％)的獨特實例是來自Sphingobiumherbicidovorans的rdpA(Kohler等，1999，Westendorf等，2002)。已經(jīng)顯示此酶催化(R)-2，4-滴丙酸(和其他(R)-苯氧丙酸)以及2，4-滴(苯氧乙酸)礦化的第一步(Westendorf等，2003)。盡管以前已經(jīng)描述了降解苯氧丙酸的生物，但直至最近對此途徑的表征才取得進展(Horvath等，1990)。使2，4-滴丙酸降解復(fù)雜化的另一因素是與2，4-滴丙酸攝取(Kohler，1999)和初期氧化(Westendorf等，2003)相關(guān)的立體特異性(R與S)。迄今仍沒有在其他微生物中異源表達rdpA或?qū)⒋嘶蜣D(zhuǎn)化進植物的報道。文獻主要著眼于主要降解非手性苯氧乙酸(如2，4-滴)的tfdA近親同系物。新除草劑耐受作物(HTC)技術(shù)的開發(fā)很大程度上受到GTC的效力、低費用和便利性的限制。因此，GTC在生產(chǎn)者中的采用率非常高。這很難刺激開發(fā)新的HTC技術(shù)。芳氧基鏈烷酸酯化學(xué)亞結(jié)構(gòu)是許多商品除草劑(包括苯氧基生長素(如2，4-滴和2，4-滴丙酸)、吡啶氧基生長素(如氟草煙和綠草定)、芳氧基苯氧丙酸酯(AOPP)乙酰輔酶A羧化酶(ACC酶)抑制劑(如吡氟氯禾靈(haloxyfop)、喹禾靈(quizalofop)和禾草靈(flumiclorac))和5取代苯氧乙酸初卟啉原氧化酶IX抑制劑(如霸草靈和氟胺草酯))的通用實體。然而，這些除草劑類別的差別都很大，目前的文獻中沒有這些化學(xué)品類別中共有的降解途徑的證據(jù)。發(fā)現(xiàn)涵蓋除草劑降解多種模式的多功能酶將是獨一無二的，并且具有作為HTC性狀的價值。發(fā)明概述本發(fā)明提供不僅對2，4-滴具有抗性，而且還對AOPP除草劑具有抗性的新植物。迄今還沒有預(yù)期或提出可通過引入單個基因產(chǎn)生具有這兩種有利特性的植物。本發(fā)明還包括這樣的植物其產(chǎn)生與一種或多種其他除草劑抗性基因(包括但不僅限于草甘膦、咪唑啉酮和草銨膦抗性基因)“疊加”的一種或多種本發(fā)明的酶，以提供與更廣更多的強雜草控制和除草劑抗性管理選擇相容的除草劑耐性植物。本發(fā)明還包括利用本文示例的基因和蛋白質(zhì)的同系物的方法和組合物。在一些實施方案中，本發(fā)明提供對2，4-滴、AOPP和一種或多種市售除草劑(如草甘膦、咪唑啉酮、草銨膦、磺脲類、二氯甲氧苯酸、溴草腈等等)具有耐性的單子葉和雙子葉植物。還公開了含有負責(zé)這些除草劑耐性的核酸序列的載體以及將這些耐性植物和除草劑組合用于雜草控制和防止雜草種群演替的方法。本發(fā)明提供以新的方法使用除草劑的新組合。此外，本發(fā)明提供預(yù)防產(chǎn)生并控制對一種或多種除草劑(如草甘膦)具有抗性的雜草株系的新方法。本發(fā)明賦予除草劑和作物的新組合的新用途，包括在種植對該除草劑(如2，4-滴)敏感的植物的種子之前對將種植的地區(qū)進行的種植前應(yīng)用。本發(fā)明部分涉及酶的鑒定，所述酶不僅能降解2，4-滴，而且還令人吃驚地具有例如使本發(fā)明的酶區(qū)別于先前已知的tfdA蛋白的新特性。更具體的，本發(fā)明涉及能以對映體特異性方式降解2，4-滴和AOPP除草劑的酶的用途。先前已報道的α酮戊二酸依賴性雙加氧酶均不具有降解不同化學(xué)類別或作用模式的除草劑的能力。本發(fā)明使用的優(yōu)選酶和基因在本文中稱為AAD-1(芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶)。這一高度新穎的發(fā)現(xiàn)是重要的HTC性狀和選擇標(biāo)記可能性的基礎(chǔ)。之前沒有動機產(chǎn)生含有AAD-1基因(優(yōu)選如本文所示例的具有為了在一種或多種植物中表達而優(yōu)化的序列的AAD-1多核苷酸)的植物，也沒有期望這些植物能有效的產(chǎn)生AAD-1酶以使植物不僅對苯氧酸除草劑(如2，4-滴)具有抗性，而且還對AOPP除草劑(如喹禾靈、吡氟氯禾靈等)具有抗性。因此，本發(fā)明提供了許多本領(lǐng)域迄今未曾設(shè)想過的優(yōu)點。本發(fā)明還部分涉及編碼能降解苯氧基植物生長素和芳氧基苯氧丙酸酯除草劑的芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶的基因的鑒定和用途。篩選蛋白質(zhì)的這些活性的方法也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。因此，本發(fā)明包括通過重組表達的AAD-1酶降解2，4-二氯苯氧乙酸、其他苯氧基鏈烷酸酯生長素除草劑和芳氧基苯氧丙酸酯除草劑。本發(fā)明還包括控制雜草的方法，其中所述方法包括對含有AAD-1基因的植物應(yīng)用一種或多種AOPP、苯氧基生長素或其他芳氧基鏈烷酸酯除草劑。本發(fā)明還提供使用AAD-1基因作為鑒定轉(zhuǎn)化了AAD-1的植物細胞和完整植物的選擇標(biāo)記物的方法，所述植物細胞或完整植物任選地包含同時插入靶植物細胞的一個、兩個或更多外源基因。本發(fā)明的方法包括選擇對適當(dāng)水平的除草劑具有抗性的轉(zhuǎn)化細胞。本發(fā)明還包括通過培養(yǎng)本發(fā)明的植物和/或細胞制備具有芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶生物活性的多肽的方法。附圖簡述圖1顯示苯氧基生長素或AOPP除草劑的雙加氧酶裂解的一般方案。圖2顯示用AAD-1處理的2，4-滴溶液的除草劑活性的喪失。圖3顯示用AAD-1處理的吡氟氯禾靈溶液的除草劑活性的喪失。圖4顯示用AAD-1催化代表性的除草劑預(yù)計產(chǎn)生的酚。圖5顯示重組AAD-1產(chǎn)生的2，4-二氯苯酚。圖6A和6B顯示由重組AAD-1從多種除草劑底物產(chǎn)生的酚。圖7顯示對四種除草劑底物的底物濃度的AAD-1反應(yīng)速率。圖8A和8B顯示AAD-1(v3)在不同時期的擬南芥葉中等量表達，但在25天的實驗中持續(xù)積累。未噴灑除草劑2，4-滴(圖A)的植物比經(jīng)噴灑(圖B)的植物表達稍多的AAD-1(v3)。條柱代表來自5株不同植物的5片葉的平均值±SEM和用可溶性蛋白總量標(biāo)準(zhǔn)化的AAD-1(v3)表達百分?jǐn)?shù)。淺色條代表采自頂端的第三幼的葉(N-3)，深色條代表采自底部的第五老的葉。圖9A、9B和9C顯示2，4-滴處理后擬南芥植物的損傷。用四種不同劑量的2，4-滴處理四個不同株系，在處理后4天(圖A)和14天(圖B)對其損傷分級。還使用ELISA測定其葉中AAD-1(v3)的表達(圖C)。結(jié)果為來自接受同一處理的5株不同植物的5片葉的平均值±SEM。圖10展示在第7天，與野生型和經(jīng)轉(zhuǎn)化的對照擬南芥株系相比，轉(zhuǎn)化了pDAB3230的擬南芥(AAD-1+EPSPS)顯示出＞14倍水平的草甘膦耐性。圖11顯示愈傷組織玉米懸液對R-吡氟氯禾靈的劑量應(yīng)答。圖12顯示在1μMcyhalofopphenol下，生長仍然高達無cyhalofopphenol的對照的76％。圖13展示一個轉(zhuǎn)基因事件3404-006對吡氟氯禾靈的劑量應(yīng)答數(shù)據(jù)。圖14顯示若干轉(zhuǎn)化AAD-1(v3)和非轉(zhuǎn)化事件克隆對一周前以出苗后噴灑應(yīng)用的兩種致死劑量的AOPP除草劑(吡氟氯禾靈和喹禾靈)的應(yīng)答。圖15顯示用Liberty_除去無效從3404個轉(zhuǎn)化中預(yù)篩選的三個不同T2譜系，選擇它們用來相對于其AAD-1的表達而比較其對喹禾靈的耐性。在第14天(數(shù)據(jù)未顯示)和第30天測量表達。圖16顯示在大田條件下，轉(zhuǎn)化了AAD-1(v3)的玉米對8X大田用量的喹禾靈(AssureII)具有耐性。圖17展示在含有cyhalofop的培養(yǎng)基上培養(yǎng)的未成熟玉米胚。圖18顯示轉(zhuǎn)化了AAD-1(V3)基因的大豆愈傷組織的Western印跡分析表明愈傷組織細胞表達AAD-1(V3)蛋白。圖19顯示AAD-2(v1)與AAD-1(v1)的2，4-滴降解率擬合曲線。圖20顯示轉(zhuǎn)化了AAD-1v3(植物優(yōu)化)或AAD-1(v2)(天然)、AAD-2(v1)(天然)或AAD-2(v2)(植物優(yōu)化)的T1擬南芥對一系列出苗后應(yīng)用的2，4-滴用量的反應(yīng)。每盆代表T1家族每個基因內(nèi)的單個轉(zhuǎn)化事件。圖21顯示轉(zhuǎn)化了天然AAD-2(v2)的單個T1擬南芥植物的western印跡分析。其顯示200gae(酸當(dāng)量)/ha2，4-滴處理對表達AAD-2(v1)的植物造成嚴(yán)重的損傷，而一般對轉(zhuǎn)化天然AAD-1(v2)或植物優(yōu)化的AAD-1(v3)的擬南芥很少造成損傷。在凝膠上鑒定AAD-2蛋白。在轉(zhuǎn)化AAD-2和轉(zhuǎn)化Pat/Cry1F的樣品中檢測到了若干背景條帶。圖22顯示AAD-2(v1)對底物的相對活性為2，4-滴＝2，4-滴丙酸＞(R，S)-吡氟氯禾靈＞＞(R)-吡氟氯禾靈。序列簡述SEQIDNO1為用于擴增rdpA/AAD-1(v1)基因的正向引物。SEQIDNO2為用于擴增rdpA/AAD-1(v1)基因的反向引物。SEQIDNO3為來自Sphingobiumherbicidovorans的AAD-1(v1)的核苷酸序列。SEQIDNO4為去除了內(nèi)部NotI限制性位點的天然AAD-1基因的核酸序列。此基因命名為AAD-1(v2)。DNA測序證實產(chǎn)生了正確的PCR產(chǎn)物，但是在氨基酸#212處無意地造成了由精氨酸到半胱氨酸的改變。SEQIDNO5為“植物優(yōu)化”的DNA序列AAD-1(v3)。此“基因”編碼SEQIDNO11，它除了在第二個位置加入了丙氨酸殘基以外均與SEQIDNO9相同。包含額外的丙氨酸密碼子(GCT)以編碼跨越ATG起始密碼子的NcoI位點(CCATGG)以便進行其后的克隆操作。SEQIDNO6(“rdpA(ncoI)”)和SEQIDNO7(“3′sacI”)用于使用FailSafePCRSystem(Epicenter)擴增DNA片段。SEQIDNO8為與“3′SacI”引物一起使用的另一PCR引物(“BstEII/De1NotI”)。SEQIDNO9為來自Sphingobiumherbicidovorans的AAD-1(v1)基因所編碼的天然氨基酸序列。SEQIDNO10為SEQIDNO4的AAD-1(v2)DNA序列所編碼的氨基酸序列。SEQIDNO11為SEQIDNO5的AAD-1(v3)植物優(yōu)化DNA序列所編碼的氨基酸序列。SEQIDNO12為天然AAD-2(v1)基因的DNA序列。SEQIDNO13為AAD-2(v1)蛋白的氨基酸序列。SEQIDNO14為擴增用于克隆的AAD-2(v1)DNA所使用的正向引物。SEQIDNO15為擴增用于克隆的AAD-2(v1)DNA所使用的反向引物。SEQIDNO16為M13正向引物。SEQIDNO17為M13反向引物。SEQIDNO18為擴增用于克隆的AAD-2(v1)DNA所使用的正向引物。SEQIDNO19為擴增用于克隆的AAD-2(v1)DNA所使用的反向引物。SEQIDNO20為天然大豆EPSPS蛋白。SEQIDNO21為含有殘基183(用異亮氨酸替換天然蛋白質(zhì)的蘇氨酸)和殘基187(用絲氨酸替換天然蛋白質(zhì)的脯氨酸)處突變的雙突變大豆EPSPS蛋白序列。SEQIDNO22為編碼SEQIDNO21的EPSPS蛋白的大豆偏好DNA序列。SEQIDNO23為引物Pat5-3。SEQIDNO24為引物Pat3-3。SEQIDNO25為正向引物AAD-1PTU。SEQIDNO26為反向引物AAD-1PTU。SEQIDNO27為用于AAD-1編碼區(qū)PCR的正向引物。SEQIDNO28為用于AAD-1編碼區(qū)PCR的反向引物。SEQIDNO29為AAD-2(v2)核苷酸(植物優(yōu)化)。SEQIDNO30為翻譯的AAD-2(v2)蛋白序列。SEQIDNO31為AAD-1Southern片段PCR的正向引物。SEQIDNO32為AAD-1Southern片段PCR的反向引物。發(fā)明詳述本發(fā)明開發(fā)的2，4-滴抗性基因及其后的抗性作物提供用于在作物中控制草甘膦抗性(或高耐性和演替的)闊葉雜草物種的優(yōu)良選擇。2，4-滴是廣譜、相對便宜且強力的闊葉除草劑，如果在雙子葉和單子葉中同樣能提供更強的作物耐性，則可為種植者提供優(yōu)良的效用。2，4-滴耐性轉(zhuǎn)基因雙子葉植物還可在應(yīng)用時間和用量上具有更高的靈活性。2，4-滴除草劑耐性性狀的另一用途是它可用于預(yù)防2，4-滴漂移、揮發(fā)、轉(zhuǎn)化(inversion)(或其他遠距離的移動現(xiàn)象)、誤用、破壞等等對正常敏感性作物的損害。AAD-1基因的另一益處是，與目前已表征的所有tfdA同系物不同，AAD-1除了能降解非手性苯氧基生長素(如2，4-滴、MCPA和2-甲-4-氯丙酸)以外，還能降解手性苯氧基生長素(如2，4-滴丙酸和2-甲-4-氯丙酸)的R-對映體(除草劑活性異構(gòu)體)。見表1。已經(jīng)廣泛使用不同苯氧基生長素組合的多種混合來處理不同地區(qū)特定的雜草譜和環(huán)境條件。在植物中使用AAD-1可以提供對更廣譜的苯氧基生長素除草劑的防護，從而提高靈活性和可控制的雜草譜，提供對全范圍市售苯氧基生長素的漂移或其他遠距離苯氧基除草劑損傷的防護。表1.市售的苯氧基生長素。對于苯氧基生長素除草劑通常制成活性酸，但也有一些商品化配制為多種相應(yīng)酯制劑之一，由于一般的植物酯酶在植物中將這些酯轉(zhuǎn)換成活性酸，因此這些也同樣認(rèn)為是在植物中AAD-1酶的底物。類似的還可以是相應(yīng)酸的相應(yīng)有機或無機鹽。當(dāng)表示手性丙酸、丙酸鹽或丙酸酯除草劑時，即使不同的CAS號可能對應(yīng)于光學(xué)純的化合物，在命名這些除草劑時仍認(rèn)為消旋(R，S)或光學(xué)純化的(R或S)對映體是同一除草劑?？赡艿挠昧糠秶梢允亲魑锘蚍亲魑镉猛局袉为毺幚砘蚺c其他除草劑組合。AAD-1基因的另一好處是其前所未有的附帶降解大量芳氧基苯氧丙酸酯(AOPP)類商品和非商品禾本科除草劑化合物的能力。見表2。此屬性使得可以對含有AAD-1的轉(zhuǎn)基因作物應(yīng)用大量AOPP化合物中的任一種，而在轉(zhuǎn)基因之前這些作物的耐性并不保重AOPP可用于其中。這些作物中最常見的包括禾本科作物，如玉米、稻、小麥、大麥、黑麥、燕麥、高粱、暖季和涼季草坪物種、禾本科牧草物種以及許多其他物種，但也可包括雙子葉作物，其中AOPP耐性(天然存在于多數(shù)雙子葉植物中)未達到可以在所述雙子葉作物中使用AOPP的商品化水平。表2.以公認(rèn)的通用名列出的AOPP禾本科除草劑化合物。AOPP通常制成活性酸，但也有一些商品化配制為多種相應(yīng)酯制劑之一，由于一般的植物酯酶在植物中將這些酯轉(zhuǎn)換成活性酸，因此這些在植物中也同樣認(rèn)為是AAD-1酶的底物。類似的還可以是相應(yīng)酸的相應(yīng)有機或無機鹽。當(dāng)表示手性丙酸、丙酸鹽或丙酸酯除草劑時，即使不同的CAS號可能對應(yīng)于光學(xué)純的化合物，在命名這些除草劑時仍認(rèn)為消旋(R，S)或光學(xué)純化的(R或S)對映體是同一除草劑?？赡艿挠昧糠秶梢允亲魑锘蚍亲魑镉猛局袉为毺幚砘蚺c其他除草劑組合?，F(xiàn)已鑒定了單一基因(AAD-1)，其在遺傳改造用于植物表達后具有允許在植物中使用苯氧基生長素除草劑的特性，所述植物中固有耐性不存在或不足以允許使用這些除草劑。此外，AAD-1可以在天然耐性不足以允許選擇性時在植物中提供對AOPP除草劑的防護。現(xiàn)在可以連續(xù)或罐混地與一種、兩種或若干苯氧基生長素除草劑的組合處理僅含AAD-1的植物。用于控制廣譜雙子葉雜草的每種苯氧基生長素除草劑的用量范圍從25到4000gae/ha，更通常從100到2000gae/ha。類似的，可以對具有降低的受到AOPP禾本科除草劑損傷風(fēng)險的表達AAD-1的植物應(yīng)用一種、兩種或若干種所述除草劑化合物的混合物。用于控制廣譜單子葉雜草的每種AOPP的用量范圍可以從10到2000gae/ha，更通常是從20到500gae/ha。在同一大田里(連續(xù)或罐混組合地)組合這些不同化學(xué)類別和具有不同作用模式和范圍的除草劑可以提供對大多數(shù)需要除草劑控制的潛在雜草的控制。草甘膦被廣泛地使用，因為它控制非常廣譜的闊葉和禾本科雜草物種。然而，在GTC和非作物應(yīng)用中重復(fù)使用草甘膦已經(jīng)(而且仍將繼續(xù))選擇使雜草演替為天然更具耐性的物種或草甘膦抗性生物型。多數(shù)除草劑抗性管理策略建議使用有效用量的罐混除草劑伴侶作為延緩出現(xiàn)抗性雜草的方法，所述除草劑伴侶提供對同一物種的控制，但具有不同的作用模式。將AAD-1與草甘膦耐性性狀(和/或其他除草劑耐性性狀)疊加可通過允許對同一作物選擇性使用草甘膦、苯氧基生長素(如2，4-滴)和AOPP除草劑(如喹禾靈)而實現(xiàn)對GTC中草甘膦抗性雜草物種(被一種或多種AOPP除草劑控制的禾本科雜草物種或被苯氧基生長素控制的闊葉雜草物種)的控制。這些除草劑的應(yīng)用可以是在含有不同作用模式的兩種或更多除草劑的罐混合物中同時使用、在連續(xù)應(yīng)用(如種植前、出苗前或出苗后)中單個除草劑組合物的單獨使用(使用的間隔時間范圍從2小時到3個月)，或者備選地，可以在任何時間(從種植作物7個月內(nèi)到收獲作物時(或?qū)τ趩蝹€除草劑為收獲前間隔，取最短者))使用代表可應(yīng)用每種化學(xué)類別的任意數(shù)目除草劑的組合。在控制廣譜禾本科和闊葉雜草中具有靈活性是很重要的，即使用時間、單個除草劑用量和控制頑固或抗性雜草的能力。作物中與草甘膦抗性基因/AAD-1疊加的草甘膦應(yīng)用的范圍可以從250-2500gae/ha；苯氧基生長素除草劑(一種或多種)可按照從25-4000gae/ha應(yīng)用；AOPP除草劑(一種或多種)可按從10-2000gae/ha應(yīng)用。這些應(yīng)用的時間的最佳組合取決于具體的條件、物種和環(huán)境，并可由雜草控制領(lǐng)域且具有本公開內(nèi)容的優(yōu)先權(quán)的技術(shù)人員最佳決定。除草劑制劑(如酯、酸或鹽配方或可溶濃縮劑、乳化濃縮劑或可溶液體)和罐混添加劑(如佐劑或相容劑)可顯著影響給定的除草劑或一種或多種除草劑的組合的雜草控制。任意前述除草劑化學(xué)的任意這些組合都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員還會了解，兩種或更多作用模式的組合在提高受控雜草譜和/或天然更具耐性物種或抗性雜草物種上的益處還可擴展到通過人工(轉(zhuǎn)基因或非轉(zhuǎn)基因)在作物中產(chǎn)生除GTC外的除草劑耐性的化學(xué)品。事實上，可以單獨或以多重組合疊加編碼以下抗性的性狀以提供有效控制或防止雜草演替/對任意前述類別的除草劑的抗性的能力草甘膦抗性(如抗性植物或細菌EPSPS、GOX、GAT)、草銨膦抗性(如Pat、bar)、乙酰乳酸合酶(ALS)抑制性除草劑抗性(如咪唑啉酮、磺酰脲、三唑嘧啶、磺苯胺、嘧啶硫代苯甲酸和其他化學(xué)品如AHAS，Csr1，SurA等)、溴草腈抗性(如Bxn)、對HPPD(4-羥苯基丙酮酸雙加氧酶)酶抑制劑的抗性、對八氫番茄紅素去飽和酶(PDS)抑制劑的抗性、對光系統(tǒng)II抑制性除草劑的抗性(如psbA)、對光系統(tǒng)I抑制性除草劑的抗性、對原卟啉原氧化酶IX(PPO)抑制性除草劑的抗性(如PPO-1)、對苯脲除草劑的抗性(如CYP76B1)、二氯甲氧苯酸降解酶(參閱如US20030135879)等等。關(guān)于其他除草劑，一些其他優(yōu)選的ALS抑制劑包括三唑嘧啶磺苯胺(如氯酯磺草胺、雙氯磺草安、雙氟磺草胺、唑嘧磺草胺、磺草唑胺(metosulam)和嘧啶并三唑類磺胺(penoxsulam)、嘧啶硫代苯甲酸(如bispyribac和pyrithiobac)和氟唑磺隆。一些優(yōu)選的HPPD抑制劑包括甲基磺草酮、異惡唑草酮和磺草酮。一些優(yōu)選的PPO抑制劑包括flumiclorac、丙炔氟草胺、flufenpyr、pyraflufen、fluthiacet、氟丙嘧草酯、唑草酮、甲磺草胺和二苯醚(如三氟羧草醚、氟磺胺草醚、乳氟禾草靈和乙氧氟草醚)。此外，可以將AAD-1單獨或與其他HTC特征疊加后再與一種或多種其他輸入(如昆蟲抗性、真菌抗性或脅迫耐性等)或輸出(如提高的產(chǎn)量、改進的油譜、提高的纖維品質(zhì)等)性狀疊加。因此，本發(fā)明可用于提供以靈活且經(jīng)濟地控制任何數(shù)目的農(nóng)學(xué)害蟲的能力提高作物品質(zhì)的完整農(nóng)學(xué)解決方案。本發(fā)明部分涉及鑒定不僅能降解2，4-滴，而且令人驚奇地具有使本發(fā)明的酶區(qū)別于先前已知的(例如)tfdA蛋白的新特性的酶。盡管此酶與tfdA的同源性很低，但本發(fā)明的基因一般仍可歸類到α酮戊二酸依賴性雙加氧酶的同一總體家族。此家族蛋白質(zhì)的特征在于包含活性位點的“HX(D/E)X23-26(T/S)X114-183HX10-13R”基序中的三個保守性組氨酸殘基。組氨酸與活性位點中催化活性所必需的Fe+2離子配位(Hogan等，2000)。設(shè)計了本文所討論的初步體外表達實驗以幫助選擇新屬性。更具體的，本發(fā)明部分涉及不僅能降解2，4-滴而且還能降解AOPP除草劑的酶的用途。先前已經(jīng)報道的α酮戊二酸依賴性雙加氧酶均不具有降解不同化學(xué)類別和作用方式的除草劑的能力。本發(fā)明用途中優(yōu)選的酶和基因在本文中稱為AAD-1(芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶)基因和蛋白。本發(fā)明還部分涉及編碼能降解苯氧基生長素和芳氧基苯氧丙酸酯除草劑的芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶的基因的鑒定和用途。因此，本發(fā)明部分涉及通過重組表達的AAD-1酶降解2，4-二氯苯氧乙酸、其他苯氧鏈烷基生長素的除草劑和芳氧基苯氧基鏈烷酸酯除草劑。在分析和生物測定中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)對2，4-滴到2，4-二氯苯酚(“DCP”，無除草劑活性)的轉(zhuǎn)化測試為陽性。部分純化的本發(fā)明蛋白質(zhì)能在體外將2，4-滴迅速轉(zhuǎn)化為DCP(轉(zhuǎn)化率從50％-100％)。轉(zhuǎn)化AAD-1的植物提供的另一優(yōu)點是母體除草劑代謝為失活形式，從而降低谷物或秸稈中收獲除草劑殘留物的可能。本發(fā)明還包括控制雜草的方法，其中所述方法包括對含有AAD-1基因的植物應(yīng)用AOPP除草劑和/或苯氧基生長素除草劑。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)在提供了含有編碼這種類型酶的多核苷酸的新植物。迄今為止還沒有產(chǎn)生這種植物的動機，也沒有預(yù)期這樣的植物能有效產(chǎn)生此酶，以不僅賦予植物對苯氧基酸除草劑(如2，4-滴)的抗性，而且賦予植物對AOPP除草劑的抗性。因此，本發(fā)明提供本領(lǐng)域從未設(shè)想過的許多有點?？梢垣@得(保藏于培養(yǎng)物保藏中心如ATCC或DSMZ的)公共可得的菌株并使用本文公開的技術(shù)篩選新基因。本文公開的序列可用于擴增同源基因并克隆進重組表達系統(tǒng)，以根據(jù)本發(fā)明進一步進行篩選和測試。如上文背景章節(jié)所討論的，已被廣泛研究其降解2，4-滴能力的一種生物為真養(yǎng)雷氏菌(Streber等，1987)。編碼降解途徑中第一種酶的基因為tfdA。參閱U.S.專利No.6,153,401和GENBANK登錄號M16730。tfdA催化通過α酮戊二酸依賴性雙加氧酶反應(yīng)使2，4-滴酸轉(zhuǎn)化成無除草劑活性的DCP(Smejkal等，2001)。tfdA已在轉(zhuǎn)基因植物中用于將2，4-滴抗性輸入到通常對2，4-滴敏感的雙子葉植物(如棉花和煙草)中(Streber等，1989；Lyon等，1989；Lyon等，1993)。已經(jīng)從環(huán)境中鑒定了編碼能降解2，4-滴的蛋白質(zhì)的大量tfdA型基因并保存于Genebank數(shù)據(jù)庫。許多同系物與tfdA非常相似(氨基酸同一性＞85％)并具有與tfdA相似的酶特性。然而，現(xiàn)在鑒定了與tfdA具有低水平同源性的一小批α酮戊二酸依賴性雙加氧酶同系物。來自Sphingobiumherbicidovorans的rdpA(Westendorf等，2002)是具有低同源性(氨基酸同一性28％)的一個獨特實例。此酶已顯示催化(R)-2，4-滴丙酸(及其他(R)-苯氧丙酸)和2，4-滴礦化的第一個步驟(Westendorf等，2003)。盡管了解負責(zé)苯氧丙酸降解的生物已有一段時間，但直到最近，此途徑的表征幾乎沒有取得任何進展(Horvath等，1990)。2，4-滴丙酸降解的另一個復(fù)雜因素是與攝取(Kohler，1999)和2，4-滴丙酸起始氧化(Westendorf等，2003)相關(guān)的空間特異性(R和S)。迄今為止還沒有在其他微生物中異源表達rdpA或?qū)⒋嘶蜣D(zhuǎn)化進植物中的報道。文獻主要著眼于主要降解非手性苯氧乙酸的tfdA近親同系物上。本領(lǐng)域還沒有預(yù)期能在植物中成功表達rfpA或AAD-1基因以賦予植物對2，4-滴的抗性(更不必說讓人大為驚奇的AOPP抗性)。如下文實施例中所更詳細描述的，從Sphingobiumherbicidovorans中克隆了rdpA并測試了在多種除草劑化學(xué)類別中的底物混雜性。已經(jīng)顯示以其天然形式純化的這種α酮戊二酸依賴性雙加氧酶可降解2，4-滴和2，4-滴丙酸(Westendorf等，2002和2003)。然而，先前已報道的α酮戊二酸依賴性雙加氧酶均不具有降解不同化學(xué)類別和作用方式的除草劑的能力。從未在植物中表達過rdpA，也沒有動機這樣做，因為新HTC技術(shù)的開發(fā)已經(jīng)在很大程度上受到GTC的效能、低費用和便利性的限制(Devine，2005)。根據(jù)新的活性，本發(fā)明的新蛋白質(zhì)和基因在本文中稱為AAD-1蛋白和基因。目前已證實AAD-1在體外降解多種苯氧乙酸和苯氧丙酸生長素除草劑。然而，如本文所第一次報道的，驚奇地發(fā)現(xiàn)此酶還能降解芳氧基鏈烷酸酯類分子的其他底物。具有重要農(nóng)學(xué)意義的底物為芳氧基苯氧丙酸酯(AOPP)禾本科除草劑。這一高度新穎的發(fā)現(xiàn)是重要的除草劑耐受作物(HTC)和選擇標(biāo)記物特征可能性的基礎(chǔ)。本文報道AAD-1的最適底物為廣譜禾本科AOPP除草劑以及2，4-滴、2，4-滴丙酸和其他苯氧基生長素。此酶的獨特性在于其輸入對一系列廣譜闊葉除草劑(苯氧基生長素)和一系列廣譜高活性禾本科除草劑(AOPP)的降解活性的能力。因此，本發(fā)明部分涉及通過重組表達的芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶(AAD-1)降解2，4-二氯苯氧乙酸、其他苯氧鏈烷基生長素除草劑和芳氧基苯氧鏈烷酸酯除草劑。本發(fā)明還部分涉及編碼能降解苯氧基生長素和芳氧基苯氧丙酸酯除草劑的芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶降解酶(ADD-1)的基因的鑒定和用途。本發(fā)明使得可進行轉(zhuǎn)基因表達，所述轉(zhuǎn)基因表達引起控制幾乎所有闊葉和禾本科雜草的除草劑組合的耐性。AAD-1可作為優(yōu)秀的除草劑耐受作物(HTC)性狀與例如其他HTC性狀(如草甘膦抗性、草銨膦抗性、咪唑啉酮抗性、溴草腈抗性等)和昆蟲抗性性狀(如Cry1F、Cry1Ab、Cry34/45等)疊加。此外，AAD-1可作為選擇標(biāo)記物輔助選擇用另一個基因或基因組遺傳改造的植物的原代轉(zhuǎn)化體。此外，已經(jīng)重新設(shè)計了本發(fā)明的微生物基因，以使該蛋白質(zhì)由傾向于單子葉和雙子葉植物用途的密碼子編碼(hemicot)。已經(jīng)用含有AAD-1的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化了擬南芥、玉米、煙草、棉花、大豆、蕓苔和稻，并已證明了對苯氧基生長素和AOPP除草劑的高水平抗性。因此，本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的“植物優(yōu)化的”基因。如下文實施例6所示，與細菌基因相比，示例的重構(gòu)基因能更有效的將除草劑抗性輸入到植物。Oxyalkanoate基團可用于將穩(wěn)定的酸官能度引入除草劑。酸性基團可通過“酸捕獲”輸入韌皮部活動性(除草劑作用所需的屬性)，從而可以為了活動性目的而整合進新除草劑。本發(fā)明的方面還提供產(chǎn)生HTC的機制。存在很多可能為AAD-1底物的市售和實驗性除草劑。因此，使用本發(fā)明基因還可以得到對其他除草劑的除草劑耐性。本發(fā)明的HTC性狀可用在與其他HTC性狀(包括但不僅限于草甘膦耐性)的新組合中。由于對除草劑(如草甘膦)的新獲得的抗性或固有的耐性，這些性狀組合產(chǎn)生控制雜草(等)物種的新方法。因此，除了HTC性狀，本發(fā)明的范圍還包括使用除草劑控制雜草的新方法，其中通過轉(zhuǎn)基因作物中的所述酶產(chǎn)生對所述除草劑的耐性。此外，種植草甘膦耐性作物在全球盛行。與其他草甘膦耐性作物多次輪作后，在輪作作物中控制草甘膦耐性自生作物可能很困難。因此，(疊加或單獨轉(zhuǎn)化進作物的)本發(fā)明轉(zhuǎn)基因性狀的使用提供了控制其他HTC自生作物的工具。本發(fā)明可以用于使(例如)大豆中與目前的草甘膦抗性性狀疊加的2，4-滴抗性性狀商品化。因此，本發(fā)明提供對抗闊葉雜草物種演替和/或選擇除草劑抗性闊葉雜草的工具，所述雜草來自于種植者在多種作物的雜草控制中對草甘膦極高的依賴性。本發(fā)明的AAD-1基因的轉(zhuǎn)基因表達示例于如擬南芥、玉米(玉蜀黍)、煙草、棉花、稻、大豆和蕓苔。然而本發(fā)明可應(yīng)用于任何其他所需類型的植物。大豆是本發(fā)明的轉(zhuǎn)化優(yōu)選的作物。然而，本發(fā)明可應(yīng)用于多種其他禾本科和其他闊葉作物。類似的，2，4-滴可更積極地用于2，4-滴耐性適中的禾本科作物中，由此性狀得到的提高的耐性將為種植者提供能以更有效的用量和更廣的使用時間來使用2，4-滴而無作物損傷風(fēng)險的可能性。另外，本發(fā)明提供了可提供對控制闊葉雜草(生長素)和禾本科雜草(AOPP)的除草劑的抗性的單基因。此基因可用于多種作物中，讓使用廣譜除草劑組合變成可能。本發(fā)明還可控制對目前的化學(xué)品具有抗性的雜草，并輔助控制目前的農(nóng)業(yè)實踐產(chǎn)生的演替的雜草譜。本發(fā)明的AAD-1還可以用于將其他除草劑底物解毒成非除草劑形式的嘗試。因此，本發(fā)明發(fā)展了其他HTC性狀和/或選擇標(biāo)記物技術(shù)。除了使用本發(fā)明基因產(chǎn)生HTC以外，本發(fā)明基因還可用作細胞培養(yǎng)物、溫室和大田中成功選擇轉(zhuǎn)化體的選擇標(biāo)記物。本發(fā)明基因僅作為生物技術(shù)目的的選擇標(biāo)記物就具有很高的內(nèi)在價值。AAD-1與其他苯氧基鏈烷生長素除草劑的混雜性提供了將此基因用于HTC和/或選擇標(biāo)記物目的的許多可能。通過PCR從Sphingobiumherbicidovorans(ATCC700291)將本發(fā)明的一個基因(本文稱為AAD-1(芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶))克隆進pET280-S/S(命名為pDAB3203)并在BL-21Star大腸桿菌中表達。(以1mMIPTG和與以下反應(yīng)混合物組合的培養(yǎng)物裂解液誘導(dǎo)112.5μg/ml2，4-滴、1mM抗壞血酸、1mMα酮戊二酸、50μMFe(NH4)2(SO4)2)過表達此基因時，重組產(chǎn)生的酶將2，4-滴降解成無除草劑活性的DCP(通過HPLC、質(zhì)譜、比色測定和擬南芥平板測定確定)。此外，已證明AAD-1將以下除草劑轉(zhuǎn)化成其相應(yīng)的失活酚二氯苯氧丙酸、2-甲-4氯丙酸、吡氟氯禾靈、禾草靈等等(參閱表3和4)。表3純化的AAD-1(v1)對多種除草劑生長素和類似物的效應(yīng)。每個0.16ml的測定使用1μl或10μl(10×)純化的AAD1(v1)測定25mMMOPSpH6.8、200μMFe2+、200μM抗壞血酸鈉、1mMα-酮戊二酸中1mM的底物。表4純化的AAD-1(v1)對多種AOPP禾本科除草劑和類似物的效應(yīng)和對cloquintocet的效應(yīng)。每個0.16ml的測定使用1μl或10μl(10×)純化的AAD1(v1)測定25mMMOPSpH6.8、200μMFe2+、200μM抗壞血酸鈉、1mMα-酮戊二酸中1mM的底物。本發(fā)明的蛋白質(zhì)(和來源分離物)。本發(fā)明提供功能蛋白質(zhì)。“功能活性”(或“活性”)在本文中指本發(fā)明用途的蛋白質(zhì)/酶(單獨或與其他蛋白質(zhì)組合)具有降解或減弱除草劑活性的能力。產(chǎn)生本發(fā)明蛋白質(zhì)的植物優(yōu)選產(chǎn)生“有效量”的蛋白質(zhì)，從而在用除草劑處理植物時，蛋白質(zhì)表達的水平足以給予植物對除草劑(若無特別說明則為一般用量，一般應(yīng)用量可見于例如熟知的《HerbicideHandbook》(WeedScienceSocietyofAmerica，第八版，2002))完全或部分的抗性或耐性。可以以通常殺死靶植物的用量、正常的大田用量和濃度使用除草劑。(由于本發(fā)明，水平和/或濃度可以任選地比先前所使用的更高。)優(yōu)選地，本發(fā)明的植物細胞和植物被保護免受除草劑處理引起的生長抑制和損傷。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物和植物細胞優(yōu)選具有對本文討論的除草劑的抗性或耐性，即轉(zhuǎn)化植物和植物細胞能在有效用量的一種或多種本文討論的除草劑存在下生長。本發(fā)明優(yōu)選的蛋白質(zhì)具有代謝一種或多種芳氧基鏈烷酸酯化合物的催化活性。轉(zhuǎn)移功能活性到植物或細菌系統(tǒng)可涉及編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)氨基酸序列的核酸序列，所述核酸序列整合進蛋白質(zhì)表達載體，所述載體適于其將居留的宿主。獲得編碼具有功能活性的蛋白質(zhì)的核酸序列的一種方法是使用從本文討論的蛋白質(zhì)的氨基酸序列推出的信息從產(chǎn)生目的蛋白質(zhì)的細菌物種中分離天然遺傳物質(zhì)。如下文更詳細討論的，可以優(yōu)化天然序列用于例如植物表達。也可以基于蛋白質(zhì)序列設(shè)計優(yōu)化的多核苷酸。本發(fā)明提供具有本文所述新活性的蛋白質(zhì)類別。表征這些蛋白質(zhì)類別和編碼它們的多核苷酸的一種方法是通過多核苷酸在一系列特定條件下與示例核苷酸序列(其互補物和/或來自任一鏈的探針)雜交的能力和/或其使用來自示例序列的引物通過PCR被擴增的能力來定義多核苷酸。有許多獲得本發(fā)明用途的蛋白質(zhì)的方法。例如，可以用本文所公開蛋白質(zhì)的抗體從蛋白質(zhì)混合物中鑒定和分離其他蛋白質(zhì)。具體的，可以針對蛋白質(zhì)中與其他相關(guān)蛋白質(zhì)相比最保守或最特殊的部分產(chǎn)生抗體。接著可使用這些抗體通過免疫沉淀、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)或免疫印跡來具體鑒定具有特征活性的等價蛋白質(zhì)?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)方案便利的制備針對本文公開蛋白質(zhì)、針對等價蛋白質(zhì)或針對這些蛋白質(zhì)的片段的抗體。這些抗體是本發(fā)明的一個方面。本發(fā)明的抗體包括單克隆抗體和多克隆抗體，優(yōu)選針對示例或建議蛋白質(zhì)產(chǎn)生。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易認(rèn)識到，可以從多種來源獲得本發(fā)明的蛋白質(zhì)(和基因)。由于已知完整的除草劑降解操縱子除了整合在基因組中以外，還編碼在可轉(zhuǎn)座元件如質(zhì)粒上，因此可以從多種微生物(如包括重組和/或野生型細菌)獲得本發(fā)明的蛋白質(zhì)。Firmicutes和Proteobacteria目的其他成員和具有已知的rdpA的特定屬如Sphingobium、Delftia、Rodoferax和Comamonas可用作來源分離物。可以通過本領(lǐng)域所熟知的方案產(chǎn)生細菌分離物的突變體。例如，可以通過分離物的甲基磺酸乙酯(EMS)誘變來獲得不產(chǎn)孢子突變體。可以通過本領(lǐng)域熟知的方案使用紫外光和亞硝基胍產(chǎn)生突變體?！皝碜浴被颉暗米浴睂ο蠓蛛x物指該蛋白質(zhì)(或相似的蛋白質(zhì))可得自該分離物或其他一些來源，如其他細菌菌株或植物?！爱a(chǎn)生自”也具有這一含義，并包括可從經(jīng)修飾用于(例如)在植物中表達的給定類型的細菌獲得的蛋白質(zhì)。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，在細菌基因和蛋白質(zhì)公開后就可以設(shè)計植物以產(chǎn)生該蛋白質(zhì)?？梢允褂帽疚墓_的多核苷酸和/或氨基酸序列制備抗體制劑、核酸探針(DNA、RNA或PNA)等，并用于從其他(天然)來源篩選和回收其他蛋白質(zhì)基因?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)克隆和測序本文所述蛋白質(zhì)和基因。其他信息可見于本文引入為參考的Sambrook等，1989。多核苷酸和探針。本發(fā)明還提供編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的核苷酸序列。本發(fā)明還提供鑒定和表征具有所需除草劑活性的蛋白質(zhì)的基因的方法。在一個實施方案中，本發(fā)明提供可作為雜交探針和/或PCR技術(shù)的引物使用的獨有核苷酸序列。引物產(chǎn)生可用于鑒定、表征和/或分離特定目的基因的特征性基因片段。本發(fā)明的核苷酸序列編碼與先前已描述蛋白質(zhì)不同的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的多核苷酸序列可用于形成完整“基因”，以在所需宿主細胞中編碼蛋白質(zhì)或肽。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員容易了解，可以如本領(lǐng)域所熟知的，在目的宿主中將本發(fā)明的多核苷酸適當(dāng)?shù)胤胖糜趩幼拥目刂浦?。基因表達和暫時/組織特異性表達的水平可極大的影響本發(fā)明的應(yīng)用。一般而言，降解基因蛋白質(zhì)較高水平的表達會引起底物(本文中為靶除草劑)更快更完全的降解。除非高表達對植物健康具有繼發(fā)的負影響，否則需要啟動子以高水平表達靶基因。為了在全部生長階段中完全保護植物，一般希望AAD-1基因在所有組織中組成型表達。然而，也可以使用營養(yǎng)生長表達抗性基因，這允許在植物中使用靶除草劑進行雜草控制，接著通過在開花期使用來控制靶作物的有性生殖。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，DNA一般以雙鏈形式存在。在這種排列下，一條鏈與另一條鏈互補，反之亦然。當(dāng)DNA在(例如)植物中復(fù)制時產(chǎn)生了額外的互補DNA鏈。本領(lǐng)域中經(jīng)常使用“編碼鏈”指代與反義鏈結(jié)合的鏈。mRNA轉(zhuǎn)錄自DNA的“反義”鏈?！坝辛x”或“編碼”鏈具有一連串密碼子(密碼子是可以作為三殘基單位閱讀以指定特定氨基酸的三個核苷酸)，所述密碼子可以作為開放讀碼框(ORF)閱讀以形成目的蛋白質(zhì)或多肽。為在體內(nèi)產(chǎn)生蛋白質(zhì)，一般將DNA鏈轉(zhuǎn)錄成用作蛋白質(zhì)模板的mRNA互補鏈。因此，本發(fā)明包括附帶的序列列表中所示的示例多核苷酸和/或等價物(包括互補鏈)的用途。與示例DNA功能性等價的RNA和PNA(肽核酸)也包含于本發(fā)明中。在本發(fā)明的一個實施方案中，可以在使微生物高度增殖的條件下培養(yǎng)細菌分離物。在處理微生物以提供單鏈基因組核酸后，可以用本發(fā)明的引物與DNA接觸并進行PCR擴增。目的基因的特征性片段將被該操作擴增，從而鑒定目的基因的存在。本發(fā)明的其他方面包括使用本文公開的方法和核苷酸序列鑒定的基因和分離物。所鑒定的基因編碼本發(fā)明的除草劑抗性蛋白?？梢酝ㄟ^如使用寡核苷酸探針鑒定和獲得本發(fā)明的蛋白質(zhì)和基因。這些探針為可檢測的核苷酸序列，所述核苷酸序列由于適當(dāng)?shù)臉?biāo)記或如國際申請No.WO93/16094所述使其具有固有的熒光性而可被檢測。探針(和本發(fā)明的多核苷酸)可以是DNA、RNA或PNA。除了腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U，RNA分子中)之外，本發(fā)明的合成探針(和多核苷酸)還可以含有次黃嘌呤核苷(能與全部四種堿基配對的中性堿基，有時用于在合成探針中代替全部四種堿基的混合物)。因此，當(dāng)本文中提到合成的簡并寡核苷酸時一般使用“n”，“n”可以是G、A、T、C或次黃嘌呤核苷。本文使用的多義密碼子與提交本申請的標(biāo)準(zhǔn)IUPAC命名約定一致(如R為A或G、Y為C或T等)。如本領(lǐng)域所熟知，如果探針分子與核酸樣品雜交，可以合理的假設(shè)探針和樣品具有顯著同源性/相似性/同一性。優(yōu)選地，首先進行多核苷酸雜交，之后使用本領(lǐng)域所熟知的技術(shù)在低、中或高嚴(yán)格條件下進行洗滌，如Keller，G.H.，M.M.Manak(1987)《DNAProbes》，Press，NewYork，NY，169-170頁中所述。例如，如文中所述可以通過首先在室溫下用2×SSC(標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鹽水)/0.1％SDS(十二烷基硫酸鈉)洗滌15分鐘來得到低嚴(yán)格條件。一般進行兩次洗滌。可以通過降低鹽濃度和/或通過提高溫度得到較高的嚴(yán)格度。例如，在上述洗滌之后可以接著在室溫下兩次用0.1×SSC/0.1％SDS洗滌15分鐘，然后在55℃用0.1×SSC/0.1％SDS接著洗滌30分鐘。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，這些溫度可以與本文公開的其他雜交和洗滌程序一起使用(例如可以用SSPE代替SSC作為鹽使用)。可以通過向445ml水中加入50ml20×SSC和5ml10％SDS制備2×SSC/0.1％SDS。可以通過組合NaCl(175.3g/0.150M)、檸檬酸鈉(88.2g/0.015M)和1升水并接著用10NNaOH調(diào)整pH至7.0來制備20×SSC?？梢酝ㄟ^將10gSDS溶解到50ml高壓滅菌水中、稀釋到100ml來制備10％SDS并分成等分試樣。檢測探針提供了以已知方式測定是否保持了雜交的方法。這種探針分析提供了鑒定本發(fā)明的本發(fā)明基因的快速方法?？梢允褂肈NA合成儀和標(biāo)準(zhǔn)程序合成本發(fā)明用作探針的核苷酸片段。這些核苷酸片段還可以用作PCR引物以擴增本發(fā)明的基因?？梢杂梅肿拥碾s交特征定義本發(fā)明的多核苷酸。因此本發(fā)明包括與本文示例的多核苷酸雜交的多核苷酸(和/或其互補物、優(yōu)選其完整互補物)。即，定義基因(和其編碼的蛋白質(zhì))的一種方法是通過其與已知或特別示例的基因(在本文指定的任意條件下)雜交的能力。本文使用的“嚴(yán)格”雜交條件指得到與本應(yīng)用中所使用條件相同或大致相同程度雜交特異性的條件。具體地，通過標(biāo)準(zhǔn)方法進行固定在Southern印跡上的DNA與32p標(biāo)記的基因特異性探針的雜交(參閱如Maniatis等，J)。一般在允許檢測靶序列的條件下進行雜交和其后的洗滌。對于雙鏈DNA基因探針，在6×SSPE、5×Denhardt溶液、0.1％SDS、0.1mg/ml變性DNA中在DNA雜交體解鏈溫度(Tm)以下20-25℃進行過夜雜交。按下式描述解鏈溫度(Beltz等，1983)Tm＝81.5℃+16.6Log[Na+]+0.41(G+C％)-0.61(甲酰胺％)-600/雙鏈體長度(堿基對)一般如下述進行洗滌(1)在1×SSPE、0.1％SDS中室溫15分鐘洗滌兩次(低嚴(yán)格洗滌)。(2)在0.2×SSPE、0.1％SDS中在Tm-20℃15分鐘洗滌一次(中度嚴(yán)格洗滌)。對于寡核苷酸探針，在6×SSPE、5×Denhardt溶液、0.1％SDS、0.1mg/ml變性DNA中在雜交體解鏈溫度(Tm)以下10-20℃進行過夜雜交。按下式確定寡核苷酸探針的TmTm(℃)＝2(T/A堿基對數(shù))+4(G/C堿基對數(shù))(Suggs等，1981)。一般如下述進行洗滌(1)在1×SSPE、0.1％SDS中室溫15分鐘洗滌兩次(低嚴(yán)格洗滌)。(2)在0.2×SSPE、0.1％SDS中在Tm-20℃15分鐘洗滌一次(中度嚴(yán)格洗滌)。一般可以改變鹽和/或溫度以改變嚴(yán)格度。對于長度＞70堿基左右的標(biāo)記DNA片段，可以使用以下條件低1或2×SSPE，室溫低1或2×SSPE，42℃中0.2×或1×SSPE，65℃高0.1×SSPE，65℃。雙鏈體的形成和穩(wěn)定依賴于雜交體兩條鏈間的顯著互補性，且如上文所提到的，某種程度的錯配是允許的。因此，本發(fā)明的探針序列包括所述序列的突變(單鏈和雙鏈)、缺失、插入及其組合，其中所突變、插入和缺失允許與目的靶多核苷酸形成穩(wěn)定的雜交體?？梢砸远喾N方法在給定的多核苷酸序列中產(chǎn)生突變、插入和缺失，這些方法為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所共知。其他方法可能在將來逐漸被了解。PCR技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是核苷酸序列的引發(fā)式的重復(fù)性酶合成。此方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知并普遍使用(參閱Mullis，U.S.專利No.4,683,195、4,683,202和4,800,159、Saiki等，1985)。PCR是基于目的DNA片段的酶擴增，所述DNA片段兩側(cè)為與靶序列相反鏈雜交的兩個寡核苷酸引物。引物優(yōu)選在3’末端彼此指向。模板熱變性、引物與其互補序列退火和用DNA聚合酶延伸退火引物的重復(fù)循環(huán)引起PCR引物5’末端所定義片段的延伸。每一引物的延伸產(chǎn)物可作為其他引物的模板，因此每個循環(huán)基本上倍增前一循環(huán)中產(chǎn)生的DNA片段數(shù)量。這引起特定靶片段的指數(shù)積累，可在幾小時內(nèi)多達數(shù)百萬倍。通過使用熱穩(wěn)定的DNA聚合酶(如分離自嗜熱水生菌(Thermusaquaticus)的Taq聚合酶)可以完全自動地完成擴增過程?？梢允褂玫钠渌笧楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員所共知。示例DNA序列或其片段可以用作PCR擴增的引物。在PCR擴增中，引物和模板間某種程度的錯配是可以接受的。因此，示例引物的突變、缺失和插入(特別是在5’末端加入核苷酸)在本發(fā)明的范圍內(nèi)?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法在給定的引物中產(chǎn)生突變、插入和缺失?；蚝偷鞍踪|(zhì)的修飾本發(fā)明的基因可以與其他基因和蛋白質(zhì)融合以產(chǎn)生嵌合或融合蛋白。本發(fā)明的有用基因和蛋白質(zhì)不僅包括具體示例的全長序列，還包括這些序列的部分、區(qū)段和/或片段(包括臨近片段和與全長分子相比內(nèi)部和/或末端缺失)、其變體、突變體、嵌合體和融合物。只要保留所需的功能活性，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以具有替換的氨基酸。“變體”基因含有編碼具有與示例蛋白質(zhì)等價或相似的活性的相同蛋白質(zhì)或等價蛋白質(zhì)的核苷酸序列。術(shù)語“變體蛋白”和“等價蛋白質(zhì)”指對靶害蟲具有相同或基本相同的生物/功能活性和與示例蛋白質(zhì)等價的序列的蛋白質(zhì)。本文所使用的“等價”序列指含有提高或不對活性產(chǎn)生顯著不利影響的氨基酸替換、缺失、添加或插入的序列。保留活性的片段也包含于本發(fā)明中。保留了如示例蛋白質(zhì)相應(yīng)片段的相同或相似功能或活性的片段和其他等價物在本發(fā)明的范圍內(nèi)?？梢詾榱烁鞣N目的(如(不嚴(yán)重/顯著降低蛋白質(zhì)功能活性地)提高(或降低)蛋白質(zhì)的蛋白酶穩(wěn)定性、去除或加入限制性位點等等)產(chǎn)生變化，如氨基酸替代或添加。例如，可以使用產(chǎn)生點突變的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)便利地構(gòu)建基因的變異。另外，如U.S.專利No.5,605,793描述了在隨機或聚焦破碎后使用DNA重組裝產(chǎn)生額外的分子多樣性的方法。這可稱為基因“改組”，一般包括混合兩種或更多不同DNA分子的(所需大小的)片段，接著重復(fù)若干輪的復(fù)性。這可以改進起始基因所編碼蛋白質(zhì)的活性。結(jié)果為具有改進的活性、改變的底物特異性、提高的酶穩(wěn)定性、改變的立體特異性或其他特征的嵌合蛋白。得到并檢查目的蛋白質(zhì)的原子3D(三維)坐標(biāo)和晶體結(jié)構(gòu)之后可設(shè)計并靶向“改組”。因此，可以將“聚焦的改組”針對于修飾理想的蛋白質(zhì)的某些片段，如表面暴露的片段，并優(yōu)選不是與蛋白質(zhì)折疊和基本的3D結(jié)構(gòu)完整性相關(guān)的內(nèi)部片段?？梢允褂米凅w基因產(chǎn)生變體蛋白質(zhì)，可以使用重組宿主產(chǎn)生變體蛋白質(zhì)。使用這些“基因改組”技術(shù)可以構(gòu)建含有本文示例的任何序列中任何5、10或20個連續(xù)殘基(氨基酸或核苷酸)的等價基因或蛋白質(zhì)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的，可以調(diào)整基因改組技術(shù)以獲得具有如與任何示例或建議序列(或其互補物(完整互補物))中(相同大小)的片段相對應(yīng)的3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、183、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、219、220、221、222、223、224、226、227、228、229、230、231、232、235、236、237、238、239、240、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、253、254、255、256、258、259、260、261、262、263、264、265、266、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、282、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500個連續(xù)殘基(氨基酸或核苷酸)的等價物。類似大小的片段特別是保守區(qū)的片段也可以作為探針和/或引物。可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序使用市售的外切核酸酶或內(nèi)切核酸酶產(chǎn)生全長基因的片段。例如，可以使用酶如(Bal31)或定向誘變從這些基因的末端系統(tǒng)地切除核苷酸。還可以使用多種限制性酶獲得編碼活性片段的基因?？梢允褂玫鞍酌钢苯荧@得這些蛋白質(zhì)的活性片段。如本文所公開的，可以截短毒素而仍保留功能活性，這也在本發(fā)明的范圍內(nèi)?！敖囟痰牡鞍踪|(zhì)”指蛋白質(zhì)的部分可被切除，并在切除后仍保留并表現(xiàn)活性?？梢酝ㄟ^多種蛋白酶進行切割。另外，可以使用分子生物學(xué)技術(shù)產(chǎn)生有效切割的蛋白質(zhì)，其中通過用限制性內(nèi)切核酸酶消化或本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用的其他技術(shù)去除編碼所述蛋白質(zhì)的DNA堿基。截短后，可以在異源系統(tǒng)(如大腸桿菌、桿狀病毒、基于植物的病毒系統(tǒng)、酵母等)中表達所述蛋白質(zhì)，然后置于本文公開的昆蟲實驗中測定活性。如本領(lǐng)域所熟知，可以成功地產(chǎn)生小于完整的全長序列而保留功能活性的截短蛋白質(zhì)。例如，可以以截短(核心蛋白質(zhì))形式使用B.t.蛋白質(zhì)(參閱如Hofte等(1989)和Adang等，(1985))。本文所使用的術(shù)語“蛋白質(zhì)”還可包括功能活性的截短物。在一些情況下(特別是植物中的表達)，使用編碼截短蛋白質(zhì)的截短基因可能是有利的。優(yōu)選的截短基因一般編碼全長蛋白質(zhì)的40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、82、83、84、86、87、88、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％。本發(fā)明的某些毒素已在本文中具體示例。這些毒素僅是本發(fā)明毒素的范例，顯然本發(fā)明包括具有與示例毒素相同或相似活性的變體或等價蛋白質(zhì)(和編碼其等價物的核苷酸序列)。等價蛋白質(zhì)與示例蛋白質(zhì)具有氨基酸相似性(和/或同源性)。氨基酸同一性一般至少為60％，優(yōu)選至少為75％，更優(yōu)選至少為80％，甚至更優(yōu)選至少為90％并可以至少為95％。還可以通過更具體的同一性和/或相似性范圍定義本發(fā)明優(yōu)選的蛋白質(zhì)。例如，與本文示例或建議的序列相比，同一性和/或相似性可以為49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、82、83、84、86、87、88、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％。上文列出的任意數(shù)字可用于定義上限和下限。除非另有說明，使用如Karlin和Altschul(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA905873-5877中所改良的Karlin和Altschul(1990)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA872264-2268的算法測定本文所使用的兩個核酸的序列同一性和/或相似性百分比。這樣的算法整合在Altschul等(1990)，J.Mol.Biol.215402-410的NBLAST和XBLAST程序中。使用NBLAST程序進行BLAST核苷酸搜索，評分＝100、字寬＝12?？梢匀鏏ltschul等(1997)，Nucl.AcidsRes.253389-3402中所述使用GappedBLAST。使用BLAST和GappedBLAST程序時，使用程序(NBLAST和XBLAST)各自的默認(rèn)參數(shù)。參閱NCBI/NIH網(wǎng)址。使用默認(rèn)參數(shù)用VectorNTISuite8(InforMax，Inc.，NorthBethesda，MD，U.S.A)中的AlignX函數(shù)得到用于比較目的的缺口比對。它們是缺口打開罰分15、缺口延伸罰分6.66和缺口分離罰分范圍8。還可以改變蛋白質(zhì)的多種特性和三維特征而不對蛋白質(zhì)的毒素活性/功能性產(chǎn)生不利影響。保守性氨基酸替換是可以接受的/可以產(chǎn)生而不對分子的三維構(gòu)型產(chǎn)生不利影響。氨基酸可按以下分類非極性、極性不帶電荷、堿性和酸性。只要替換不損害化合物的生物活性，則保守性替換在本發(fā)明的范圍內(nèi)，在所述保守性氨基酸替代中，一類氨基酸被同一類型的另一氨基酸替換。表5提供屬于每一類的氨基酸實例列表。在一些情況下，還可以進行非保守性替環(huán)。然而，優(yōu)選的替換不顯著降低蛋白質(zhì)的功能/生物活性。本文提到的“分離的”多核苷酸和/或“純化的”蛋白質(zhì)是指這些分子不伴隨有與其天然共存的其他分子。因此，提到“分離的”和/或“純化的”表示與本文所述的“人為”相關(guān)。例如，放入植物進行表達的本發(fā)明細菌“基因”是“分離的多核苷酸”。同樣，植物所產(chǎn)生的來自細菌蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)是“分離的蛋白質(zhì)”。由于遺傳密碼的簡并性/冗余性，多種不同的DNA序列都可以編碼本文公開的氨基酸序列。產(chǎn)生編碼相同或基本相同蛋白質(zhì)的替代DNA序列在受本領(lǐng)域訓(xùn)練的技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。這些變體DNA序列在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在下文標(biāo)題為“用于植物表達的序列優(yōu)化”的章節(jié)中對此也有更詳細的描述。用于植物表達的序列優(yōu)化。為了在植物中得到異源基因的高表達，可能優(yōu)選重新設(shè)計所述基因以使其在植物細胞(的胞質(zhì))中更有效的表達。玉米就是這樣的一種植物，其中在轉(zhuǎn)化前重新設(shè)計異源基因以提高其在所述植物中的表達水平可能是優(yōu)選的。因此，在設(shè)計編碼細菌毒素的基因中額外的步驟是使用與靶植物序列(雙子葉植物或單子葉植物)更接近的密碼子偏好重新改造異源基因以得到最優(yōu)表達。還可以優(yōu)化序列以在本文其他處討論的更多具體類型植物中的任意一種中進行表達。轉(zhuǎn)基因宿主可以將本發(fā)明的蛋白質(zhì)編碼基因引入多種微生物或植物宿主中。本發(fā)明包括轉(zhuǎn)基因植物細胞和轉(zhuǎn)基因植物。優(yōu)選的植物(和植物細胞)為玉米、擬南芥、煙草、大豆、棉花、蕓苔、稻、小麥、草坪草和牧草等等。還可以根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生其他類型的轉(zhuǎn)基因植物，如水果、蔬菜和樹木。更一般的，雙子葉植物和/單子葉植物可用在本發(fā)明的多個方面中。在優(yōu)選的實施方案中，基因的表達直接或間接引起目的蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)的產(chǎn)生(和保持)。植物可以以這種方式得到除草劑抗性。這些宿主可以指轉(zhuǎn)基因、重組、轉(zhuǎn)化和/或轉(zhuǎn)染的宿主和/或細胞。在本發(fā)明的一些方面中(例如克隆和制備目的基因)，可以借助本發(fā)明的公開內(nèi)容根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)產(chǎn)生和使用微生物(優(yōu)選細菌)細胞。轉(zhuǎn)染了本發(fā)明多核苷酸的植物細胞可以再生為整個植株。本發(fā)明包括細胞培養(yǎng)物，包括組織細胞培養(yǎng)物、液體培養(yǎng)物和植物培養(yǎng)物。由本發(fā)明植物所產(chǎn)生和/或用于再生本發(fā)明植物的種子也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。其他植物組織和部分也包括在本發(fā)明中。本發(fā)明同樣包括產(chǎn)生含有本發(fā)明多核苷酸的植物或細胞的方法。產(chǎn)生這些植物的一種優(yōu)選方法為通過種植本發(fā)明的種子。插入基因以形成轉(zhuǎn)基因宿主。本發(fā)明的一個方面是用表達本發(fā)明蛋白質(zhì)的本發(fā)明多核苷酸轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染植物、植物細胞和其他宿主細胞。以這種方式轉(zhuǎn)化的植物可以獲得對多種作用模式的多種除草劑的抗性?？梢允褂枚喾N方法在允許穩(wěn)定保持和表達基因的條件下將所需蛋白質(zhì)的基因引入靶宿主。這些方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，并描述于如美國專利No.5,135,867。含有AAD-1多核苷酸的載體包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。例如，大量克隆載體可用于將外來基因插入到高等植物中，所述載體含有大腸桿菌復(fù)制系統(tǒng)和允許選擇轉(zhuǎn)化的細胞的標(biāo)記物。載體包括如pBR322、pUC系列、M13mp系列、pACYC184等。因此，可以在合適的限制性位點將編碼蛋白質(zhì)的序列插入載體。得到的質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化進大腸桿菌中。在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌細胞，然后收獲并裂解。通過純化從基因組DNA中回收質(zhì)粒。作為分析方法，一般進行序列分析、限制性分析、電泳和其他生物化學(xué)-分子生物學(xué)方法。每次操作之后，可以切開所使用的DNA序列并與下一個DNA序列連接。每個質(zhì)粒序列都可以克隆到同一個或其他質(zhì)粒中。取決于將所需基因插入到植物中的方法，其他DNA序列可能是必要的。例如，如果使用Ti或Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物細胞，則必須連接Ti或Ri質(zhì)粒T-DNA序列的至少右側(cè)邊界(但常為右側(cè)和左側(cè)邊界)作為待插入基因的側(cè)翼區(qū)域。T-DNA用于轉(zhuǎn)化植物細胞的用途已在EP120516、Hoekema(1985)、Fraley等，(1986)和An等(1985)中有深入的研究和詳細的描述。大量技術(shù)可用于將DNA插入植物宿主細胞。這些技術(shù)包括使用根瘤農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)作為轉(zhuǎn)化劑用T-DNA轉(zhuǎn)化、融合、注射、生物射彈(微粒轟擊)、碳化硅頸須、氣溶膠柱、PEG或電穿孔以及其他可能的方法。如果用農(nóng)桿菌進行轉(zhuǎn)化，必須將待插入的DNA克隆進特殊的質(zhì)粒中，即中間載體或二元載體中。由于與T-DNA中序列同源的序列，中間載體可以通過同源重組整合進Ti或Ri質(zhì)粒。Ti或Ri質(zhì)粒還含有轉(zhuǎn)移T-DNA所必需的vir區(qū)。中間載體不能在農(nóng)桿菌中自我復(fù)制?？梢酝ㄟ^輔助質(zhì)粒(綴合)將中間載體轉(zhuǎn)移到根瘤農(nóng)桿菌中。二元載體在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中都可以自我復(fù)制。它們含有選擇標(biāo)記物基因和接頭或多聚接頭，兩側(cè)為右和左T-DNA邊界區(qū)。它們可以直接轉(zhuǎn)化進農(nóng)桿菌中(Holsters等，1978)。作為宿主的農(nóng)桿菌含有攜帶vir區(qū)的質(zhì)粒。vir區(qū)是將T-DNA轉(zhuǎn)移進植物細胞所必需的。還可以含有額外的T-DNA。將這樣轉(zhuǎn)化的細菌用于轉(zhuǎn)化植物細胞?？梢杂欣赜酶鲛r(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌培養(yǎng)植物外植體，以將DNA轉(zhuǎn)移進植物細胞。然后可以在合適的培養(yǎng)基中從感染的植物材料(如葉碎片、莖節(jié)段、根以及原生質(zhì)體或懸浮培養(yǎng)的細胞)再生完整植物，所述培養(yǎng)基可以含有用于選擇的抗生素或殺蟲劑。然后可以測試這樣得到的植物中插入DNA的存在。在注射和電穿孔的情況下質(zhì)粒沒有特殊的要求?？梢允褂闷胀ㄙ|(zhì)粒，如pUC衍生物。轉(zhuǎn)化細胞以通常的方式在植物中生長。它們可以形成生殖細胞并將轉(zhuǎn)化的性狀傳遞到子代植物?？梢砸哉７绞脚囵B(yǎng)這些植物并與具有同一轉(zhuǎn)化遺傳因子或其他遺傳因子的植物雜交。得到的雜合個體具有相應(yīng)的表型特性。在本發(fā)明優(yōu)選的一些實施方案中，從插入植物基因組的轉(zhuǎn)錄單位表達編碼細菌蛋白質(zhì)的基因。優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)錄單位是重組載體，所述重組載體能夠穩(wěn)定整合進植物基因組，并使得可以選擇表達編碼蛋白質(zhì)的mRNA的轉(zhuǎn)化植物株系。一但整合進基因組，則插入DNA在其中是相對穩(wěn)定的(并不再釋放出來)。它一般包含賦予轉(zhuǎn)化植物細胞對殺蟲劑或抗生素(如卡那霉素、G418、博來霉素、潮霉素或氯霉素等)的抗性的選擇標(biāo)記物。植物選擇標(biāo)記物一般還提供對多種除草劑(如glufosinate(PAT)、草甘膦(EPSPS)、imazethyapyr(AHAS)及許多其他除草劑)的抗性。單獨使用的標(biāo)記物應(yīng)允許從不含有插入DNA的細胞中選擇轉(zhuǎn)化細胞。目的基因在植物中優(yōu)選由組成型或誘導(dǎo)型啟動子表達。一但表達之后，mRNA翻譯成蛋白質(zhì)，從而將目的氨基酸摻入蛋白質(zhì)中。在植物中表達的編碼蛋白質(zhì)的基因可以在組成型啟動子、組織特異性啟動子或誘導(dǎo)型啟動子的控制下。存在若干將外來重組載體引入植物細胞和獲得穩(wěn)定保持和表達引入基因的方法。這些技術(shù)包括將包裹在微粒上的遺傳物質(zhì)直接引入細胞(Cornell的U.S.專利No.4,945,050和DowElanco，現(xiàn)在的DowAgroSciences，LLC的U.S.專利No.5,141,131)。此外，可以使用農(nóng)桿菌技術(shù)轉(zhuǎn)化植物，參閱UniversityofToledo的U.S.專利No.5,177,010；TexasA&M的5,104,310；歐洲專利申請0131624B1；Schilperoot的歐洲專利申請120516、159418B1和176112；Schilperoot的U.S.專利No.5,149,645、5,469,976、5,464,763和4,940,838和4,693,976；MaxPlanck的歐洲專利申請116718、290799、320500；JapanTobacco的歐洲專利申請604662和627752和U.S.專利No.5,591,616；CibaGeigy，現(xiàn)在的Novartis的歐洲專利申請0267159和0292435和U.S.專利No.5,231,019；Calgene的U.S.專利No.5,463,174和4,762,785和Agracetus的U.S.專利No.5,004,863和5,159,135。其他轉(zhuǎn)化技術(shù)包括頸須技術(shù)。參閱Zeneca的U.S.專利No.5,302,523和5,464,765。也可以使用電穿孔技術(shù)轉(zhuǎn)化植物。參閱BoyceThompsonInstitute的WO87/06614；Dekalb的U.S.專利No.5,472,869和5,384,253和PlantGeneticSystems的WO92/09696和WO93/21335。另外，也可以用病毒載體產(chǎn)生表達目的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因植物。例如，可以用MycogenPlantScience和Ciba-Giegy(現(xiàn)在的Syngenta)的U.S.專利No.5,569,597以及Biosource(現(xiàn)在的LargeScaleBiology)的U.S.專利No.5,589,367和5,316,931中所述的方法用病毒載體轉(zhuǎn)化單子葉植物。如前述，將DNA構(gòu)建體引入植物宿主的方法對于本發(fā)明不是關(guān)鍵的。任何提供有效轉(zhuǎn)化的方法都可以使用。例如，本文描述了多種植物細胞轉(zhuǎn)化的方法，包括使用Ti或Ri質(zhì)粒等進行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。在許多情況下，需要用T-DNA邊界與用于轉(zhuǎn)化的載體的一側(cè)或兩側(cè)(更具體地為右側(cè))相連。盡管T-DNA邊界也可見用于其他轉(zhuǎn)化模式，但在使用根瘤農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌作為轉(zhuǎn)化模式時特別有用。在將農(nóng)桿菌用于植物細胞轉(zhuǎn)化時，可以使用能引入宿主以與宿主中存在的T-DNA或Ti或Ri質(zhì)粒同源重組的質(zhì)粒?？梢酝ㄟ^電穿孔、三親雜交和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的用于轉(zhuǎn)化革蘭氏陰性菌的其他技術(shù)進行載體導(dǎo)入。載體轉(zhuǎn)化進農(nóng)桿菌宿主的方式對于本發(fā)明不是關(guān)鍵的。含有用于重組的T-DNA的Ti或Ri質(zhì)?？梢阅軌蚧虿荒芤鸶[大成瘤(gallformation)，只要所述宿主中存在vir基因，這對本發(fā)明就不是關(guān)鍵的。將農(nóng)桿菌用于轉(zhuǎn)化時，在一些情況下將T-DNA邊界內(nèi)的表達載體插入廣譜載體如pRK2或其衍生物中，如本文引入作為參考文獻的Ditta等，PNASUSA(1980)777347-7351和EPO0120515中所述。表達構(gòu)建體和T-DNA內(nèi)包括一個或多個如本文所述允許選擇轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌和轉(zhuǎn)化植物細胞的標(biāo)記物。使用的具體標(biāo)記物對于本發(fā)明并不重要，優(yōu)選的標(biāo)記物取決于所使用的宿主和構(gòu)建體。為了用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物細胞，可以將外植體與轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌組合并孵育足夠的時間以允許其轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后，通過用適當(dāng)抗生素的選擇殺死農(nóng)桿菌，并用適當(dāng)?shù)倪x擇培養(yǎng)基培養(yǎng)植物細胞。一但形成愈傷組織，可以根據(jù)植物組織培養(yǎng)和植物再生領(lǐng)域已知的方法通過使用適當(dāng)?shù)闹参锛に卮龠M芽形成。然而，愈傷組織中間期并不總是必要的。芽形成以后，可以將所述植物細胞轉(zhuǎn)移到促進根形成的培養(yǎng)基，從而完成植物再生?？梢耘囵B(yǎng)植物產(chǎn)生種子，所述種子可以用于建立將來的世代。不考慮轉(zhuǎn)化技術(shù)，優(yōu)選將編碼細菌毒素的基因整合進基因轉(zhuǎn)移載體中，通過在載體中包含植物啟動子調(diào)節(jié)元件以及3’非翻譯轉(zhuǎn)錄終止區(qū)(如Nos等)使所述轉(zhuǎn)移載體適于在植物細胞中表達該基因。除了用于轉(zhuǎn)化植物的大量技術(shù)之外，與外來基因接觸的組織類型也可以是多樣的。這些組織包括但不僅限于胚胎發(fā)生組織、I、II、和III型愈傷組織、下胚軸、分生組織、根組織、用于韌皮部表達的組織等。使用本文所述的適當(dāng)技術(shù)幾乎可以在去分化中轉(zhuǎn)化幾乎所有的植物組織。如上文所述，需要時可以使用多種選擇標(biāo)記物。具體標(biāo)記物的選擇由技術(shù)人員決定，但是任何以下的選擇標(biāo)記物以及本文未列出的能發(fā)揮選擇標(biāo)記物功能的其他基因都可以使用。這些選擇標(biāo)記物包括但不僅限于編碼對抗生素卡那霉素、新霉素和G418的抗性的轉(zhuǎn)座子Tn5氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(AphII)以及編碼對草甘磷、潮霉素、氨甲喋呤、草銨磷(雙丙氨磷或glufosinate)、咪唑啉酮、磺酰脲和三唑嘧啶除草劑(如氯磺隆、溴草腈、茅草枯等)抗性或耐性的基因。除了選擇標(biāo)記物以外，可能需要使用報道基因。在一些情況下，報道基因可以與或不與選擇標(biāo)記物一起使用。報道基因一般是在受體生物或組織中不存在的基因，一般編碼引起一些表型變化或酶特性的蛋白質(zhì)。Weising等.1998中提供了這些基因的實例。優(yōu)選的報道基因包括大腸桿菌uidA基因座的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、來自大腸桿菌Tn9的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因、來自生物發(fā)光水母維多利亞多管水母(Aequoreavictoria)的綠色熒光蛋白和來自螢火蟲Photinuspyralis的熒光素酶基因。接著可以在所述基因引入受體細胞后的適當(dāng)時間實施檢測報道基因表達的試驗。優(yōu)選的這些方法使用如Jefferson等1987所述的大腸桿菌uidA基因座編碼β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的基因鑒定轉(zhuǎn)化細胞。除了植物啟動子調(diào)節(jié)元件以外，可以在植物細胞中有效地使用來自多種來源的啟動子調(diào)節(jié)元件表達外源基因。例如，可以使用細菌來源的啟動子調(diào)節(jié)元件，如章魚堿合酶啟動子、胭脂堿合酶啟動子、甘露堿合酶啟動子；病毒來源的啟動子，如花椰菜花葉病毒(35S和19S)、35T(再改造的35S啟動子，參閱U.S.專利No.6,166,302，特別是實施例7E)等。植物啟動子調(diào)節(jié)元件包括但不僅限于核酮醣-1，6-二磷酸(RUBP)羧化酶小亞基(ssu)、β-伴大豆球蛋白(conglycinin)啟動子、β-菜豆素啟動子、ADH啟動子、熱休克啟動子和組織特異性啟動子。還可以存在其他元件，如基質(zhì)附著區(qū)、支架附著區(qū)、內(nèi)含子、增強子、多腺苷酸化序列等，從而提高轉(zhuǎn)錄效率或DNA整合。盡管這些元件可能通過影響轉(zhuǎn)錄、mRNA穩(wěn)定性等提供較好的DNA表達或功能，但是它們對DNA功能可能是或不是必需的。這些元件可以如所需包含在DNA中，以得到轉(zhuǎn)化DNA在植物中的優(yōu)化表達。典型元件包括但不僅限于Adh-內(nèi)含子1、Adh-內(nèi)含子6、苜?；ㄈ~病毒外殼蛋白前導(dǎo)序列、玉米線條病毒外殼蛋白前導(dǎo)序列以及其他本領(lǐng)域技術(shù)人員可用的元件。還可以使用組成型啟動子調(diào)節(jié)元件從而指導(dǎo)在所有細胞類型和所有時間的持續(xù)基因表達(如肌動蛋白、泛素、CaMV35S等)。組織特異性啟動子負責(zé)在特定細胞或組織類型(如葉或種子)中的基因表達(如玉米蛋白、油質(zhì)蛋白、油菜籽蛋白、ACP、球蛋白等)，這些也可以使用。啟動子調(diào)節(jié)元件也可以在植物發(fā)育的某些階段有活性(或無活性)以及在植物組織和器官中有活性。這些的實例包括但不僅限于花粉特異性、胚胎特異性、玉米穗絲特異性、棉花纖維特異性、根特異性、種子胚乳特異性或營養(yǎng)期特異性啟動子調(diào)節(jié)元件等。在某些情況下可能需要使用誘導(dǎo)型啟動子調(diào)節(jié)元件，其負責(zé)應(yīng)答于特定信號(如物理刺激(熱休克基因)、光(RUBP羧化酶)、激素(Em)、代謝物、化學(xué)品(四環(huán)素應(yīng)答)和脅迫)的基因表達。還可以使用在植物中發(fā)揮功能的其他所需的轉(zhuǎn)錄和翻譯元件。本領(lǐng)域已知大量植物特異性基因轉(zhuǎn)移載體?；谥参颮NA病毒的系統(tǒng)也可用于表達細菌蛋白質(zhì)。為此，可以將編碼蛋白質(zhì)的基因插入感染目的宿主植物的適當(dāng)植物病毒的外殼啟動子區(qū)。然后可以表達蛋白質(zhì)從而為植物提供對除草劑損害的保護?；谥参颮NA病毒的系統(tǒng)描述于MycogenPlantSciences，Inc.的U.S.專利No.5,500,360和Biosource，現(xiàn)在的LargeScaleBiology的U.S.專利No.5,316,931和5,589,367。本文提到或引用的所有專利、專利申請、臨時申請和出版物整體引入為參考，引用程度不與本說明書的明確教導(dǎo)相沖突。以下為說明本發(fā)明操作實踐的實施例。這些實施例不應(yīng)理解為限制性的。除非另有說明，所有的百分比均以重量計，所有的溶劑混合物比例以體積計。實施例1-鑒定在植物中輸入對2，4-滴抗性的基因的方法作為鑒定在植物中具有除草劑降解活性的基因的方法，可以發(fā)掘現(xiàn)有的公共數(shù)據(jù)庫如NCBI(國家生物技術(shù)信息中心)。為開始此過程，需要有已鑒定為編碼具有所需特征(即α酮戊二酸雙加氧酶活性)的蛋白質(zhì)的基因。接著將此蛋白質(zhì)序列用作BLAST(基本局部比對檢索工具)(Altschul，1997)算法的輸入，以對存儲的可用NCBI蛋白質(zhì)序列進行比較。使用默認(rèn)設(shè)置，此工具返回不同水平的100個以上同源蛋白質(zhì)序列。它們在氨基酸水平的范圍從高同一性(85％-98％)到極低同一性(23％-32％)。通常僅高同源性的序列可預(yù)期保留與輸入序列相似的活性。在這種情況下我們僅選擇具有≤50％的同源性的序列。我們繼續(xù)舉例說明，克隆和重組表達低至27％氨基酸保守性的同系物不僅可用于輸入對計劃內(nèi)的除草劑的商品水平的抗性，還可用于輸入對從未用這些酶測試過的底物的抗性。PCR基因并克隆進pET從NCBI數(shù)據(jù)庫鑒定了與來自真養(yǎng)雷氏菌的tfdA僅有28％氨基酸同一性的單基因(rdpA)(參閱ncbi.nlm.nih.gov站點，登錄號AF516752)。通過首先將數(shù)據(jù)庫中保存的rdpA和tfdA翻譯成蛋白質(zhì)，然后用VectorNTI軟件包中的ClustalW進行多重序列比對來測定同一性百分比。含有rdpA的Sphingobiumherbicidovorans菌株得自ATCC(美國典型培養(yǎng)物保藏中心，菌株號700291)。根據(jù)ATCC方案復(fù)蘇凍干的菌株，并以Dow細菌菌株DB536在20％甘油中保存于-80℃用于內(nèi)部用途。從此冷凍貯液取一菌環(huán)細胞涂在胰蛋白酶大豆瓊脂平板上，并在28℃孵育3天。用一單菌落接種到500ml三角瓶中的100ml胰蛋白酶大豆培養(yǎng)液中，將三角瓶在搖床上以150rpm在28℃孵育過夜。用Qiagen的DNeasy試劑盒(Qiagen目錄號69504)的革蘭氏陰性方案從其中提取總DNA。設(shè)計以下引物以從基因組DNA擴增靶基因，正向5′TCTAGAAGGAGATATACCATGCATGCTGCACTGTCCCCCCTCTCCCAGCG3′[(SEQIDNO1)(加入了XbaI限制性位點和核糖體結(jié)合位點(RBS))]和反向5′CTCGAGTTACTAGCGCGCCGGGCGCACGCCACCGACCG3′[(SEQIDNO2)(加入了額外的終止密碼子和XhoI位點)]。按以下裝配20μl反應(yīng)物MasterMix8μl、ea.引物1μl(50pmole/μl)、gDNA2.5μl、H2O7.5μl。然后按以下條件進行PCR94℃45秒、52℃1.5分鐘、72℃1.5分鐘的30個循環(huán)，接著為72℃5分鐘的終循環(huán)，使用EppendorfMasterTaq試劑盒(Eppendorf目錄號0032002.250)。使用化學(xué)感受態(tài)TOP10F′大腸桿菌作為宿主菌株，按照所包含的方案將得到的約1kb的PCR產(chǎn)物克隆進pCR2.1(Invitrogen目錄號K4550-40)中用于驗證核苷酸序列。挑取10個得到的白色菌落到4mlLuriaBroth+50μ/ml卡那霉素(LBK)中并在37℃攪動生長過夜。使用PromegaWizardPlusSV試劑盒(Promega目錄號A1460)按照所包含的方案從每個培養(yǎng)物提取質(zhì)粒。按照生產(chǎn)商的說明使用M13正向(5′GTAAAACGACGGCCAGT3′)(SEQIDNO16)和反向(5′CAGGAAACAGCTATGAC3′)(SEQIDNO17)引物，用BeckmanCEQQuickStart試劑盒(BeckmanCoulter目錄號608120)進行測序。為了內(nèi)部一致，將此基因序列(SEQIDNO3)及其相應(yīng)蛋白質(zhì)(SEQIDNO9)給予新的一般命名AAD-1(v1)(芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶，芳氧基鏈烷酸酯Dioxygenase)。使用與引物接頭一起加入的位點相應(yīng)的限制性酶(Xba1、Xho1)將AAD-1(v1)從pCR2.1載體中切出并連接進pET280鏈霉素/大觀霉素抗性載體中。接著將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進TOPIOF′大腸桿菌，并涂在LuriaBroth+50μg/ml鏈霉素&大觀霉素(LBS/S)瓊脂平板上。為區(qū)分AAD-1(v1)pET280和pCR2.1pET280連接，挑取約20個分離菌落至6mlLBS/S中，并在37℃搖動培養(yǎng)4小時。然后將每個培養(yǎng)物點到LBK平板上，在37℃孵育過夜。假定在LBK上生長的菌落具有連接進的pCR2.1載體，將其棄去。如前述從剩余的培養(yǎng)物提取質(zhì)粒。給此表達構(gòu)建體命名為pDAB3203。實施例2-表達和測試2.1-HPLC分析以Dow重組菌株DR1878在TOP10F′細胞中將質(zhì)粒pDAB3203保存于-80℃。為進行表達，按照生產(chǎn)商的說明將使用Promega的Wizard試劑盒(Fisher目錄號PR-A1460)純化的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化進BL-21Star(DE3)細胞(Invitrogen目錄號C6010-03)。轉(zhuǎn)化后，將50μl細胞涂在LBS/S瓊脂平板上并在37℃孵育過夜。第二天早上，刮下整個平板上的所有菌落至500ml三角瓶中的100mlLB中并在37℃/200rpm孵育1小時。接著用1mMIPTG誘導(dǎo)基因表達并在30℃/200rpm孵育4小時。將全部100ml培養(yǎng)物以4000rpm離心20分鐘。然后棄去上清液，將沉淀重懸于10ml50mMMOPS中。接著對其進行三輪45秒的超聲處理以裂解細胞。其后將裂解液以15000rpm離心去除細胞碎片。吸出上清液并保存于4℃。為檢查重組表達，將20μl的等分式樣在4％-20％Tris甘氨酸瓊脂(Invitrogen目錄號EC60255)上進行電泳。確認(rèn)表達后，按以下測試酶活性。首先，用PD-10管(Amersham目錄號17-0435-01)除去細胞提取物的等分式樣的鹽分。然后將其用于其后的除草劑酶反應(yīng)。對于每個反應(yīng)，組合2，4-滴(125μg/ml)、[100mMMOPS中的維生素C(1mM)、亞鐵離子(50μM)、α酮戊二酸(1mM)]和細胞提取物(100μl)。接著將此反應(yīng)物在室溫下孵育30分鐘，其后加入0.1NHCl至pH在2和3之間，以終止反應(yīng)。留出一半反應(yīng)體積(約500μl)用于生物測定，剩余的體積用SolidPhaseExtraction管(Fisher目錄號11-131-6)有機提取，用400μl乙腈+0.05％TFA洗脫。接著在HPLC上對提取物測試2，4-滴峰的降低或由2，4-滴降解或修飾引起的任意其他峰的存在。HPLC條件為Luna10μC18(2)250×4.6mm(Phenomenex目錄號00G-4253-E0)，以50％ACN+0.05％TFA50％H2O+0.05％TFA到100％ACN+0.05％TFA運行5分鐘。2.2-除草劑降解的平板測試生物測定植物生物測定用于測定體外的酶促除草劑轉(zhuǎn)化是否引起除草劑活性的伴隨降低。由于測試的除草劑的選擇性性質(zhì)(即，AOPP除草劑控制單子葉植物而生長素除草劑控制雙子葉植物)，分別使用野生型Agrostispalustrisvar.Pencross和擬南芥哥倫比亞變種作為單子葉和雙子葉測試物種。使每個物種在小培養(yǎng)皿中萌發(fā)和生長。在加入1μLTween-20作為濕潤劑的50％商品漂白劑/去離子水(體積/體積)中劇烈搖動(振動臺，250rpm)使擬南芥種子表面滅菌。在無菌管中將漂白劑溶液倒出并用無菌水漂洗三次。以類似的方式將翦股穎種子表面滅菌20分鐘。將每個測試物種的20到30個滅菌種子加入60×15mm培養(yǎng)皿(Falcon1007)中的無菌固體瓊脂平板測試培養(yǎng)基(PTM)[2.5mMKNO3、2.5mMKH2PO4、50mMFeSO4、10mMNaEDTA(pH8.0)、2mMMgSO4、2mMCa(NO3)2、70μMH3BO3、14μMMnCl2、0.5μMCuSO4、1μMZnSO4、0.2μMNaMoO4-2H2O、10μMNaCL、10nMCoCl2-H2O、0.8％(重量/體積)蔗糖、0.4％葡萄糖(重量/體積)]中用于生物測定。再通過加入多至6個劑量的測試除草劑標(biāo)準(zhǔn)品或除草劑-酶測試溶液稀釋液來修飾PTM，以使四倍的濃度增量覆蓋三個數(shù)量級的等級范圍，同時GR50率(50％生長降低)約在范圍的中間。對于除草劑酶測試溶液，在出現(xiàn)任何繼發(fā)的酶降解之前先基于標(biāo)稱濃度測定最大濃度。通過加入3ml熔化的同一組成的PTM、振蕩并凝固使種子均勻分布。密封平板并在無菌條件下在低光生長室(24小時天-1、100μE/m2s1、23℃)中維持7天。分別測量五株隨機選擇的擬南芥和翦股穎植物的根長度或根+嫩枝長度，測定平均長度(未處理對照百分比)和標(biāo)稱除草劑濃度和GR50。此生物測定用于證實由多種農(nóng)學(xué)相關(guān)除草劑oxyalkanoate側(cè)鏈的AAD-1(v1)降解引起的除草劑活性的損失。在一些情況下，HPLC上與母體酸共洗脫的預(yù)期酚產(chǎn)物和該生物測定用作除草劑降解的原始篩選。表6和7表示測試的除草劑底物。*空白載體代表無基因插入片段的大腸桿菌pET載體的細胞裂解液處理。**GR50比衡量酶表達裂解液處理比空白載體處理的除草劑活性損失。數(shù)字≥2認(rèn)為是此測定中檢測除草劑活性損失的閾值。*空白載體代表無基因插入片段的大腸桿菌pET載體的細胞裂解液處理。**GR50比衡量酶的裂解液處理比空白載體處理的除草劑活性損失。數(shù)字≥2認(rèn)為是此測定中檢測除草劑活性損失的閾值。2.3-HPLC結(jié)果從文獻中已知此類雙加氧酶需要作為協(xié)同底物的α酮戊二酸(一般性描述見圖1)和亞鐵離子以結(jié)合活性位點。文獻中的其他實驗已經(jīng)顯示加入維生素C通過維持鐵的還原態(tài)從而防止酶被降解而提高酶活性?；诖讼绕诠ぷ?，在本發(fā)明酶以與此大類酶的其他成員相同的方式工作這一假設(shè)下安排初始測定。令人驚奇地，起始HPLC結(jié)果顯示除了5.5分鐘處降低的2，4-滴峰以外，還在6.1分鐘存在新的峰。這一新峰在對照測定中不存在。為對6.1分鐘處的峰進行初步鑒定，在我們的測定條件下用DCP對照進行實驗，預(yù)期其也在6.1分鐘處洗脫。使用比色測定檢測酚(見實施例3.1)以及質(zhì)譜確認(rèn)此產(chǎn)物的形成。與預(yù)期一致，AAD-1(v1)與此酶類別的其他成員實現(xiàn)相似的反應(yīng)。在生物測定中，這些相同的樣品還在擬南芥平板測定中顯示2，4-滴除草劑活性幾乎完全的喪失(圖2)。不考慮測定的具體條件(即較長的孵育、較多的酶)，HPLC中僅50％-75％的2，4-滴可降解為DCP。事實上，盡管表達了更多的總重組蛋白，用IPTG更長時間的誘導(dǎo)BL-21大腸桿菌僅得到更弱活性的酶。證明了2，4-滴的降解之后，以類似的環(huán)取代(即氧丙酮和氧丙酸)測試其他底物。首先測試的化合物是吡啶類似物fluroxypyr和triclopyr，均為pyridinyloxyacetates。對于這些底物中的任一種均未檢測到酶活性。對去除氟或氨基團的這兩種pyridinyloxyacetates的多種類似物的其他測試中也無降解。然而，有趣的是在2，4-滴的5位置加入氟導(dǎo)致酶降解的幾乎完全喪失(其他結(jié)果見以下章節(jié))。其后使用與2，4-滴相同的條件測試了ACC酶抑制劑吡氟氯禾靈和禾草靈。(在所使用的HPLC條件下相應(yīng)的酚代謝物與母體化合物共洗脫)。這些樣品的生物測定結(jié)果顯示針對吡氟氯禾靈(圖3)和禾草靈的除草劑活性喪失。還通過也用于測試這些化合物的更多樣品的比色測定證實了這些結(jié)果。2.4-除草劑降解的平板測試生物測定生物測定測試結(jié)果確證了表明將2，4-滴溶液與未純化重組AAD-1(v1)提取物孵育后2，4-滴母體喪失的HPLC結(jié)果(圖2)。另外，苯氧丙酸2，4-滴丙酸也被有效降解。除草劑+酶溶液的標(biāo)稱GR50與單獨的除草劑溶液的比值作為酶活性引起的母體除草劑活性喪失的量度。2-3的比值一般對應(yīng)于母體除草劑活性50％-75％的喪失(表6)。酶處理后常不能測定GR50，事實上，沒有可檢測的除草劑活性剩余。如翦股穎平板生物測定中禾本科除草劑活性的幾乎完全降解(圖3和圖7)所示，AOPP類除草劑也可作為AAD-1(v1)的優(yōu)良底物。這些數(shù)據(jù)的意義在于這是第一次報道觀察到這類酶的任何成員對苯氧基生長素之外的除草劑具有活性。其內(nèi)在含義在于此酶廣泛到可以利用具有類似苯氧基鏈烷酸酯亞結(jié)構(gòu)的化學(xué)品，盡管它們作為除草劑具有完全不同的作用模式。實施例3-通過比色酚檢測體外測定AAD-1(v1)活性3.1-AAD-1(v1)測定通過產(chǎn)物酚的比色檢測測量AAD-1(v1)酶活性，其中使用由Fukumori和Hausinger(1993)(J.Biol.Chem.26824311-24317)的方案改良以允許使用96孔微孔板形式的方案。已有描述將比色測定用于測量雙加氧酶裂解2，4-滴和2，4-滴丙酸以釋放產(chǎn)物2，4-二氯苯酚。然而，也可能從不同的芳氧基鏈烷酸酯除草劑如吡氟氯禾靈和cyhalofop釋放其他酚(見圖4)。使用前述檢測方法將來自若干酚的顏色與2，4-二氯苯酚的進行比較，以確定哪種酚產(chǎn)物便于檢測。在含有200μMNH4(FeSO4)2、200uM維生素C酸鈉的0.15ml20mMMOPSpH6.75中以100μM終濃度檢測酚和酚類似物。容易檢測到，來自吡氟氯禾靈和cyhalofop的酚具有與2，4-二氯苯酚等價的顏色。來自fluroxypyr和triclopyr的Pyridinol未產(chǎn)生明顯的顏色。在高至500μM的測定中，2，4-二氯苯酚和吡氟氯禾靈酚的顏色產(chǎn)生是線性的，并與酚濃度成比例。在標(biāo)準(zhǔn)測定條件(160μl終測定體積)下得到的校正曲線表明從172μM酚可得到510nm處1.0的吸收。在含有200μMNH4FeSO4、200μM維生素C酸鈉、1mMα酮戊二酸、適當(dāng)?shù)孜?以DMSO中制備的100mM原液加入)和酶的總體積0.15ml的20mMMOPSpH6.75中進行酶測定。在時間零點加入芳氧基鏈烷酸酯底物、酶或α酮戊二酸起始反應(yīng)。在25℃孵育15分鐘后，通過加入10μl100mMEDTA酸鈉終止反應(yīng)。通過加入15μlpH10緩沖液(3.09g硼酸+3.73gKCl+44ml1NKOH)、1.5μl2％4-氨基安替比林和1.5μl8％鐵氰化鉀顯色。10到20分鐘后，在分光光度微孔板讀數(shù)器中記錄510nm處的吸收?？瞻缀谐敢酝獾乃性噭匝a償?shù)孜锉簧倭糠釉斐傻呐既坏妮p微污染。通過固定加入以下來更便利的進行以后的測定通過加入30μl1∶1∶1混合的50mMNaEDTA、pH10緩沖液和0.2％4-氨基安替比林并接著加入10μl0.8％鐵氰化鉀來淬滅反應(yīng)。3.2-提取大腸桿菌中表達的重組AAD-1(v1)的活性室溫下將大腸桿菌細胞沉淀重懸于0.1MTris，pH7.4+1mg/ml溶菌酶(5ml/來自250ml培養(yǎng)物的細胞，20ml/來自1升的細胞)中。間或振蕩15分鐘后，將懸液在液氮中冰凍再融化。以0.02mg/ml的終濃度加入DNA酶，以1mM加入MgCl2。當(dāng)提取物不再黏稠后將提取物離心15分鐘。使上清液經(jīng)過用20mMMOPSpH6.75預(yù)平衡的BioRadl0DG柱，并將洗脫液以等分式樣保存于-70℃。用這些未純化的脫鹽提取物或純化的酶進行測定。使用前述方案提取來自250ml經(jīng)誘導(dǎo)大腸桿菌細胞培養(yǎng)物的細胞沉淀并測定，所述大腸桿菌細胞表達含有編碼AAD-1(v1)的基因的pDAB3203。用1mM2，4-滴將AAD-1(v1)提取物的2，4-滴裂解活性與來自表達無AAD-1(v1)的載體的大腸桿菌細胞的活性進行比較，示于圖5。形成的2，4-二氯苯酚的量與測定中加入的提取物的量明顯成比例，而對照提取物不含2，4-滴裂解活性。對另外四種除草劑(R，S)-2，4-滴丙酸、(R，S)-2-甲-4-氯丙酸、(R，S)-吡氟氯禾靈和(R，S)-禾草靈測試此提取物的活性與2，4-滴進行比較(終濃度均為0.5mM)，其中每個測定使用4μl大腸桿菌提取物和15分鐘的測定期。圖6A顯示AAD-1(v1)裂解全部五種除草劑而得到酚，對底物的相對活性為2，4-滴丙酸＝2-甲-4-氯丙酸＞禾草靈＞吡氟氯禾靈＞2，4-滴。因此AAD-1(v1)對禾本科芳氧基苯氧丙酸酯除草劑和苯氧基生長素具有活性。接著使用消旋(R，S)-吡氟氯禾靈、吡氟氯禾靈的R對映體和cyhalofop的S對映體(均為0.5mM)作為可能的底物測試AAD-1(v1)提取物以確證AAD-1(v1)可能的對應(yīng)結(jié)構(gòu)體特異性。結(jié)果示于圖6B。酶對(R)-吡氟氯禾靈的活性與對(R，S)-吡氟氯禾靈的活性等價，而對S對映體則未見到活性，說明AAD-1(v1)對AOPP具有R特異性。實施例4-AAD-1(v1)的底物特異性4.1-AAD-1(v1)的其他底物測試了AAD-1(v1)對多種商品和實驗性除草劑的底物特異性。每個160μl測定使用1或10μg純化的AAD-1(v1)，以1mM和15分鐘的測定時間測試每種底物。表3顯示了多種芳氧基鏈烷酸酯生長素除草劑和生長素類似物經(jīng)AAD-1(v1)作用后檢測到的A510。測試的最佳底物為2，4-滴丙酸，2-甲-4-氯丙酸也被有效裂解。AAD-1(v1)還有效作用于兩種其他的苯氧丙酸2，4-滴丙酸的4-氟和3-氨基類似物。在使用較高量(10μg)AAD-1(v1)的測定中更好的度量了對這些底物的相對劑量。從這些數(shù)據(jù)看，2，4-滴被AAD-1(v1)裂解，兩種苯氧基烷基磺酸X188476和X398166(sesone)也是如此。表4顯示多種AOPP禾本科除草劑及安全劑解毒喹作為AAD1底物的數(shù)據(jù)。測試的所有商品AOPP除草劑均被AAD-1(v1)高效裂解。這是未曾預(yù)期的發(fā)現(xiàn)，并大大提高了此酶在轉(zhuǎn)基因用途中用于賦予對多種禾本科除草劑(不僅包括生長素)的抗性的潛在功用。AAD-1(v1)對喹禾靈具有最高的活性(2，4-滴丙酸劑量的76％)，對cyhalofop具有最低的活性(喹禾靈劑量的27％，2，4-滴丙酸劑量的21％)。吡氟氯禾靈的芳氧基乙酸類似物(X043865)被裂解得十分緩慢，使用較高(10μg)的酶量后A510僅略有增加。這與AAD-1(v1)在苯氧丙酸上觀察到的相對于苯氧乙酸生長素更高的活性一致。在(S)-cyhalofop上觀察到最低的活性，說明AAD-1(v1)對芳氧基丙酸底物的R對映體具有明顯的偏好。類似的，對quinolinoxyacetate安全劑解毒喹也未記錄到活性，這與AAD-1(v1)優(yōu)選芳氧基丙酸底物勝過苯氧基生長素這一觀察一致。每個測試使用27μg粗重組AAD-1(v1)測試1mM的底物X11115427、X124987和MCPA。全部三種化合物均為AAD-1(v1)的底物，但具有不同的相對效率(表8)。與作為底物優(yōu)于2，4-滴約7倍的近親類似物3-氨基2，4-滴丙酸(表3)相反，X11115427作為底物稍優(yōu)于2，4-滴(2，4-滴劑量的125％)。5-F取代似乎降低了X11115427作為AAD-1(v1)底物的效率。來自5-F-苯氧乙酸和MCPA的產(chǎn)物形成率分別為2，4-滴的32％和55％。表8AAD-1(v1)對三種底物相對于2，4-滴的效率。使用提取自大腸桿菌的粗重組AAD-1(v1)測定1mM的表6中的底物。4.2-動力學(xué)特征在標(biāo)準(zhǔn)測定條件(25mMMOPS，pH6.8、200μtM維生素C酸鈉、200μMFe2+、1mMα酮戊二酸、25℃)下測定純化的AAD-1(v1)對四種除草劑底物(R)-2，4-滴丙酸、(R)-吡氟氯禾靈、(R)-喹禾靈和2，4-滴的Km和kcat值(參閱實施例10)。使用Grafit(ErithacusSoftware，UK)擬合劑量應(yīng)答曲線，圖表和產(chǎn)生的常量分別示于圖7和表9。對四種底物的Km值相當(dāng)類似(75-125μM)，但kcat。值存在顯著差別。(R)-2，4-滴丙酸具有最高的kcat值，2，4-滴最低((R)-2，4-滴丙酸的10％)。由于在高(飽和)底物濃度(1mM)下進行這些測定，這些kcat值與表3和表4中所示底物特異性測試中的值的范圍一致。表9AAD-1(v1)底物的動力學(xué)常數(shù)。使用米-曼方程的Grafit擬合從圖7的數(shù)據(jù)產(chǎn)生動力學(xué)常數(shù)。2，4-滴丙酸和2，4-滴的相對Km和Kcat值與Westendorf等(2003)(ActaBiotechnol.233-17)等出版的來自Delftiaacidovorans的R特異性雙加氧酶的值存在顯著差異。已出版的2，4-滴的Kcat/Km值為2，4-滴丙酸的0.6％，而在我們的研究中，2，4-滴的Kcat/Km值為2，4-滴丙酸的8％。因此，在此研究中AAD-1(v1)催化裂解2，4-滴出乎意料的有效。這提高了其在轉(zhuǎn)基因應(yīng)用中用于賦予多種除草劑耐性性狀的潛在功用。4.3-AAD-1(v1)的其他底物在每個測試中使用27μg粗重組AAD-1(v1)測試1mM的其他三種底物X11115427、X124987和MCPA。全部三種化合物均為AAD-1(v1)的底物，但具有不同的相對效率。X11115427作為底物僅稍優(yōu)于(125％)2，4-滴。這與作為底物優(yōu)于2，4-滴約7倍的3-氨基2，4-滴丙酸(表3)相反。因此，5-F取代顯著降低了X11115427作為AAD-1(v1)底物的效率。用5-F-2，4-滴也觀察到類似的模式，其作為底物的效率僅相當(dāng)于2，4-滴的32％。在此測定中，MCPA作為AAD-1(v1)底物的效率的產(chǎn)物也較低(2，4-滴的55％)。實施例5-用于植物表達的序列優(yōu)化5.1-背景為了在植物中得到異源基因的高表達，可能優(yōu)選重新設(shè)計所述基因以使其在植物細胞(的胞質(zhì))中更有效的表達。玉米就是這樣的一種植物，其中在轉(zhuǎn)化前重新設(shè)計異源基因以提高其在所述植物中的表達水平可能是優(yōu)選的。因此，在設(shè)計編碼細菌蛋白質(zhì)的基因中額外的步驟是重新改造異源基因以得到最優(yōu)表達。在玉米中進行表達時重新改造細菌蛋白質(zhì)的一個原因是由于天然基因的非最優(yōu)G+C含量。例如，許多天然細菌基因極低的G+C含量(和因此高A+T含量的傾向)引起產(chǎn)生模擬或復(fù)制已知為高度富含A+T的植物控制序列的序列。在引入植物的基因中存在一些富含A+T的序列(如一般見于基因啟動子中的TATA盒區(qū))可能引起基因的異常轉(zhuǎn)錄。另一方面，轉(zhuǎn)錄的mRNA中其他調(diào)節(jié)序列(如多腺苷酸化信號序列(AAUAAA)或與前mRNA剪接相關(guān)的核內(nèi)小RNA的互補序列)的存在可能導(dǎo)致RNA的不穩(wěn)定性。因此，設(shè)計用于玉米表達的編碼細菌蛋白質(zhì)的基因(更優(yōu)選稱為植物優(yōu)化基因)的一個目的是產(chǎn)生具有較高G+C含量(優(yōu)選與編碼代謝酶的玉米基因接近的G+C含量)的DNA序列。設(shè)計編碼細菌蛋白質(zhì)的植物優(yōu)化基因的另一個目的是產(chǎn)生其序列修飾不阻礙翻譯的DNA序列。表10展示了玉米中的G+C含量有多高。對于表10中的數(shù)據(jù)，基因的編碼區(qū)出自GenBank(第71次發(fā)布)條目，并用MacVector.TM.程序(Accelerys，SanDiego，California)計算堿基組成。計算中忽略了內(nèi)含子序列。注a每一類基因的數(shù)目在括號內(nèi)給出。注b標(biāo)準(zhǔn)差在括號內(nèi)給出。注c平均值計算中忽略了組合組平均值。由于遺傳密碼的冗余性/簡并性(即一些氨基酸由多于一個密碼子指定)提供的可塑性，基因組在不同生物或不同綱的生物中的進化引起了對冗余密碼子不同的使用。在蛋白質(zhì)編碼區(qū)的平均堿基組成中反映了這種“密碼子偏好”。例如，具有相對低G+C含量的生物使用冗余密碼子的第三個位置上為A或T的密碼子，而具有較高G+C含量的使用第三個位置上為G或C的密碼子。mRNA中少見密碼子的存在被認(rèn)為可降低該mRNA的絕對翻譯率，特別是對應(yīng)于少見密碼子的載荷tRNA的相對豐度低時。這一事實可擴展為對于多個少見密碼子，單個少見密碼子對翻譯的降低將至少是累加的。因此，具有相對高含量少見密碼子的mRNA將相應(yīng)的具有低翻譯率。該翻譯率將進而反映為低水平的編碼蛋白質(zhì)。在設(shè)計用于玉米(或其他植物，如棉花或大豆)表達的編碼細菌蛋白質(zhì)的基因時已經(jīng)測定了所述植物的密碼子偏好。玉米的密碼子偏好是該植物用于編碼其蛋白質(zhì)的密碼子統(tǒng)計分布，表11顯示了優(yōu)選的密碼子使用。測定偏好之后，測定目的基因中密碼子的頻率百分比。應(yīng)該測定植物優(yōu)選的主要密碼子，在存在多種選擇時，還要測定優(yōu)選密碼子的第二、第三和第四選擇。設(shè)計編碼細菌蛋白質(zhì)的氨基酸序列的新DNA序列，但新DNA序列通過用植物(第一優(yōu)選，第二優(yōu)選、第三優(yōu)選或第四優(yōu)選)密碼子進行替換以指定蛋白質(zhì)氨基酸序列內(nèi)每個位置的氨基酸而區(qū)別于(編碼蛋白質(zhì)的)天然細菌DNA序列。然后分析新序列中可能由修飾產(chǎn)生的限制性酶切位點。通過用第一、第二、第三或第四選擇的優(yōu)選密碼子取代該密碼子來進一步修飾鑒定出的位點。序列中可能影響目的基因轉(zhuǎn)錄或翻譯的其他位點為外顯子-內(nèi)含子接合處(5’或3’)、多腺苷酸加成信號或RNA聚合酶終止信號。進一步分析和修飾序列，以降低TA或GC雙聯(lián)體的頻率。除了雙聯(lián)體之外，具有多于約四個相同堿基的G或C序列嵌段也能影響序列的轉(zhuǎn)錄。因此，也通過用下一優(yōu)選的密碼子選擇取代首選或次選的密碼子來修飾這些嵌段。編碼細菌蛋白質(zhì)的植物優(yōu)化基因優(yōu)選含有約63％的首選密碼子、約22％到約37％之間的次選密碼子和約15％到約0％之間的三選或四選密碼子，其中總百分比為100％。最優(yōu)選植物優(yōu)化基因含有約63％的首選密碼子、至少約22％的次選密碼子、約7.5％的三選密碼子和約7.5％的四選密碼子，其中總百分比為100％。上述方法使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠修飾就具體植物而言是外來的基因，從而使基因在植物中優(yōu)化表達。PCT申請WO97/13402中進一步說明了該方法。為了設(shè)計編碼細菌蛋白質(zhì)的植物優(yōu)化基因，使用建立自密碼子偏好表的冗余遺傳密碼設(shè)計編碼所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列的DNA序列，所述偏好表整理自具體植物的基因序列。得到DNA序列具有較高水平的密碼子多樣性、所需的堿基組成、可含有根據(jù)策略放置的限制性酶識別位點并缺少可能干擾基因轉(zhuǎn)錄或產(chǎn)物mRNA翻譯的序列的DNA序列。5.2-重建分析對天然AAD-1(v1)編碼區(qū)(SEQEDNO3)888個堿基對(bp)DNA序列的廣泛分析顯示存在若干認(rèn)為不利于最佳植物表達的序列基序以及非最佳密碼子組成。為改善重組蛋白在單子葉和雙子葉植物中的產(chǎn)生，產(chǎn)生了編碼SEQIDNO11的“植物優(yōu)化”DNA序列(SEQIDNO5)，除了在第二個位置加入丙氨酸殘基外，它與天然SEQIDNO9相同。包含額外的丙氨酸密碼子(GCT，在SEQIDNO5以下劃線標(biāo)出)以編碼跨越ATG起始密碼子的NcoI位點(CCATGG)，以允許其后的克隆操作。天然(v1)和植物優(yōu)化(v3)的編碼區(qū)所編碼的蛋白質(zhì)99.3％相同，僅2號氨基酸不同。相反，天然(v1)和植物優(yōu)化的(v3)編碼區(qū)的DNA序列僅77.7％相同。進行了天然和植物優(yōu)化的DNA的序列比對，表12顯示天然和植物優(yōu)化的序列密碼子組成的差異?？傆?48149總計1481495.3-二元載體的完成5.3.1-重建AAD-1(v3)植物優(yōu)化基因AAD-1(v3)得自Picoscript(完成了基因重建設(shè)計(見上文)并交給Picoscript進行構(gòu)建)并內(nèi)部驗證了序列(SEQIDNO5)以證實預(yù)期序列中不存在改變。如上文使用BeckmanCoulter″DyeTerminatorCycleSequencingwithQuickStartKit″試劑用M13正向(SEQIDNO16)和M13反向(SEQIDNO17)引物進行測序反應(yīng)。分析序列數(shù)據(jù)，結(jié)果表明植物優(yōu)化的AAD-1(v3)DNA序列中不存在異常。以NcoI-SacI片段將AAD-1(v3)基因克隆進pDAB726。得到的構(gòu)建體命名為pDAB720，其含有[AtUbi10啟動子NtOSM5′UTRAAD-1(v3)NtOSM3′UTRORF1polyA3′UTR](用NotI選擇性消化驗證)。接著將含有所述盒的NotI-NotI片段克隆進二元載體pDAB3038的NotI位點。然后(用BamHI、EcoRI、EcoRV、HinDIII、PacI和XmnI)限制性消化得到的二元載體pDAB721以驗證正確的方向，pDAB721含有如下的盒[AtUbi10啟動子NtOSM5′UTRAAD-1(v3)NtOSM3′UTRORF1polyA3′UTRCsVMV啟動子PATORF25/263′UTR]。用經(jīng)驗證的完整構(gòu)建體(pDAB721)轉(zhuǎn)化進農(nóng)桿菌(參閱6.2章節(jié))。5.3.2-天然AAD1(v1)和修飾的AAD-1(v2)從pDAB3203PCR擴增AAD-1(v1)基因(SEQIDNO3)。在PCR反應(yīng)中，在引物內(nèi)產(chǎn)生改變以分別在5’引物和3’引物中引入NcoI和SacI限制性位點。使用FailSafePCR系統(tǒng)(Epicenter)用引物“rdpA(ncoI)”[CCCATGGCTGCTGCACTGTCCCCCCTCTCC](SEQIDNO6)和“3′sacI”[GAGCTCACTAGCGCGCCGGGCGCACGCCACCGA](SEQIDNO7)擴增DNA片段。將PCR擴增子連接進pCR2.1TOPOTA克隆載體(Invitrogen)并使用BeckmanCoulter“DyeTerminatorCycleSequencingwithQuickStartKit”測序試劑，用M13正向(SEQIDNO16)和M13反向(SEQIDNO17)引物驗證序列。序列數(shù)據(jù)鑒定了具有正確序列的克隆。在分析中鑒定了AAD-1(v1)3’末端多余的NotI限制性位點。去除了此位點以便于克隆進pDAB3038。為去除額外的位點，用內(nèi)部5’引物進行PCR反應(yīng)。通過摻入編碼氨基酸的新密碼子以去除多余的NotI位點來改變NotI位點。這一變化使位置212的精氨酸變成半胱氨酸。使用的PCR引物為“BstEII/DelNotI”[TGGTGGTGACCCATCCGGGCAGCGGCTGCAAGGGCC](SEQIDNO8)和“3′sacI”(SEQIDNO7)。使用FailSafePCR系統(tǒng)(Epicenter)完成PCR反應(yīng)，將得到的片段克隆進克隆pCR2.1TOPOTA試劑盒(Invitrogen)。通過DNA測序確認(rèn)正確的PCR產(chǎn)物，“修改的”基因命名為AAD-1(v2)(SEQIDNO4)。使用M13反向引物(SEQIDNO17)和BeckmanCoulter“DyeTerminatorCycleSequencingwithQuickStartKit”測序試劑的測序反應(yīng)表明分離了正確的PCR片段。用BstEII和SacI酶消化此構(gòu)建體。將得到的片段克隆進pCR2.1AAD-1(v2)構(gòu)建體(pCR2.1DeltaNotI)并通過限制性酶消化確認(rèn)。接著以NcoI/SacIDNA片段將修飾的AAD-1(v2)基因克隆進pDAB726。用限制性消化確認(rèn)得到的構(gòu)建體(pDAB708)。然后以NotI-NotI片段將此構(gòu)建體克隆進二元pDAB3038。最終得到的含有[AtUbi10啟動子NtOSM5′UTRAAD-1(v2)NtOSM3′UTRORF1polyA3′UTRCsVMV啟動子PATORF25/263′UTR]的構(gòu)建體命名為pDAB766，進行限制性消化以確認(rèn)正確的方向。用完成的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化進農(nóng)桿菌。5.3.3-編碼具有賦予草甘膦耐性的突變大豆EPSPS的大豆密碼子偏好DNA序列此實施例教導(dǎo)設(shè)計新的DNA序列，其編碼突變的大豆5-enolpyruvoylshikimate3-磷酸合酶(EPSPS)，但經(jīng)優(yōu)化用于在大豆中表達。三重突變的大豆EPSPS的氨基酸序列以SEQIDNO5公開于WO2004/009761。在其公開的序列中突變的氨基酸為殘基183(用異亮氨酸替換天然蛋白質(zhì)的蘇氨酸)、殘基186(用賴氨酸替換天然蛋白質(zhì)的精氨酸)和殘基187(用絲氨酸替換天然蛋白質(zhì)的脯氨酸)。因此，可以通過在適當(dāng)位置用天然氨基酸取代WO2004/009761的SEQIDNO5中的已替換氨基酸來推出天然大豆EPSPS蛋白的氨基酸序列。這樣的天然蛋白質(zhì)序列在本文中顯示為SEQIDNO20。雙突變的大豆EPSPS蛋白在本文中顯示為SEQIDNO21，其含有殘基183(用異亮氨酸取代天然蛋白質(zhì)中的蘇氨酸)和殘基187(用絲氨酸取代天然蛋白質(zhì)中的脯氨酸)處的突變。用于大豆(Glycinemax)蛋白質(zhì)編碼序列的密碼子使用表得自“kazusa.or.jp/codon”萬維網(wǎng)址，它從362096個密碼子(約870個編碼序列)中計算得到。將這些數(shù)據(jù)重新整理示于表13。表13的D和H欄代表大豆基因蛋白質(zhì)編碼區(qū)中每個氨基酸的同義密碼子分布(以該氨基酸的作用密碼子的使用百分比計)。顯然在大豆蛋白質(zhì)編碼區(qū)中一些氨基酸的一些同義密碼子(一個氨基酸可以由1、2、3、4或6個密碼子指代)的存在相對稀少(例如，比較指代丙氨酸的GCG和GCT密碼子的使用)。從表13的數(shù)據(jù)表計算偏好的大豆密碼子使用表。忽略在大豆基因中小于具體氨基酸總存在數(shù)約10％的密碼子。為平衡剩余氨基酸密碼子選擇的分布，使用下式計算每個密碼子加權(quán)的平均比例C1的加權(quán)百分比＝1/(％C1+％C2+％C3+其他)×％C1×100其中C1為所討論的密碼子，C2、C3、其他代表剩余的同義密碼子，相關(guān)密碼子的百分比值取自表13的D和H列(忽略粗體的稀有密碼子的值)。每個密碼子的加權(quán)百分比值在表13的C和G列給出。任意選擇TGA作為翻譯終止子。接著將偏好密碼子使用頻率并入專門的遺傳密碼表，以用于OptGeneTM基因設(shè)計程序(OcimumBiosolutionsLLC，Indianapolis，Indiana)。*DNU＝不使用為產(chǎn)生編碼雙突變EPSPS的大豆優(yōu)化DNA序列，使用來自上文的大豆偏好遺傳密碼通過OptGeneTM程序反向翻譯SEQIDNO21的蛋白質(zhì)序列。接著通過補償密碼子變化來修飾這樣產(chǎn)生的原始DNA序列(而保持密碼子的總體加權(quán)平均比例)，以減少相鄰密碼子間CG和TA雙聯(lián)體數(shù)，增加相鄰密碼子間CT和TG雙聯(lián)體數(shù)、去除高度穩(wěn)定的鏈間二級結(jié)構(gòu)、去除或加入限制性酶識別位點并去除可能不利于所改造基因的表達或克隆操作的其他序列。進一步精加工序列，以消除潛在的植物內(nèi)含子剪接位點、A/T或C/G殘基的長段和可能干擾植物細胞中RNA穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)錄或編碼區(qū)翻譯的其他基序。制造其他改變以消除長內(nèi)部開放讀碼框(除+1之外的框)。在保持上述大豆偏好的密碼子組成并保留SEQIDNO21公開的氨基酸序列這一約束下產(chǎn)生這些改變。以SEQIDNO22的堿基1-1575給出編碼SEQIDNO21EPSPS蛋白的大豆偏好DNA序列。由商業(yè)供應(yīng)商(PicoScript，HoustonTX)進行含有SEQIDNO22的DNA片段的合成。5.3.4-其他二元構(gòu)建體的克隆完成pDAB3295和pDAB3757整合了對GateWay克隆技術(shù)(Invitrogen，目錄號11791-043和目錄號12535-019)的使用。GateWay技術(shù)使用基于λ噬菌體的位點特異性重組將基因盒插入載體。更多信息參考《GatewayTechnologyAuniversaltechnologytocloneDNAsequenceforfunctionalanalysisandexpressioninmultiplesystems》，_1999-2003，InvitrogenCorp.，1600FaradayAve.，Carlsbad，CA92008(2003年出版)。使用與上文類似的方法和其他標(biāo)準(zhǔn)分子克隆方法建立所有其他用于轉(zhuǎn)化進適當(dāng)植物物種的構(gòu)建體(Maniatis等，1982)。表14列出了所使用的所有具有適當(dāng)啟動子和所定義特征的轉(zhuǎn)化構(gòu)建體及其轉(zhuǎn)化的作物。將sacB基因加入二元載體pDAB3289作為細菌陰性選擇標(biāo)記物，以減少與轉(zhuǎn)化植物組織相關(guān)的殘留農(nóng)桿菌。sacB是由芽孢桿菌屬產(chǎn)生的果聚糖蔗糖酶，在蔗糖存在下進行培養(yǎng)時它對多數(shù)革蘭氏陰性菌具有毒性(Gay等，1983)。從質(zhì)粒pREl12(Edwards等，1998)的HindIII片段回收sacB基因并克隆進pDAB3289中的單HindIII位點。*A＝擬南芥CsVMV＝木薯葉脈花葉病毒啟動子ZmUbi1＝玉米泛素1啟動子T＝煙草AtUbi10＝擬南芥泛素10啟動子HptH＝潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶S＝大豆RB7Marv2＝煙草基質(zhì)相關(guān)區(qū)(MAR)Ct＝棉花NtOsm＝煙草Osmotin5′非翻譯區(qū)和煙草Osmotin3′非翻譯區(qū)R＝稻(721和793)AtuORF13′UTR＝根瘤農(nóng)桿菌開放讀碼框13′非翻譯區(qū)Cn＝玉米(3295和3757)AtuORF243′UTR＝根瘤農(nóng)桿菌開放讀碼框243′非翻譯區(qū)實施例6-轉(zhuǎn)化進擬南芥并選擇6.1-擬南芥培養(yǎng)條件將野生型擬南芥種子懸于0.1％瓊脂糖(SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO)溶液中。將懸浮的種子在4℃保存2天以完成對休眠的需要并保證種子同步萌發(fā)(分層)。用細蛭石覆蓋SunshineMixLP5(SunGroHorticulture，Bellevue，WA)并用Hoagland溶液下層灌溉至濕潤。使土壤混合物排水24小時。將成層的種子種在蛭石上并用保濕罩(KORDProducts，Bramalea，Ontario，Canada)覆蓋7天。使種子萌發(fā)并在恒溫(22℃)恒濕(40％-50％)光強度為120-150μmol/m2秒的長日照條件下在Conviron(modelsCMP4030andCMP3244，ControlledEnvironmentsLimited，Winnipeg，Manitoba，Canada)中培養(yǎng)植物。開始用Hoagland溶液灌溉植物，接著用去離子水灌溉，保持土壤潮濕但不濕透。6.2-農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化帶有劃線的DH5α菌落的含紅霉素(SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO)(200mg/L)或大觀霉素(100mg/L)的LB+瓊脂平板用于提供菌落接種到4ml小量制備培養(yǎng)物(液體LB+紅霉素)中。將培養(yǎng)物在37℃持續(xù)搖動孵育過夜。按照生產(chǎn)商的說明使用Qiagen(Valencia，CA)SpinMiniPreps純化質(zhì)粒DNA。使用來自Weigel和Glazebrook(2002)的方案制備電感受態(tài)的根瘤農(nóng)桿菌(菌株Z707、EHA101和LBA4404)細胞。使用修改自Weigel和Glazebrook(2002)的電穿孔方法轉(zhuǎn)化感受態(tài)農(nóng)桿菌細胞。在冰上融化50μl感受態(tài)農(nóng)桿菌細胞并在細胞中加入10-25ng所需的質(zhì)粒。將DNA和細胞混合物加入預(yù)冷的電穿孔杯(2mm)中。用以下條件使用Eppendorf電穿孔儀2510進行轉(zhuǎn)化電壓2.4kV，脈沖長度5毫秒。電穿孔后，向杯中加入1mlYEP培養(yǎng)液(每升10g酵母提取物、10g細菌用蛋白胨、5gNaCl)并將細胞-YEP懸液轉(zhuǎn)移到15ml培養(yǎng)管中。將細胞在水浴中持續(xù)搖動以28℃孵育4小時。孵育后，將培養(yǎng)物涂到含紅霉素(200mg/L)或大觀霉素(100mg/L)和鏈霉素(SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO)(250mg/L)的YEP+瓊脂上。28℃孵育平板2-4天。選取菌落并劃線到含紅霉素(200mg/L)或大觀霉素(100mg/L)和鏈霉素(SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO)(250mg/L)的新鮮YEP+瓊脂上，在28℃孵育1-3天。選取菌落使用載體特異性引物進行PCR分析，以確認(rèn)基因插入片段的存在。按照生產(chǎn)商的說明使用QiagenSpinMiniPrep從選取的農(nóng)桿菌菌落純化質(zhì)粒DNA，另將15ml小量制備培養(yǎng)物(液體YEP+紅霉素(200mg/L)或大觀霉素(100mg/L)和鏈霉素(250mg/L))的4ml等分式樣用于DNA純化。QiagenSpinMiniPrepDNA的替代是裂解轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌細胞，在100℃懸浮于10μl水中5分鐘。包括了來自農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化中使用的二元載體的DNA作為對照。以0.5×的濃度按照生產(chǎn)商的說明使用TakaraMinisBioLac.(Madison，Wisconsin)的TaqDNA聚合酶完成PCR反應(yīng)。按以下條件設(shè)置程序在MJResearchPeltier熱循環(huán)儀中進行PCR反應(yīng)1)94℃3分鐘，2)94℃45秒，3)55℃30秒，4)72℃1分鐘，共29個循環(huán)，其后是72℃10分鐘的一個循環(huán)。循環(huán)后將反應(yīng)物保持在4℃。通過1％瓊脂糖凝膠電泳分析擴增并通過溴化乙啶染色顯像。選擇了其PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒對照相同的菌落。6.3-擬南芥轉(zhuǎn)化使用花浸泡法轉(zhuǎn)化擬南芥。用選取的菌落接種一個或多個15-30ml含紅霉素(200mg/L)或大觀霉素(100mg/L)和鏈霉素(250mg/L)的YEP培養(yǎng)液的預(yù)培養(yǎng)物。以220rpm將培養(yǎng)物在28℃恒速搖動孵育過夜。每個預(yù)培養(yǎng)物用于接種兩個500ml含紅霉素(200mg/L)或大觀霉素(100mg/L)和鏈霉素(250mg/L)的YEP培養(yǎng)液的培養(yǎng)物并將培養(yǎng)物在28℃持續(xù)搖動孵育過夜。室溫下以約8700×g離心10分鐘沉淀細胞，棄去得到的上清液。將細胞沉淀輕柔重懸于500ml滲透培養(yǎng)基中，所述滲透培養(yǎng)基含有1/2×Murashige和Skoog鹽/GamborgB5維生素、10％(重量/體積)蔗糖、0.044μM苯甲酸嘌呤(10μl升(1mg/mlDMSO中的原液)和300μl/lSilwetL-77。將約1月齡的植物在培養(yǎng)基中浸泡15秒，確保浸沒最新的花序。接著將植物側(cè)面放倒并覆蓋(透明或不透明)24小時，接著用水洗滌并豎直放置。在22℃以16小時光/8小時暗的光周期培養(yǎng)植物。浸泡約4周后收獲種子。6.4-轉(zhuǎn)化植物的選擇將新收獲的(轉(zhuǎn)化了天然[AAD-1(v2)]或植物優(yōu)化的[AAD-1(v3)]基因的)T1種子在室溫下干燥7天。將種子種在26.5×51cm萌發(fā)盤(T.O.PlasticsInc.，Clearwater，MN)中，每盤接受200mg等分式樣的成層T1種子(10000個種子)，所述種子事先已懸于40ml0.1％瓊脂糖溶液并在4℃保存2天以完成休眠需要并保證同步的種子萌發(fā)。用蛭石覆蓋SunshineMixLP5(SunGroHorticultureInc.，Bellevue，WA)并用Hagland溶液地下灌溉至濕透，利用重力排水。用移液管將成層種子的每個40ml等分式樣均勻的種到蛭石上，并用保濕罩(KORDProducts，Bramalea，Ontario，Canada)覆蓋4-5天。在使用出苗后噴灑草銨膦(選擇共轉(zhuǎn)化的PAT基因)進行轉(zhuǎn)化體選擇前1天移去罩。在5到6個種植后天數(shù)(DAP)和10DAP，使用DeVilbiss壓縮空氣噴霧器以10ml/盤(703L/ha)的噴灑體積用Liberty除草劑(200gai/L的草銨膦，BayerCropSciences，KansasCity，MO)的0.2％溶液噴灑T1植物(分別為子葉期和2-4葉期)，以輸入每次應(yīng)用280gai/ha有效量的草銨膦。在最后噴灑5-7天后鑒定存活株(活躍生長的植物)，并分別移植到用盆栽基質(zhì)(MetroMix360)制備的3英寸盆中。用保濕罩覆蓋移植的植物3-5天，并如前置于22℃培養(yǎng)室中。接著移去蓋并在測試AAD-1(v3)(植物優(yōu)化基因)或AAD-1(v2)(天然微生物基因)提供苯氧基生長素除草劑抗性的能力之前至少1天將植物移到溫室(22±5℃，50±30％RH，14小時光照10小時黑暗，至少500uE/mV天然+補充光)。對上述選擇了草銨膦抗性的隨機個體T1植物使用PATELISA試劑盒(部件號7000045，StrategicDiagnostics，Inc.，Newark，DE)證實其PAT蛋白的表達(生產(chǎn)商的方案)，以非破壞性地證實選擇過程的精確度。接著將植物隨機分配到多個用量的苯氧基除草劑(2，4-滴丙酸或2，4-滴)。開始應(yīng)用的苯氧基用量為12.5gae/ha2，4-滴和50或200gae/ha2，4-滴丙酸。在其后的試驗中使用提高的用量(50、200、800或3200gae/ha)。如上述使用DeVilbiss噴霧器實現(xiàn)所有的生長素除草劑應(yīng)用，以應(yīng)用703L/ha的噴灑體積(0.4ml溶液/3英寸盆)，或者通過履帶式噴霧機以187L/ha的噴灑體積應(yīng)用。使用的2，4-滴為溶于DMSO并稀釋于水中(＜1％DMSO終濃度)的工業(yè)級(Sigma，St.Louis，MO)或為商品二甲胺鹽成分(456gae/L，NuFarm，StJoseph，MO)。使用的2，4-滴丙酸為溶于DMSO并稀釋于水中(＜1％DMSO終濃度)的工業(yè)級(Sigma，St.Louis，MO)。由于除草劑的量提高到超過800gae/ha，噴灑溶液的pH變的極度酸性，燒傷幼小擬南芥植物的葉子，并使評估除草劑的首效變得復(fù)雜。使用200mMTris緩沖液(pH9.0)中終pH7-8的苯氧基除草劑已成為標(biāo)準(zhǔn)實踐。使一些T1個體接受代替苯氧基生長素的備選商品除草劑。目的的一個方面是測定吡氟氯禾靈在植物中是否可被有效降解。盡管雙子葉植物擬南芥不是測試ACC酶抑制AOPP禾本科除草劑的最佳系統(tǒng)，但仍然用DeVilbiss噴霧器使上述轉(zhuǎn)化了AAD-1(v3)的T1植物遭受提高劑量(400-1600gae/ha)的RS-吡氟氯禾靈酸(內(nèi)部合成)，該劑量確實引起野生型擬南芥的生長異常和死亡。處理7天和14天后取得損傷量。類似的，用pyridyloxyacetate生長素除草劑氟草煙處理T1個體。6.5-轉(zhuǎn)化植物的選擇結(jié)果用AAD-1(v3)(植物優(yōu)化基因)進行第一個擬南芥轉(zhuǎn)化。首先使用草銨膦選擇方案從未轉(zhuǎn)化種子背景中選擇T1轉(zhuǎn)化體。篩選了超過400000個T1種子，鑒定了493個草銨膦抗性植物(PAT基因)，等于0.12％的轉(zhuǎn)化/選擇頻率。取決于測試種子的批次，其范圍從0.05％-0.23％(見表15)。還使用草銨膦選擇劑選擇了一小批轉(zhuǎn)化天然AAD-1(v2)的種子。從篩選的84000顆種子中鑒定了278個草銨膦抗性T1個體(0.33％的轉(zhuǎn)化/選擇頻率)。1草銨膦選擇方案5-6+10DAP應(yīng)用280gai/ha草銨膦22，4-滴選擇方案5-7+10-14DAP應(yīng)用50gai/ha2，4-滴3通過PATELISA條帶確定PAT蛋白表達4nd，未測定5密碼子偏好，n-天然微生物基因，p-植物優(yōu)化其后將上述選擇的T1植物移植到單個盆中并用多個用量的商品aryloxyalkanoate除草劑噴灑。表16比較了天然AAD-1(v2)和AAD-1(v3)植物優(yōu)化基因輸入2，4-滴抗性到擬南芥T1轉(zhuǎn)化體的應(yīng)答。兩個基因都將抗性輸入到個體T1擬南芥植物。在給定的處理內(nèi)，植物應(yīng)答的水平差異顯著，這可能是由于每個植物代表獨立的轉(zhuǎn)化事件的事實。特別需要注意在測試的每個2，4-滴用量中都存在未受影響的個體，而另一些則受到嚴(yán)重的影響?？傮w種群平均損傷率示于表16，以證明轉(zhuǎn)化AAD-1(v2)或AAD-1(v3)的植物與野生型或轉(zhuǎn)化PAT/Cry1F的對照之間的顯著差異。另外，顯然植物優(yōu)化序列AAD-1(v3)的耐性看來顯著強于天然序列AAD-1(v2)(見表16)。對表達AAD-1(v3)的其他T1個體使用了高劑量的2，4-滴(高至3200gae/ha)。損傷水平傾向于提高，且在這些提高的劑量(6×大田劑量)下高抗性植物的頻率較低。另外在這些高劑量下，如果不進行緩沖則噴灑溶液變成高酸性。主要在生長室中培養(yǎng)的擬南芥角質(zhì)層很薄，嚴(yán)重的燒傷效應(yīng)會使這些提高劑量下的測試復(fù)雜化。盡管如此，仍有一些個體在3200gae/ha2，4-滴下無損傷或幾乎無損傷的存活下來。表16.轉(zhuǎn)化AAD-1v3(植物優(yōu)化)或AAD-1v2(天然)或AAD-2(天然)的T1植物對出苗后應(yīng)用的一系列2，4-滴用量的應(yīng)答。以可見損傷百分比2WAT顯示應(yīng)答。以表現(xiàn)無損傷或幾乎無損傷(＜20％)、中度損傷(20-40％)或嚴(yán)重損傷(＞40％)的個體的直方圖顯示數(shù)據(jù)。由于每株個體都是獨立的轉(zhuǎn)化事件，可以預(yù)計在給定劑量內(nèi)個體T1應(yīng)答的顯著變異。顯示了每個處理的算術(shù)平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。還在最后一列標(biāo)出了每一劑量和轉(zhuǎn)化的個體應(yīng)答的范圍。轉(zhuǎn)化PAT/Cry1F的擬南芥作為生長素敏感型轉(zhuǎn)化對照。野生型擬南芥未轉(zhuǎn)化。表16.轉(zhuǎn)化AAD-1v3(植物優(yōu)化)或AAD-1v2(天然)或AAD-2(天然)的T1擬南芥對出苗后使用的一系列2，4-滴用量的應(yīng)答。表17顯示T1擬南芥對苯氧丙酸2，4-滴丙酸類似的劑量應(yīng)答?？梢娕c2，4-滴類似的傾向，說明手性丙酸側(cè)鏈確實作為可用的底物。接著，確定了可以向擬南芥輸入400-1,600gae/ha的提高劑量下提高的吡氟氯禾靈耐性(表18)。吡氟氯禾靈(禾本科特異性除草劑)正常的大田用量為50-70gae/ha左右。一般認(rèn)為雙子葉植物對AOPP除草劑具有天然耐性，然而，在這些提高劑量下在擬南芥中確實出現(xiàn)了嚴(yán)重的生理效應(yīng)。一些轉(zhuǎn)化AAD1(v3)的個體的確對吡氟氯禾靈表現(xiàn)出提高的耐性。這提供了AAD-1(v3)會提供AOPP抗性的第一組植物中的數(shù)據(jù)。與使用異源表達酶的體外工作一致，在轉(zhuǎn)化擬南芥中沒有觀察到對氟草煙(pryridyloxyacetate生長素)的抗性。表17.T1擬南芥對出苗后應(yīng)用的一系列2，4-滴丙酸用量的應(yīng)答。以可見損傷百分比2WAT顯示應(yīng)答。以表現(xiàn)無損傷或幾乎無損傷(＜20％)、中度損傷(20-40％)或嚴(yán)重損傷(＞40％)的個體的直方圖顯示數(shù)據(jù)。由于每株個體都是獨立的轉(zhuǎn)化事件，可以預(yù)計在給定劑量內(nèi)個體T1應(yīng)答的顯著變異。顯示了每個處理的算術(shù)平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。還在最后一列標(biāo)出了每一劑量和轉(zhuǎn)化的個體應(yīng)答的范圍。轉(zhuǎn)化PAT/Cry1F的擬南芥作為生長素敏感型轉(zhuǎn)化對照。野生型擬南芥未轉(zhuǎn)化。表17.T1擬南芥對出苗后使用的一系列2，4-滴丙酸劑量的應(yīng)答。表18.T1擬南芥對出苗后以人工高劑量使用的一系列吡氟氯禾靈劑量的應(yīng)答，試圖顯示雙子葉擬南芥對禾本科除草劑的耐性。以可見損傷百分比2WAT顯示應(yīng)答。以表現(xiàn)無損傷或幾乎無損傷(＜20％)、中度損傷(20-40％)或嚴(yán)重損傷(＞40％)的個體的直方圖顯示數(shù)據(jù)。由于每株T1都是獨立的轉(zhuǎn)化事件，可以預(yù)計在給定劑量內(nèi)個體T1應(yīng)答的顯著變異。顯示了每個處理的算術(shù)平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。還在最后一列標(biāo)出了每一劑量和轉(zhuǎn)化的個體應(yīng)答的范圍。轉(zhuǎn)化PAT/Cry1F的擬南芥作為生長素敏感型轉(zhuǎn)化對照。野生型擬南芥未轉(zhuǎn)化。表18.T1擬南芥對出苗后以人工高劑量應(yīng)用的一系列吡氟氯禾靈劑量的應(yīng)答，試圖顯示雙子葉擬南芥對禾本科除草劑的耐性。6.6-AAD-1(v3)作為選擇標(biāo)記物最初用如上述轉(zhuǎn)化的擬南芥分析使用AAD-1(v3)作為選擇標(biāo)記物的能力，其中使用2，4-滴作為選擇劑。將轉(zhuǎn)化了PAT和AAD-1(v3)(pDAB721)的T1種子種到平板上并如上述萌發(fā)，與用正常草銨膦選擇方案(5和10DAP)處理的類似種子進行比較。像先前用草銨膦那樣對幼苗擬南芥應(yīng)用2，4-滴(50gae/ha)。對應(yīng)用次數(shù)和應(yīng)用時間的變化進行了測試。每盤植物按以下處理方案接受一次或兩次應(yīng)用時間5+10DAP、5+14DAP、10DAP、10+14DAP、14DAP。在19DAP鑒定植物為抗性或敏感，并進行ELISA測試帶以測定活性PAT基因成功共轉(zhuǎn)化的頻率。種植的70000顆種子中的53顆鑒定為對2，4-滴有抗性。使用ELISA篩選此種群中44個個體的亞組的PAT蛋白表達。96％的個體為陽性，說明存在共轉(zhuǎn)化的基因PAT。陰性ELISA結(jié)果的低數(shù)目(4％)與草銨膦抗性植物群體中3％的錯誤率一致(表15)。2，4-滴的選擇效率(0.08％)看來似乎低于草銨膦(0.12％)，然而在所有實驗中的選擇率范圍說明兩種選擇劑在分別選擇轉(zhuǎn)化了AAD-1(v3)或PAT基因的擬南芥上同等優(yōu)秀。兩種依次應(yīng)用最準(zhǔn)確的鑒定了對測試的兩種除草劑有抗性的個體。6.7-遺傳力使多個T1事件自花傳粉產(chǎn)生T2種子。通過對100株隨機T2同胞應(yīng)用2，4-滴(200gae/ha)對這些種子進行子代測試。在噴灑應(yīng)用(187L/ha的應(yīng)用量的履帶式噴霧機)之前，先將每個T2個體植物移植到7.5cm見方的盆中?？ǚ椒治?P＞0.05)確定超過60％的T1家族(T2植物)以預(yù)期的孟德爾遺傳單基因座顯性遺傳的3抗性1敏感模式分離。收集12到20個T2個體的種子(T3種子)。如前述對任意8個隨機選擇T2家族中每個家族的25個T3幼苗進行子代測試。在每個測試株系中鑒定了約三分之一的預(yù)期為純合的T2家族(未分離種群)范圍為測試家族的八分之一到八分之四。這些數(shù)據(jù)顯示AAD1(v3)穩(wěn)定整合，且以孟德爾方式遺傳至少3代。6.8-擬南芥中歸因于AAD-1的其他除草劑抗性使用改良的體外平板測定測試AAD-1(v3)在轉(zhuǎn)基因擬南芥中提供對其他芳氧基苯氧鏈烷酸酯除草劑抗性的能力。通過在50％漂白劑溶液中搖動10分鐘使來自野生型擬南芥和含有植物優(yōu)化AAD-1(v3)基因的擬南芥(T4純合植物名＝PAAD1.315.064)的種子滅菌。然后用無菌水洗滌這些種子四次除去漂白劑。劑量應(yīng)答測定使用補充了多種劑量的測試化合物的營養(yǎng)培養(yǎng)基(見下文)。以DMSO中的濃縮液將測試化合物加入熱培養(yǎng)基(55℃)中。對照孔含有適當(dāng)量的無其他化合物的DMSO。DMSO的終濃度不超過1％(體積/體積)。徹底混合后，將含有適當(dāng)濃度化合物的溫培養(yǎng)基加入6孔平底聚苯乙烯組織培養(yǎng)皿(Falcon353046，BectonDicksonandCompany，F(xiàn)ranklinLakes，NJ)的孔中。培養(yǎng)基凝固后，在固體培養(yǎng)基上應(yīng)用20到30個擬南芥種子并將剩余的2mL培養(yǎng)基倒在種子上。輕柔搖動平板使種子分散，蓋上蓋子并冷卻至培養(yǎng)基完全凝固。在持續(xù)熒光照明(75μEm-2s-1)下在25℃孵育平板7天。營養(yǎng)培養(yǎng)基的組成描述于實施例2.2和Somerville和Orgen(1982)。生長下降的評估目測評估在經(jīng)處理培養(yǎng)基中培養(yǎng)的擬南芥的頂端部分和在僅含DMSO的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的植物的頂端部分。以生長下降的百分比記錄值。通過小心的將植物從培養(yǎng)基中拉出并測量根長來評估在經(jīng)處理培養(yǎng)基中培養(yǎng)的擬南芥根生長的抑制。然后將這些根長度與對照植物的根長度進行比較以測定生長下降百分比。每個處理至少評估5株植物。記錄的值為所有評估植物的平均值。測定對野生型和轉(zhuǎn)化AAD-1的擬南芥的根和芽達到50％抑制效應(yīng)的計算濃度(I50)。表19中包含了抗性與敏感性生物型的比值。根和芽測量都大于2的比值一般表示顯著的抗性。比例越高，抗性水平越高。所有商品苯氧基生長素均顯示顯著水平的抗性，包括羥乙基酸(2，4-滴和MCPA)和羥丙基酸(2，4-滴丙酸和2-甲-4-氯丙酸)。事實上，長期根評估顯示AAD-1(v3)對羥丙基酸的抗性高于羥乙基酸，與AAD-1(v1)的酶特征一致。其他含有吡啶環(huán)的生長素的評估顯示未對擬南芥提供對除草劑triclopyr、氟草煙和或鄰吡啶甲酸除草劑落葉素的保護。首先在植物中報道了廣泛的苯氧基生長素抗性。AAD-1未能保護的其他備選生長素將是用于控制和遏制轉(zhuǎn)化AAD-1的商品作物或?qū)嶒炛参镂锓N的可靠工具。6.9-AAD-1擬南芥中的葉敷除草劑抗性通過葉敷應(yīng)用實施例6.8中所述的多種底物測定AAD-1(v3)在轉(zhuǎn)基因擬南芥中提供對其他芳氧基苯氧鏈烷酸酯生長素除草劑的抗性的能力。使T4代擬南芥種子(AAD-1(v3)純合)(株系A(chǔ)ADI.01.315.076)成層并種到與擬南芥相似的選擇盤(實施例6.4)中。以類似的方式種植含有PAT和昆蟲抗性基因Cry1F的轉(zhuǎn)化對照株系。將苗轉(zhuǎn)移到溫室中單獨的3英寸盆中。以187L/ha用履帶式噴霧機對所有植物噴灑。對植物噴灑一系列苯氧基生長素除草劑12.5-1600gae/ha2，4-滴二甲胺鹽(DMA)(RiversideChemicals)、12.5-1600gae/ha2-甲-4-氯丙酸(AHMarks)、50-3200gae/haR-2，4-滴丙酸(AHMarks)、8.75-1120gae/ha2，4，5-三氯苯氧乙酸(工業(yè)級)、pyridyloxyacetates除草劑、50-3200gae/hatriclopyr(DowAgroSciences)和50-3200gae/ha氟草煙(DowAgroSciences)以及由AAD-1活性引起的2，4-滴代謝物2，4-二氯苯酚(DCP，Sigma)(50-3200gae/ha，工業(yè)級)。所有的應(yīng)用都配制到200mMHepes緩沖液(pH7.5)中。每個處理重復(fù)3-4次。在處理后第3和第14天評估植物并對兩次實驗進行平均。這些結(jié)果(見表20)證實在擬南芥中提供對苯氧乙酸生長素、苯氧丙酸生長素提供強抗性，但未對測試的pyridyloxyacetic生長素顯示明顯的交叉抗性，并證實了體外酶和全平板底物特異性數(shù)據(jù)。另外，代謝物2，4-二氯苯酚(DCP)對野生型或轉(zhuǎn)基因擬南芥無影響。6.10-擬南芥中植物生長與AAD-1(v3)表達的關(guān)系設(shè)計了檢測AAD-1(v3)在擬南芥中的不同生長階段中表達水平是否發(fā)生變化的實驗。在溫室中培養(yǎng)高耐性純合AAD-1(v3)T4株系(編號PAAD1.01.345.163)。(如前述)用800gae/ha的2，4-滴處理一半植物，而另一半不處理。在4、10、14、20和25DAT從(處理和未處理的)5株植物獲得兩片葉(頂端第3片葉和底端第5片葉)通過ELISA和Western印跡(如實施例11所述)進行分析。圖8A和8B顯示在幼葉和老葉中AAD-1(v3)表達無統(tǒng)計學(xué)差異。此外，除草劑2，4-滴對AAD-1(v3)蛋白的表達水平幾乎無影響。在較老的植物中蛋白質(zhì)水平發(fā)生累積，而在較后的時間點則有顯著的蛋白質(zhì)降解。在分開的實驗中，對顯示不同除草劑2，4-滴耐性水平的四個不同的擬南芥純合T4株系噴灑多種水平(0、200、800和3200g/ha)的2，4-滴，并檢查其除草劑損傷和AAD-1(v3)表達。除草劑處理四天后，甚至在測試的最高劑量下在四個株系中的三個中幾乎未觀察到損傷(圖9A)。這些植物也表達高水平的AAD-1(v3)，從0.1到0.25％(圖9B)。相反，低耐性株系在TSP中表達少于0.1％的AAD-1(v3)，并受到可見的損傷。更重要的，它們在14DAT從損傷中恢復(fù)(圖9A)，說明低水平的AAD-1(v3)表達能使植物免遭嚴(yán)重的除草劑損傷。所有的對照植物均遭受嚴(yán)重損傷并在800gae/ha2，4-滴劑量及以上時在14DAT死亡。6.11-AAD-1(v3)擬南芥的分子分析用總DNA進行用于PAT基因拷貝數(shù)的侵入物測定(ThirdWaveAgbio試劑盒方案的方法)和/或Southern印跡分析以測定含有PAT和AAD-1(v3)的植物轉(zhuǎn)化單位的穩(wěn)定整合，所述總DNA使用QiagenDNeasy試劑盒從多個AAD-1(v3)純合株系獲得。由于它們包含于同一質(zhì)粒，分析假定這些基因直接物理連接。對于Southern分析，將總計1μgDNA用NsiI過夜消化，以得到pDAB721的整合數(shù)據(jù)。以40伏將這些樣品在大0.85％瓊脂糖凝膠上電泳過夜。然后在0.2MNaOH、0.6MNaCl中使凝膠變性30分鐘。接著使凝膠在pH7.5的0.5MTrisHCl、1.5MNaCl中中和30分鐘。接著裝配含有20SSC的凝膠裝置以過夜得到凝膠到尼龍膜(MilliporeINYC00010)的重力轉(zhuǎn)移。過夜轉(zhuǎn)移之后，以1200×100微焦耳通過交聯(lián)儀(stratageneUV交聯(lián)儀1800)將膜置于UV光下。接著在0.1％SDS、0.1SSC中洗膜45分鐘。洗滌45分鐘后，將膜在80℃烘干3小時并保存于4℃至雜交。雜交模板片段由設(shè)計用于獲得PAT編碼區(qū)的制備的引物(Pat5-3AGATACCCTTGGTTGGTTGC)(SEQIDNO23)和(Pat3-3CAGATGGATCGTTTGGAAGG)(SEQIDNO24)組成。將產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上電泳并切下，接著使用Qiagen(28706)凝膠提取方案提取凝膠。接著將膜在PerfectHyb緩沖液(SigmaH7033)中置于60℃的預(yù)雜交步驟1小時。使用PrimeitRmTdCTP-labelingrxn(Stratagene300392)方案使基于p32的探針(PerkinElmer)顯色。使用ProbeQuant提純探針。用每毫升二百萬計數(shù)CPM的PerfectHyb緩沖液與southern印跡雜交過夜。過夜雜交后將印跡在65℃下接受兩次0.1％SDS，0.1SSC的20分鐘洗滌。接著使印跡接觸膠片過夜，在-80℃孵育。結(jié)果顯示測試的所有2，4-滴抗性植物都含有PAT(從而推斷也含有AAD-1(v3))?？截悢?shù)分析顯示總插入片段的范圍從1到＞10個拷貝。這也與AAD-1(V3)蛋白表達數(shù)據(jù)一致，指示酶的存在產(chǎn)生對所有市售苯氧乙酸和苯氧丙酸除草劑顯著高水平的抗性(＞＞200倍)。6.12-用AAD-1(v3)和草甘膦抗性基因的分子疊加轉(zhuǎn)化的擬南芥如前述產(chǎn)生含有編碼推定的草甘膦抗性性狀的pDAB3230質(zhì)粒(AAD-1(v3)+EPSPS)的T1擬南芥種子。如實施例6.6所述(只是使用的2，4-滴用量為75gae/ha)使用AAD-1(v3)作為選擇標(biāo)記物選擇T1轉(zhuǎn)化體。從第一次選擇嘗試中回收了24個T1個體轉(zhuǎn)化事件并如前述轉(zhuǎn)移到溫室中的3英寸盆中。還測試了三個不同的對照擬南芥株系野生型Columbia-0、AAD-1(v3)+PATT5純合株系(轉(zhuǎn)化了pDAB721)和PAT+Cry1F純合株系(轉(zhuǎn)化了對照)。在苗階段僅篩選pDAB3230植物的2，4-滴耐性。移植4天后，將植物平均分開，如前述通過履帶式噴霧機以200mMHepes緩沖液(pH5.5)中的0、26.25、105、420或1680gae/ha草甘膦(GlyphomaxPlus，DowAgroSciences)進行葉處理。所有的處理都重復(fù)4或5次。在處理7和14天后評估植物。計算I50值，顯示通過與AAD-1(v3)疊加的EPSPS輸入了＞14倍水平的耐性(見圖10)。AAD-1(v3)未提供對草甘膦本身的抗性(參考pDAB721應(yīng)答)。將這些T1植物培養(yǎng)至產(chǎn)生種子，自交以獲得T2種子。已證明PDAB3230T1植物對致死劑量的2，4-滴和草甘膦具有耐性。將進一步測試T2植物以證明這些共轉(zhuǎn)化植物可經(jīng)受如實施例21所述和實施例8中AAD-1(v3)轉(zhuǎn)化玉米中所示的以罐混應(yīng)用的草甘膦+2，4-滴。實施例7-頸須介導(dǎo)轉(zhuǎn)化進玉米和用AAD-1(v3)作為選擇標(biāo)記物的用途7.1-AAD-1(v3)的克隆從NcoI/SacI片段得到AAD-1(v3)片段。用NcoI和SacI消化構(gòu)建體pDAB4005并分離5175bp的骨架片段。使用T4DNA連接酶將兩個片段連接在一起并轉(zhuǎn)化進DH5α細胞。使用Qiagen的QIASpin小量制備試劑盒對得到的菌落進行小量制備，消化菌落以檢查方向。正確的中間質(zhì)粒命名為pDAB3403。用NotI消化pDAB3403和pDAB8505(OsAct1/PAT/ZmLip)。分離并純化來自pDAB3403的3442bp條帶和來自pDAB8505的11017bp條帶。將片段連接到一起，轉(zhuǎn)化進DH5α并篩選得到質(zhì)粒的方向。最終的構(gòu)建體命名為pDAB3404，含有ZmUbil/po-aad1/ZmPer5::OsActl/PAT/ZmLip。7.2-愈傷組織/懸液起始為得到用于愈傷組織培養(yǎng)物起始的未成熟胚，進行溫室培養(yǎng)的Hi-II親本A和B(Armstrong等1991)之間的F1雜交。當(dāng)胚大小為1.0-1.2mm(授粉后約9-10天)時，收獲穗并通過用Liqui-Nox_皂擦洗、浸入70％乙醇2-3分鐘接著浸入20％商品漂白劑(0.1％次氯酸鈉)30分鐘來表面滅菌。在無菌蒸餾水中洗滌穗，無菌切下未成熟胚并在15Ag10培養(yǎng)基(N6培養(yǎng)基(Chu等，1975)、1.0mg/L2，4-滴、20g/L蔗糖、100mg/L酪蛋白水解物(酶消化)、25mML-脯氨酸、10mg/LAgNO3、2.5g/LGelrite，pH5.8)上培養(yǎng)。在約6周中以兩周間隔選擇性的將顯示正確形態(tài)(Welter等，1995)的組織轉(zhuǎn)移到新的15Ag10培養(yǎng)基上，接著在約2個月中以兩周間隔轉(zhuǎn)移到4培養(yǎng)基(N6培養(yǎng)基(Chu等，1975)，1.0mg/L2，4-滴、20g/L蔗糖、100mg/L酪蛋白水解物(酶消化)、6mML-脯氨酸、2.5g/LGelrite，pH5.8)上。為起始胚胎發(fā)生的懸液培養(yǎng)物，將約3ml細胞壓積(PCV)來源于單個胚的愈傷組織加入約30mlH9CP+液體培養(yǎng)基(MS基礎(chǔ)鹽混合物(Murashige和Skoog，1962)、改良的MS維生素(含有更少煙酸(10倍)和更多(5倍)硫胺-HCl)、2.0mg/L2，4-滴、2.0mg/Lα-萘乙酸(NAA)、30g/L蔗糖、200mg/L酪蛋白水解物(酸消化)、100mg/L肌醇、6mML-脯氨酸、5％(體積/體積)椰汁(在馬上進行傳代培養(yǎng)前加入)，pH6.0)中。在暗條件下，以28℃、125rpm在控溫振蕩器上的125ml錐形瓶中維持懸浮培養(yǎng)。一般在起始后2到3個月建立細胞系。在建立中，每3.5天通過使用廣口移液管將3mlPCV的細胞和7ml條件培養(yǎng)基加入20ml新鮮H9CP+液體培養(yǎng)基中進行傳代培養(yǎng)。當(dāng)組織開始倍增生長時，將懸液擴大規(guī)模并在500ml瓶中維持，其中把12mlPCV的細胞和28ml的條件培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到80mlH9CP+培養(yǎng)基中。懸液完全建立后將其深低溫保藏以備將來使用。7.3-懸液的深低溫保藏和融化傳代培養(yǎng)后兩天，將4mlPCV的懸浮細胞和4ml條件培養(yǎng)基加入8ml冷動保護劑(1M甘油、1MDMSO、2M蔗糖，溶于無椰汁的H9CP+培養(yǎng)基中，過濾滅菌)中，并在125ml瓶中以125rpm在4℃振蕩1小時。1小時之后，將4.5ml加入冷的5.0mlCorning凍存管中。裝滿后，將單個管在控速制冷器中在4℃保持15分鐘，接著以-0.5℃/分鐘的速度將其冷凍，直至達到-40℃的終溫度。達到終溫度后，將管轉(zhuǎn)移到充滿液氮蒸汽的Cryoplus4存儲單元(FormaScientifific)內(nèi)架子上的盒內(nèi)。融化時，將管從存儲裝置中取出并置于封閉的干冰容器中，接著投入保持于40-45℃的水浴中直至“沸騰”平息。融化后，將內(nèi)含物倒在有蓋的100×25mm培養(yǎng)皿中約8層的無菌70mmWhatman濾紙(No.4)層上。使液體吸收到濾紙中幾分鐘，接著將含有細胞的頂層濾紙轉(zhuǎn)移到GN6培養(yǎng)基(N6培養(yǎng)基，2.0mg/L2，4-滴、30g/L蔗糖、2.5g/LGelrite，pH5.8)上1周。1周后，僅將形態(tài)有希望的組織直接從濾紙上轉(zhuǎn)移到新鮮的GN6培養(yǎng)基上。每7-14天傳代培養(yǎng)此組織至1到3克，可用于125ml錐形瓶中約30mlH9CP+培養(yǎng)基中的懸液起始。每3.5天將3mlPCV在新的H9CP+培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，直至得到總計12mlPCV，此時如前述傳代培養(yǎng)。7.4-非轉(zhuǎn)化組織對吡氟氯禾靈酸的劑量應(yīng)答將非轉(zhuǎn)化供體Hi-II細胞系混合在一起、無DNA地進行頸須處理、以每個濾器6ml的用量過濾到GN6培養(yǎng)基上并在28℃愈傷2-3周。每次處理將約200mg愈傷懸浮組織轉(zhuǎn)移到60×20mm平板中含有30、100或300nMR-吡氟氯禾靈酸的選擇培養(yǎng)基上。每個濃度使用三個重復(fù)。還包括了含有1mg/L雙丙氨磷(來自除草劑商業(yè)配方，MeijiSeika，Japan)、GN6(1H)的對照培養(yǎng)基用于比較。2周后移出愈傷組織，稱重并轉(zhuǎn)移到同樣濃度的新培養(yǎng)基中再培養(yǎng)兩周。經(jīng)過總計4周時間后，移出組織，在終時間稱重并丟棄。結(jié)果示于圖11。還分別進行了愈傷組織對吡氟氯禾靈和氰氟草酯酚降解產(chǎn)物的兩個劑量應(yīng)答研究，以證實此終產(chǎn)物對愈傷組織生長是無害的。來自氰氟草酯酚劑量應(yīng)答(見圖12)的數(shù)據(jù)顯示在1μM氰氟草酯酚下，生長仍高達無氰氟草酯酚對照的76％。來自吡氟氯禾靈酚劑量應(yīng)答的數(shù)據(jù)顯示在300nM吡氟氯禾靈酚下，生長與無吡氟氯禾靈酚對照相同或更高(數(shù)據(jù)未顯示)。7.5-使用雙丙氨磷選擇的頸須介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化前約24小時，將12ml前述冷凍保存的胚胎發(fā)生玉米懸浮細胞加28ml條件培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)到500ml錐形瓶中的80mlGN6液體培養(yǎng)基(缺少Glerite的GN6培養(yǎng)基)中，并置于28℃下125rpm的振蕩器上。使用同一細胞系重復(fù)2次，以將36mlPCV分配到3個錐形瓶中。24小時后去除GN6液體培養(yǎng)基，用每瓶72mlGN6S/M滲透培養(yǎng)基(N6培養(yǎng)基、2.0mg/L2，4-滴、30g/L蔗糖、45.5g/L山梨醇、45.5g/L甘露醇、100mg/L肌醇，pH6.0)代替，以使細胞原漿分離。將瓶在黑暗中置于振蕩器上30-35分鐘，其間通過將適當(dāng)體積的GN6S/M液體培養(yǎng)基加入約405mg預(yù)先高壓滅菌的碳化硅頸須(AdvancedCompositeMaterials，Inc.)來制備50mg/ml的碳化硅頸須懸液。在GN6S/M中孵育后，將每個瓶的內(nèi)含物在250ml離心瓶中混合。當(dāng)細胞沉降到底部時，去除液體至只余約14ml并收集在無菌1L瓶中以備將來使用。將預(yù)濕潤的頸須懸液以最大速度渦旋60秒并在將8.1mL加入瓶底，最后一步在其中加入170μgDNA。立即將瓶置于改良的RedDevil5400商品油漆混合器中振蕩10秒。振蕩后，細胞、培養(yǎng)基、頸須和DNA的混合物與125ml新的GN6液體培養(yǎng)基一起加入1L瓶的內(nèi)含物中以減少osmoticant。在使用與房間真空線連接的玻璃試池收集單元過濾到Whatman#4濾紙(5.5cm)上之前，使細胞在振蕩器上恢復(fù)2小時。將3或6mL分散的懸液吸到用真空抽吸的濾紙表面。將濾紙置于GN6培養(yǎng)基的60×20mm平板上。在28℃下將平板在暗盒中培養(yǎng)1周，暗盒用單層塑料(厚度＜2毫米)寬松密封以使個體平板的蒸發(fā)最小化。1周后，將濾紙轉(zhuǎn)移到GN6(1H)培養(yǎng)基(N6培養(yǎng)基、2.0mg/L2，4-滴、30g/L蔗糖、100mg/L肌醇、1.0mg/L雙丙氨磷、2.5g/LGelrite、pH5.8)或GN6D(1H)培養(yǎng)基(除了8.0mg/L二氯甲氧丙酸和0.8mg/L2，4-滴之外與GN6(1H)相同)的60×20mm平板。將平板置于盒中并如上文再培養(yǎng)一周。轉(zhuǎn)化兩周后，通過刮下平板上的1/2細胞或平板上的全部細胞至3.0mL融化的含有1mg/L雙丙氨磷的GN6瓊脂糖培養(yǎng)基(N6培養(yǎng)基，2.0mg/L2，4-滴、30g/L蔗糖、100mg/L肌醇、7g/LSeaPlaque瓊脂糖，pH5.8，在121℃僅高壓滅菌10分鐘)來包埋組織。破碎組織并將3mL瓊脂糖和組織均勻倒在GN6(1H)或GN6D(1H)的100×15mm平板上。對所有剩余的平板重復(fù)此處理。包埋后，用Nescofilm_或ParafilmM_單個密封并在28℃下在暗盒中培養(yǎng)1周。推定的轉(zhuǎn)化分離物一般在轉(zhuǎn)化首先在5-8周后可見。從包埋的平板中移出任何可能的分離物并轉(zhuǎn)移到60×20mm平板中同樣濃度的新鮮選擇培養(yǎng)基中。如果在約2周后持續(xù)生長很明顯，則認(rèn)為事件是有抗性的并進行分子分析。通過將愈傷組織轉(zhuǎn)移到基于細胞分裂素的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中起始再生，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基含有1mg/L雙丙氨磷、MS鹽和維生素、30.0g/L蔗糖、5mg/LBAP、0.25mg/L2，4-滴、2.5g/LGelrite，pH5.7。在轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基36(1H)之前，先使細胞在低光照(13μEm-2s-1)下生長一周，接著在較高的光照(40μEm-2s-1)下再生長一周，所述再生培養(yǎng)基除了缺乏植物生長調(diào)節(jié)劑之外與28(1H)相同。移出3-5cm的小植株并置于含有非選擇SHGA培養(yǎng)基(Schenk和Hildebrandt基礎(chǔ)鹽和維生素，1972、1g/L肌醇、10g/L蔗糖、2.0g/LGelrite，pH5.8)的150×25mm培養(yǎng)管中。一旦小植株發(fā)育出足夠的根和芽系統(tǒng)，將其移植到溫室的土壤中。7.6-使用吡氟氯禾靈選擇的頸須介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化除了一起共轉(zhuǎn)化85μgpDAB-3403和85μg含有GFP(綠色熒光蛋白)報道基因的構(gòu)建體，并且在2小時恢復(fù)后僅將3mL懸液過濾到GN6培養(yǎng)基上之外，正選擇“fop”的DNA遞送參數(shù)與雙丙氨磷選擇的方案相同。在GN6非選擇培養(yǎng)基上0-7天之后，將濾紙轉(zhuǎn)移到含有2mg/L2，4-滴加50、100或200nMR-吡氟氯禾靈酸的GN6培養(yǎng)基的60×20mm平板上。將平板置于盒中再培養(yǎng)一周。一周后，向前述轉(zhuǎn)移一樣通過從平板刮下全部細胞至3.0mL融化的含有相同濃度選擇劑的GN6瓊脂糖培養(yǎng)基中來包埋組織。其后所有步驟都與PAT選擇/再生方案相同，只是在再生培養(yǎng)基中用100nMR-吡氟氯禾靈代替1mg/L雙丙氨磷。7.7-結(jié)果起始了測試多種吡氟氯禾靈和氰氟草酯水平的的多個實驗，從定向選擇中回收了47個分離物。將愈傷組織事件的亞群提交使用PCR和Western分析進行的篩選。根據(jù)這些表達數(shù)據(jù)，將21個領(lǐng)先事件提交Southern分析。使用單切割酶NcoI在用AAD-1(v3)探查之后獲得整合數(shù)據(jù)的結(jié)果明確證明與“fop”選擇偶聯(lián)的頸須介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化之后AAD-1(v3)的穩(wěn)定整合。7.8-定量證明來自雙丙氨磷選的表達AAD-1(3)的愈傷組織事件的體外耐性對從雙丙氨磷選擇中再生的97個愈傷組織分離物通過侵入物分析進行PAT拷貝計數(shù)并通過PCR進行AAD-1(v3)PTU分析(見實施例7.10)。對事件的亞群完成使用Western印跡/夾層ELISA(實施例11)的AAD-1(v3)蛋白表達。概述于下文的表21。從每一個這些事件中再生了至少15個T0植物，并用于噴灑測試和苗產(chǎn)生。在劑量-應(yīng)答研究中對這些轉(zhuǎn)化事件的亞群與未轉(zhuǎn)化對照相比進行評估。測試了高至400nM的一系列吡氟氯禾靈(來自GallantSuper配方)濃度。使用實施例7.4的一般方法產(chǎn)生了一個事件3404-006的劑量應(yīng)答數(shù)據(jù)，并示于圖13。這證明事件3404-006在高至400nM濃度的吡氟氯禾靈下未顯示愈傷組織生長的顯著降低，而未轉(zhuǎn)化玉米愈傷組織的生長在此用量下被抑制。這些數(shù)據(jù)未進行標(biāo)準(zhǔn)化以消除與轉(zhuǎn)基因表達無關(guān)的內(nèi)在生長差異。7.9-使用咪草煙選擇的頸須介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化用AscI/SwaI從pDAB3404中移出ZmUbi1/AAD-1(V3)/ZmPer5盒并插入pDAB2212，以產(chǎn)生AAD-1(v3)和AHAS頸須轉(zhuǎn)化載體pDAB3415(也稱為pDAS1283)。完成后，通過如實施例7.4所述的碳化硅頸須介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(過濾2mL)將此構(gòu)建體轉(zhuǎn)化進玉米，接著在GN6培養(yǎng)基上恢復(fù)7天，接著在含有3μM咪草煙(來自Pursuit_DGherbicide)的培養(yǎng)基上進行選擇。侵入物分析之后鑒定了含有AAD-1(v3)和AHAS基因的36個事件。在ELISA和Western印跡實驗中測試了來自這些轉(zhuǎn)化的53個玉米愈傷組織事件的AAD-1(v3)表達——數(shù)據(jù)的子集示于下文。對于表22列出的事件，檢測為陽性的事件的表達水平為90到超過1000ppm的總可溶蛋白。7.10-分子分析玉米材料和方法7.10.1-收獲組織的DNA的分離和定量將新鮮組織置于管中并在4℃低壓凍干兩天。組織完全干燥后，將鎢珠(Valenite)放進管中并使用Kelco玻珠研磨機將樣品干磨1分鐘。其后遵循標(biāo)準(zhǔn)DNeasyDNA分離方案(Qiagen，DNeasy69109)。將提取的DNA的等分試樣用PicoGreen(MolecularProbesP7589)染色并與已知標(biāo)準(zhǔn)品一起在熒光計(BioTek)中讀數(shù)，以得到以ng/μl計的濃度。7.10.2-侵入物測定分析將DNA樣品稀釋到20ng/μl，接著通過在熱循環(huán)儀中在95℃孵育10分鐘變性。接著使用提供的寡核苷酸混合物和MgCl2(ThirdWaveTechnologies)制備信號探針混合物。在侵入物測定平板的每個孔中放入7.5μl的等分試樣，接著放入7.5μl對照、標(biāo)準(zhǔn)品和20ng/μl稀釋的未知樣品。用15μl液體石蠟(Sigma)覆蓋每個孔。接著將平板在63℃孵育1小時并在熒光計(Biotek)上讀數(shù)。用靶探針信號對背景的百分比除以內(nèi)參探針信號對背景的百分比計算出比值。由Southern印跡分析得到并確認(rèn)的已知拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)品的比值用于鑒定未知事件的估計拷貝數(shù)。7.10.3-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用總計100ng總DNA作為模板。使用20mM每種引物和TakaraExTaqPCR聚合酶試劑盒(MinisTAKRR001A)。用于AAD-1(v3)PTU的引物為(正向-ATAATGCCAGCCTGTTAAACGCC)(SEQIDNO25)和(反向-CTCAAGCATATGAATGACCTCGA)(SEQmNO26)。在9700Geneamp熱循環(huán)儀(AppliedBiosystems)中進行PCR反應(yīng)將樣品置于94℃3分鐘，94℃30秒、63℃30秒、72℃1分45秒的35個循環(huán)和其后72℃的10分鐘。用于AAD-1(v3)編碼區(qū)PCR的引物為(正向-ATGGCTCATGCTGCCCTCAGCC)(SEQIDNO27)和(反向-CGGGCAGGCCTAACTCCACCAA)(SEQIDNO28)。在9700Geneamp熱循環(huán)儀(AppliedBiosystems)中進行PCR反應(yīng)將樣品置于94℃3分鐘，94℃30秒、65℃30秒、72℃1分45秒的35個循環(huán)和其后72℃的10分鐘。通過用溴化乙啶染色的1％瓊脂糖凝膠上的電泳分析PCR產(chǎn)物。7.10.4-Southern印跡分析用得自QiagenDNeasy試劑盒的總DNA進行Southern印跡分析。用AflII過夜消化總計2μgDNA，還用EcoRV消化pDAB3404、用NcoI消化pDAB3403、用Spel消化pDAB1421以得到整合數(shù)據(jù)。過夜消化后在1％凝膠上電泳約100ng的等分試樣以確認(rèn)完全消化。確認(rèn)后將樣品在大塊0.85％瓊脂糖凝膠上以40伏電泳過夜。接著在0.2MNaOH、0.6MNaCl中使凝膠變性30分鐘。接著將膠在pH7.5的0.5MTrisHCl、1.5MNaCl中中和30分鐘。接著裝配含有20×SSC的凝膠裝置以過夜得到凝膠到尼龍膜(MilliporeINYC00010)的重力轉(zhuǎn)移。過夜轉(zhuǎn)移之后，以1200×100微焦耳通過交聯(lián)儀(stratageneUV交聯(lián)儀1800)將膜置于UV光下。接著在0.1％SDS、0.1SSC中洗膜45分鐘。洗滌45分鐘后，將膜在80℃烘干3小時并保存于4℃至雜交。使用上述用質(zhì)粒pDAB3404的編碼區(qū)PCR制備雜交模板片段。在1％瓊脂糖凝膠上電泳產(chǎn)物并切開，接著使用Qiagen(28706)凝膠提取方案提取凝膠。接著將膜在PerfectHyb緩沖液(SigmaH7033)中置于60℃的預(yù)雜交步驟1小時。使用PrimeitRmTdCTP標(biāo)記反應(yīng)(Stratagene300392)方案開發(fā)基于p32的探針(PerkinElmer)。使用ProbeQuant.G50柱(Amersham27-5335-01)提純探針。用每毫升二百萬計數(shù)CPM的PerfectHyb緩沖液與southern印跡雜交過夜。過夜雜交后將印跡置于65℃下在0.1％SDS，0.1SSC中20分鐘的兩次洗滌中。接著使印跡接觸膠片過夜，在-80℃孵育。實施例8-由PAT選擇(pDAB3404)的AAD-1(v3)事件產(chǎn)生的體內(nèi)耐性和大田耐性數(shù)據(jù)8.1-T0玉米植物對AOPP除草劑的耐性如果成功產(chǎn)生了每個事件超過15個的克隆植物，則將額外的植物轉(zhuǎn)移到溫室用于在出苗后對T0玉米植物使用AOPP除草劑進行的初步耐性篩選。使適應(yīng)溫室的植物生長至從輪生體長出2-4片新的外觀正常的葉(即植物已由組織培養(yǎng)轉(zhuǎn)變到溫室生長條件)。在溫室中在16小時光照8小時黑暗的條件下已27℃培養(yǎng)植物。然后用三種AOPP除草劑之一的商品制劑處理植物Assure_II(DuPont)、Clincher*(DowAgroSciences)或GallantSuper*(DowAgroSciences)，分別為喹禾靈、氰氟草酯或吡氟氯禾靈。以187L/ha的噴灑體積、50cm的噴灑高度用履帶式噴霧機使用除草劑，所有的噴灑都含有1％(體積/體積)的Agridex作物油濃縮佐劑。由于每個事件的再生和順應(yīng)的速率不同，每周每個事件的克隆數(shù)都發(fā)生變化?？傊?，試圖用一系列除草劑劑量(范圍從1×致死劑量(約1/8大田劑量)上至8×大田劑量(64×致死劑量))處理每個事件的代表性克隆。致死劑量定義為導(dǎo)致Hi-II近交株＞95％損傷的劑量。Hi-II是本發(fā)明轉(zhuǎn)化體的遺傳背景。通常AOPP是非常高效的殺死玉米的除草劑。用分別為8.8、62.5和4.4gae/ha的吡氟氯禾靈、氰氟草酯和喹禾靈可有效殺死(＞95％損傷)由種子培養(yǎng)的三到四葉的Hi-II玉米。測試的每個AAD-1(v3)轉(zhuǎn)化株系都在測試的每個AOPP除草劑的最小致死劑量下存活。事實上，甚至在用8×大田劑量(64×致死劑量)的喹禾靈處理時，測試的多數(shù)株系無可見損傷(14DAT)的存活下來。然而，來自事件“017”和“038”的若干個體克隆在提高的劑量下受到嚴(yán)重的損傷。這可能是由于基因插入的方式或位置引起降低基因表達的功能。甚至是在植物剛從組織培養(yǎng)中移出(T0期)就使用時也在多數(shù)事件中證明了高水平的AOPP耐性。對全部三種AOPP除草劑都顯示了這一耐性，而且很可能擴展到AAD-1如前述在體外顯示的所有AOPP除草劑。圖14顯示若干轉(zhuǎn)化了AAD-1(v3)和未轉(zhuǎn)化事件的克隆對1周前應(yīng)用的致死劑量的兩種AOPP除草劑(吡氟氯禾靈和喹禾靈)的應(yīng)答。表23顯示選擇的轉(zhuǎn)化AAD-1(v3)的T0玉米事件對出苗后應(yīng)用的三種AOPP除草劑的應(yīng)答數(shù)據(jù)。(致死劑量＝(致死劑量＝(致死劑量＝8.8gae/ha)62.5gae/ha)4.4gae/ha)*Gallantsuper#+1％COC(體積/體積)**Clincher#+1％COC(體積/體積)***AssureII+1％COC(體積/體積)#DowAgroSciences，LLC的商標(biāo)8.2-pDAB3404T1玉米植物對喹禾靈、2，4-滴和草銨膦除草劑的大田耐性在Hawaii和Indiana的大田站建立了兩個大田試驗。使用近交T1植物的玉米種子評估16個AAD1事件株系針對喹禾靈和2，4-滴的耐性。包含了用于比較目的的三個未轉(zhuǎn)化雜合體。雜合體Hi-II×5XH571與AAD-1(v3)事件株系的家系相同。雜合體Croplan585SR是sethoxydim抗性株系。實驗設(shè)計為四次重復(fù)的分割區(qū)(split-plot)。主區(qū)為除草劑處理，小區(qū)為AAD-1(v3)事件或比較雜合體。區(qū)為3.7米的一行，每行種植約25個種子。對于AAD-1事件，在每個重復(fù)中種植來自事件內(nèi)不同譜系的種子。在V2期對AAD-1(v3)區(qū)使用560gai/ha的草銨膦以清除未轉(zhuǎn)化植物。實驗處理包括以70和140gae/ha使用的喹禾靈商品配方、以560和1120gae/ha使用的2，4-滴(二甲胺鹽)和未處理的對照。使用以130-220kpa壓力遞送187L/ha載體體積的背包式撒播增強裝置進行處理。在V3-V4玉米期應(yīng)用喹禾靈處理，在V5-V6期應(yīng)用2，4-滴處理。在應(yīng)用后1和3周(WAA)使用0-100％的尺度目測評估用喹禾靈處理的田的作物損傷，其中0等于無損傷，100等于完全死亡。在應(yīng)用后2天(DAA)使用0-100％的尺度目測評估用2，4-滴處理的田的作物傾斜，其中0等于任何植物均無傾斜，100等于所有植物傾斜。此外，在3-4WAA使用0-10的尺度目測評估用2，4-滴處理的田的支柱根形成。8.2.1-結(jié)果表24顯示了AAD-1(v3)事件對測試中最高劑量的喹禾靈和2，4-滴的應(yīng)答。這些劑量約為正常商品用量的二倍。未轉(zhuǎn)化雜合體受到70gae/ha的喹禾靈嚴(yán)重損傷(80％-100％)，包括sethoxydim抗性株系(盡管它顯示出比其他兩種雜合體稍強的耐性)。除了3404.001事件的一個譜系之外，所有的AAD-1(v3)事件均顯示對70gae/ha的喹禾靈良好的耐性。除了上文提到的事件外，在AAD-1(v3)事件中未觀察到可見癥狀。1120gae/ha劑量的2，4-滴在未轉(zhuǎn)化雜合體中引起顯著水平(11％-33％)的偏上傾斜——超過V4生長期應(yīng)用時的正常應(yīng)答。除了3404.001(僅在Indiana處出現(xiàn)中等水平(5％-13％)的傾斜外，在所有的AAD-1(v3)事件中未觀察到或幾乎未觀察到傾斜。1120gae/ha劑量的2，4-滴使未轉(zhuǎn)化雜合體的支柱根嚴(yán)重變形(在0-10尺度中評分為9)。這同樣是在V4生長期后使用2，4-滴的正常應(yīng)答。與傾斜應(yīng)答一樣，除了3404.001一個譜系外，所有的AAD-1(v3)事件中未觀察到或幾乎未觀察到支柱根損傷。用較低測試劑量的喹禾靈和2，4-滴也出現(xiàn)類似的趨勢，盡管有所降低，但未轉(zhuǎn)化雜合體中仍有顯著水平的應(yīng)答(數(shù)據(jù)未顯示)。這些結(jié)果說明多數(shù)AAD-1(v3)轉(zhuǎn)化事件對使未轉(zhuǎn)化玉米雜合體致死或引起嚴(yán)重偏上畸形的喹禾靈和2，4-滴顯示高水平的抗性。也見圖16。8.2.2-三個T2事件的預(yù)期孟德爾分離比例在大田中使來自每個事件的單個譜系的植物隨機自花受粉。在生理成熟后手工收獲T2種子。基于單基因拷貝數(shù)(見上文表24)和T1代的總體性能(分離、除草劑耐性和活力)選擇了三個事件(022、031和074)在大田中進一步評估。使用各含有2500-3000個種子的精密錐形播種器種植每個事件的育種行。在V2生長期如前述使用背包式噴霧器對所有的AAD-1(v3)株系噴灑140gae/ha喹禾靈(Assure_II)。此劑量迅速殺死所有的“空”(未轉(zhuǎn)化)分離子。每個事件都具有與單基因座顯性基因的孟德爾遺傳一致的分離比(3抗性1敏感性，或75％存活)(見表24)。通過接合性測試(參考玉米AAD-1(v3)侵入物測定的描述)鑒定來自事件74的純合子和雜合子。去除半合子植物并使純合植物與BE1146玉米(近交滲透并純合對草甘膦的抗性性狀，NK603)雜交，產(chǎn)生對草甘膦抗性、AAD-1(v3)和草銨膦抗性均為半合子的同質(zhì)F1雜合體。8.3-在玉米中將AAD-1(v3)和PAT與草甘膦抗性基因疊加。如先前的實施例所述將純合T2AAD-1(v3)/PAT玉米植物與草甘膦抗性玉米植物雜交產(chǎn)生含有AAD-1(v3)、PAT和草甘膦抗性基因的F1種子。將F1種子單獨種在用Metro-Mix_360生長培養(yǎng)基(SunGroHorticulture)制備的3英寸盆中。開始用Hoagland溶液地下灌溉至濕透，接著重力排水，并在溫室中16小時光8小時黑暗的條件下以27℃培養(yǎng)。在研究的剩余部分中用去離子水地下灌溉植物。使植物生長至從出現(xiàn)2-4片葉。在這個點以187L/ha的噴灑體積、50cm噴灑高度用履帶式噴霧機應(yīng)用除草劑。對植物噴灑2，4-滴DMA、草甘膦、草銨膦和這三種的多種組合。所有應(yīng)用都配制在200mMHepes緩沖液(pH7.5)中。在存在草銨膦的噴灑應(yīng)用中，與額外的2％(重量/體積)磷酸銨一起配制處理。在處理后3和14天(DAT)評估植物。就發(fā)育障礙、缺綠癥和壞死對植物給定損傷率。給出90％或以上損傷率的植物認(rèn)為是死亡。14DAT的研究結(jié)果見于表25。此研究證明玉米中的基因可與草甘膦抗性基因和草銨膦基因疊加以提供對單獨或罐混組合物中的2，4-滴、草甘膦和草銨膦的大田水平的強抗性。8.3.1-使用罐混的2，4-滴DMA和喹禾靈的AAD-1(v3)玉米抗性將半合子事件號為3404-025.001R/R001Bulked.001.S058的T2BC1種子單個種在用Metro-Mix_生長培養(yǎng)基制備的3英寸盆中。開始用Hoagland溶液地下灌溉至濕透，接著重力排水，并在溫室中16小時光8小時黑暗的條件下以27℃培養(yǎng)。在研究的剩余部分中用去離子水地下灌溉植物。使植物在溫室中生長至V1期。在這個點以187L/ha用研究用track噴灑裝置用200mMHepes緩沖液中加入了1％Agridex作物油濃縮劑的560gae/haAssure_II選擇植物。使植物生長4天以顯示選擇癥狀。所有的植物都受到損傷。以187L/ha的噴灑體積、18英寸的噴灑高度用track噴霧器進行除草劑應(yīng)用。所有的應(yīng)用都配制在加入了1％(體積/體積)Agridex的200mMHepes緩沖液(pH7.5)中。在處理后3和14天(DAT)評估植物。就發(fā)育障礙、缺綠癥和壞死對植物確定損傷率。給出90％或以上損傷率的植物認(rèn)為是死亡。來自此特定譜系的植物在14DAT對所有的罐混組合物具有0％損傷，而野生型為100％損傷。這些結(jié)果表明AAD-1(v3)不僅分別提供對2，4-滴的喹禾靈大田水平的強抗性，而且提供對過量的兩種化學(xué)品多種組合的抗性。邏輯上可以預(yù)期用苯氧基生長素和AOPP禾本科除草劑在玉米(或轉(zhuǎn)化AAD-1的其他作物)中實現(xiàn)新的雜草控制措施，這是先前用單基因HTC所不能的。8.3.2-(pDAB3403)T0玉米植物對喹禾靈除草劑的耐性再生了來自17個事件中每一事件的約8株T0植物克隆的靶標(biāo)并轉(zhuǎn)移到溫室中用于初步耐性篩選，其中使用前述的track噴霧器條件以35gae/ha(1×大田劑量，4×致死劑量)對3葉的溫室適應(yīng)T0玉米出苗后應(yīng)用不同劑量的喹禾靈除草劑。處理后7天給植物評定為抗性或敏感性。每個噴灑應(yīng)用中都包括了對照非轉(zhuǎn)基因玉米。事件014和047這兩個事件有兩個或更多對35gae/ha的喹禾靈敏感的T0克隆，表明了此事件意外的敏感性水平。其他15個事件顯示穩(wěn)定的整合、蛋白質(zhì)表達和在完整植物水平耐受4×致死劑量喹禾靈的能力。8.3.3關(guān)于喹禾靈耐性的AAD-1(v3)表達選擇用Liberty_(如前述)預(yù)篩選以去除空轉(zhuǎn)化的來自3404轉(zhuǎn)化的三個不同T2譜系關(guān)于其AAD-1(v3)表達比較其對喹禾靈的耐性。在14DAT(數(shù)據(jù)未顯示)和30DAT(見圖15)測量表達。在1×和更高的大田劑量下，最高耐性的株系(事件3404-074)總是表達比其他兩個事件更高量的AAD-1(v3)。從此數(shù)據(jù)可以得出結(jié)論，表達AAD-1(v3)的玉米在16倍于35g/ha1×大田劑量的測試最高水平(2,240g/ha)受到保護免受喹禾靈的損傷。此外，表達水平在整個實驗期中保持一致。實施例9-AAD-1(v3)由農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化。9.1-植物材料將“HighII”(即親本A和B)的F1雜交(Armstrong等，1991)種子直接種在含有955的Metro-Mix_360礦物土的5加侖盆中。在溫室中以通過高壓鈉燈和金素鹵素?zé)舻慕M合補充的16小時光周期培養(yǎng)植物。9.2-組織來源未得到未成熟Hi-II(F2)胚，進行人工近親授粉。授粉當(dāng)天，將活躍的下垂雄花穗裝入袋中，收集新鮮的花粉并小心的使用在花絲上。如實施例7.2所述分離未成熟胚。9.3-超級二元載體的制備通過從含有ZmUbi1v2/AAD-1(V3)/ZmPer5v2的pDAB3404上分離3443堿基對的NotI片段并插入pDAB8549的NotI位點完成農(nóng)桿菌構(gòu)建體pDAB2272的構(gòu)建，所述農(nóng)桿菌構(gòu)建體含有與AHAS選擇標(biāo)記物組合的AAD-1(v3)基因。得到的質(zhì)粒含有ZmUbi1v2/AAD-1(V3)/ZmPer5v2和OsAct1v2/AHASv3/ZmLipv1盒，兩側(cè)為同一方向的非全同MAR區(qū)。接著將其轉(zhuǎn)化進LBA/4404/pSBI以產(chǎn)生命名為pDAB3602的超級二元載體，也稱為pDAS1421。9.4-細菌供給所有的轉(zhuǎn)化使用U.S.專利No.5,591,616中(轉(zhuǎn)化單子葉植物的方法)所述來自JapanTobacco的“超級二元”載體。為制備用于處理的農(nóng)桿菌懸液，將來自YP劃線平板的1-2菌環(huán)pDAS1421重組細菌放入5mlLS-inf.Mod培養(yǎng)基(LS基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Linsmaier和Skoog，1965)、N6維生素、1.5mg/L2，4-滴、68.5g/L蔗糖、36.0g/L葡萄糖、6mML-脯氨酸，pH5.2)中。渦旋混合物直至得到均勻的懸液。使用Klett-Summerson光電比色計通過讀出溶液的密度測定細菌濃度。將溶液調(diào)整至Klett200(約1×109cfu/ml)濃度并在溶液中加入100μMactetosyringone。9.5-感染和共培養(yǎng)將未成熟胚直接分離到含有2mlLS-inf.Mod液體培養(yǎng)基的離心管中。將含有約100個胚的每個管渦旋3-5秒。去除培養(yǎng)基并用新鮮液體培養(yǎng)基代替，再次渦旋。再次去除培養(yǎng)基，這次用Klett200濃度的農(nóng)桿菌溶液代替。將農(nóng)桿菌和胚的混合物渦旋30秒。在室溫孵育5分鐘后，將胚轉(zhuǎn)移到LS-AsMod培養(yǎng)基(LS基礎(chǔ)培養(yǎng)基、N6維生素、1.5mg/L2，4-滴、30.0g/L蔗糖、6mML-脯氨酸、0.85mg/LAgNO3、1,100μMactetosyringone、3.0g/LGelrite，pH5.2)，在25℃共培養(yǎng)5天。9.6-使用未成熟胚的劑量應(yīng)答用缺乏前述質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌株LBA4404處理未成熟胚開始劑量應(yīng)答研究。處理后，將胚在25℃共培養(yǎng)5天，接著轉(zhuǎn)移到含有多種水平的R-吡氟氯禾靈或R-氰氟草酯的選擇培養(yǎng)基。還將胚轉(zhuǎn)移到含有1mg/L雙丙氨膦和100nM咪草煙的培養(yǎng)基作物陰性對照。兩周后就胚胎發(fā)生愈傷組織形成的百分比對胚胎評分，4周后再次評分。在高至30nM的R-吡氟氯禾靈水平測試胚，然而在最高水平下未觀察到愈傷組織形成的足夠下降，因此在轉(zhuǎn)化實驗中使用了更高(50-100nM)的濃度。來自在含有氰氟草酯的培養(yǎng)基上培養(yǎng)的胚的數(shù)據(jù)示于圖17。9.7-選擇共培養(yǎng)后，通過兩個步驟的選擇方案移動胚，其后得到轉(zhuǎn)化的分離物。為進行選擇，與一個或兩個選擇水平的吡氟氯禾靈、氰氟草酯或咪草煙一起使用LSDMod培養(yǎng)基(LS基礎(chǔ)培養(yǎng)基、N6維生素、1.5mg/L2，4-滴、0.5g/LMES、30.0g/L蔗糖、6mML-脯氨酸、1.0mg/LAgNO3、250mg/Lcephotaxime、2.5g/LGelrite，pH5.7)。在整個選擇期中，以28℃在黑暗中培養(yǎng)胚。首先將胚轉(zhuǎn)移至初始水平的選擇(50-100nMR-吡氟氯禾靈或300nMR-氰氟草酯)14天，接著以5個胚/盤的比例升級到較高的選擇水平(250-500nMR-吡氟氯禾靈酸或1.5μM氰氟草酯)。將胚的亞群類似的逐步升高到100到500nM來自Pursuit_DG的咪草煙作物陽性對照?；赨.S.專利No.5,731,180，Pursuit_用于在使用AHAS基因時作為選擇劑。以兩周間隔將組織轉(zhuǎn)移到相同的培養(yǎng)基上直至獲得胚胎發(fā)生集落。在剩余的培養(yǎng)期中在高選擇壓下維持這些集落。通過以兩周間隔轉(zhuǎn)移到新鮮的選擇培養(yǎng)基來擴大回收的轉(zhuǎn)基因集落用于再生和進一步分析。9.8-再生和種子的產(chǎn)生為進行再生，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到如前述含有100nMR-吡氟氯禾靈或1.5μM氰氟草酯的28個“誘導(dǎo)”培養(yǎng)基和36個“再生”培養(yǎng)基中以分化小植株。建立小植株后，如前述將其轉(zhuǎn)移到SHGA管中以進一步生長并發(fā)育根和芽。如前述進行人工授粉以產(chǎn)生種子。9.9-事件回收和分析細節(jié)；含有AAD-1(v3)和AHAS(pDAS1421)的T0玉米譜系的完整植物篩選在多種水平的R-吡氟氯禾靈和R-氰氟草酯下體外選擇了兩72個農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化事件。如前述通過Southern印跡分析對22個愈傷組織樣品分析AAD-1(v3)進入基因組的穩(wěn)定整合。選擇表26指出的10個單拷貝事件進行再生。將每個事件的至少6個再生克隆譜系移到溫室的土壤中，并在出現(xiàn)2-4片新的正常葉時使用履帶式噴霧機應(yīng)用35gae/ha喹禾靈(參閱8.3.3章節(jié))進行篩選。不管用什么AOPP除草劑進行選擇，Western印跡中AAD-1蛋白的存在都與T0代的除草劑抗性高度相關(guān)。第二種HTC基因(AHAS)對AAD-1(v3)的功能沒有負影響。實施例10-用于抗體產(chǎn)生和生化表征的AAD-1(v1)純化純化中的所有操作都在4℃進行。將來自如實施例3進行培養(yǎng)和誘導(dǎo)的1L培養(yǎng)物的冰凍或新鮮大腸桿菌細胞重懸于含有20mMTris-HCl、1mMEDTA和2ml蛋白酶抑制劑混合物(Sigma)的200ml提取緩沖液中，使用Branson超聲波儀在冰上通過超聲波處理破碎細胞。通過在GSA轉(zhuǎn)子(Sorvall)中以12,000rpm(24,000g)離心20分鐘獲得可溶性提取物。接著將上清液裝入用20mMTris-HCl、1mMEDTA、pH8.0平衡的MonoQ離子交換柱(PharmaciaHR10/10)，并用10CV(80ml)的同一緩沖液洗柱。用80ml柱緩沖液中0到0.25M的NaCl線性梯度洗脫蛋白質(zhì)，收集了2ml級分?；旌虾蠥AD-1(v1)的級分并使用MWCO30kDa膜濃縮自旋柱(Millipore)進行濃縮。接著在Superdex200大小排阻柱(Pharmacia，XK16/60)上以1ml/分鐘的流速用含有20mMTris-HCl、0.15MNaCl和1mMDTT，pH8.0的緩沖液進一步分開樣品。通過SDS-PAGE分析純化方案，通過使用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品的Bradford測定來測定蛋白質(zhì)的濃度。實施例11-重組AAD1的純化和抗體產(chǎn)生在-80℃以Dow重組菌株DR1878在TOP10F′細胞(Invitrogen)中冰凍維持含有AAD-1(v1)基因的質(zhì)粒pDAB3202。為進行表達，按照生產(chǎn)商的說明將用Promega的Wizard試劑盒(Fisher目錄號PR-A1460)從TOP10F′細胞培養(yǎng)物純化的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化進BL-21Star(DE3)細胞(Invitrogen目錄號C6010-03)中。轉(zhuǎn)化后，將50μl細胞涂在LBS/S瓊脂平板上并在37℃孵育過夜。將整個瓊脂平板上的所有菌落刮到500mL三角瓶中的100mLLB中，并在37℃以200rpm振蕩孵育1小時。接著用1mMIPTG誘導(dǎo)基因表達，在30℃以200rpm振蕩孵育4小時。以4000rpm將全部100mL培養(yǎng)物離心20分鐘。棄去上清液，將沉淀重懸于含有20mMTris-HCl(pH8.0)、1mMEDTA和2ml蛋白酶抑制劑混合物(Sigma)的200mL提取液中，使用Branson超聲儀在冰上通過超聲波處理進行破碎。以24000×g離心裂解液20分鐘以去除細胞碎片。接著將含有AAD-1蛋白的上清液提交純化方案。除非另有說明，否則所有的AAD-1(v1)純化都如實施例10所討論的一樣在4℃進行。將細胞裂解液裝入用20mMTris-HCl(pH8.0)、1mMEDTA平衡的MonoQ離子交換柱(PharmaciaHR10/10)，接著用80ml的相同緩沖液洗滌。用80ml柱緩沖液中0到0.25M的NaCl線性梯度洗脫蛋白質(zhì)，收集了2ml級分?；旌虾蠥AD-1(v1)的級分并使用MWCO30kDa膜濃縮自旋柱(Millipore)進行濃縮。接著在Superdex200大小排阻柱(Pharmacia，XK16/60)上以1ml/分鐘的流速用含有20mMTris-HCl(pH8.0)、0.15MNaCl和1mMDTT的緩沖液進一步分開樣品。通過使用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品的Bradford測定來測定蛋白質(zhì)的濃度。將5毫克純化的AAD-1(v1)送到ZymedLaboratories，Inc.(SouthSanFrancisco，CA)用于產(chǎn)生兔多克隆抗體。兔在5周時間內(nèi)接受5次注射，每次注射含有懸于1mL弗氏不完全佐劑中的0.5mg純化蛋白質(zhì)。在親和純化和綴合辣根過氧化物酶(HRP)(ZymedLabInc)之前，在ELISA和Western印跡實驗中測試血清以證實特異性和親和力。11.1-從植物的葉提取AAD-1(v3)將50到100mg的葉組織切成小塊并放入含有兩個不銹鋼珠(4.5mm；DaisyCo.，目錄號145462-000)和300μL植物提取緩沖液(含有0.1％TritonX-100和10mMDTT的PBS)的微量離心管中。用研磨器以最大速度振蕩管4分鐘，接著以5000×g離心10分鐘。分析含有植物可溶性蛋白的上清液的可溶性蛋白總量(TSP)和AAD-1(v3)濃度。11.2-Bradford測定使用牛血清白蛋白(BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)品通過Bradford測定來測定來自植物葉組織的可溶性蛋白總量濃度。一式三份將5μl在PBS中連續(xù)稀釋的BSA或植物提取物轉(zhuǎn)移到96孔微孔板中。對于標(biāo)準(zhǔn)品，濃度范圍從2000到15.6μg/mL。首先將蛋白質(zhì)測定濃縮物5倍稀釋于PBS中，在每個孔中加入250μL并在室溫孵育5分鐘。使用微孔板讀數(shù)器在595nm處測量每個吸光度(OD)。使用Softmax_Pro(4.0版)(MolecularDevices)從標(biāo)準(zhǔn)曲線推斷每個樣品的蛋白質(zhì)濃度。11.3-酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)除非另外說明，否則在室溫下進行測定。將100毫升純化的抗AAD-1抗體(0.5μg/mL)包被96孔微孔板并在4℃孵育16小時。使用平板洗滌器用洗滌緩沖液(含有0.05％Tween20的100mM磷酸緩沖鹽水(PBS，pH7.4))洗滌平板四次，接著用溶解在PBS中的4％脫脂乳封閉1小時。洗滌后，在孔中孵育100μL已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)AAD-1或植物提取物(參閱前一章節(jié))。對于標(biāo)準(zhǔn)曲線，一式三份的AAD-1濃度范圍從100到1.6ng/mL。將植物提取物在PBS中稀釋5、10、20或40倍，一式二份進行分析。孵育1小時后，如上文洗滌平板。洗滌前在每個孔中孵育100μl抗AAD-1抗體-HRP綴合物(0.25μg/mL)1小時。在加入100μl0.4NH2SO4終止反應(yīng)之前，在每個孔中孵育100μlHRP底物1-StepTMUltraTMB-ELISA(Pierce)10分鐘。使用微孔板讀數(shù)器在450nm處測量每個孔的OD。為測定植物提取物中AAD-1的濃度，平均兩次重復(fù)的OD值，并使用Softmax_Pro4.0版(MolecularDevices)從標(biāo)準(zhǔn)曲線進行推斷。11.4-Western印跡分析將植物提取物或AAD-1標(biāo)準(zhǔn)品(5和0.5μg/mL)與Laemmli樣品緩沖液在95℃孵育10分鐘并在8-16％Tris-甘氨酸預(yù)制凝膠上電泳分離。接著使用標(biāo)準(zhǔn)方案將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用PBS中的4％脫脂乳封閉后，通過抗AAD1抗血清和其后的山羊抗兔/HRP綴合物檢測AAD-1蛋白。通過化學(xué)發(fā)光底物ECLWestern分析試劑(Amersham目錄號RPN21058)使檢測的蛋白質(zhì)顯像。實施例12-煙草轉(zhuǎn)化通過與已公開的方法(Horsch等，1988)類似但不完全相同的方法用根瘤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草。為提供用于轉(zhuǎn)化的來源組織，將煙草種子(Nicotianatabacumcv.Kentucky160)表面滅菌并種到TOB培養(yǎng)基的表面上，TOB培養(yǎng)基是用瓊脂固化的無激素Murashige和Skoog培養(yǎng)基(Murashige和Skoog，1962)。在有光照的培養(yǎng)室中在28-30℃培養(yǎng)植物6-8周，無菌收集葉用于轉(zhuǎn)化方案。從這些葉上無菌切下約1平方厘米不含中脈的塊。將以250rpm在28℃在瓶中培養(yǎng)過夜的農(nóng)桿菌菌株(含有pDAB721，AAD-1(v3)+PAT的EHA101S)培養(yǎng)物離心沉淀并重懸于無菌Murashige&Skoog鹽中，調(diào)整至600nm處的終吸光度為0.5。將葉塊在此細菌懸液中浸泡約30秒，接著在無菌紙巾上蘸干，右側(cè)朝上放在TOB+培養(yǎng)基(含有1mg/L吲哚乙酸和2.5mg/L芐腺嘌呤的Murashige和Skoog培養(yǎng)基)上并在28℃在黑暗中孵育。兩天后將葉塊移至含有250mg/L頭孢噻肟(Agri-Bio，NorthMiami，F(xiàn)lorida)和5mg/L草銨膦(Basta的活性成分，BayerCropSciences)的TOB+培養(yǎng)基并在28-30℃孵育。前兩周每周兩次將葉塊轉(zhuǎn)移到含有頭孢噻肟和Basta的新鮮TOB+培養(yǎng)基，其后每周一次。用細菌處理葉塊四到六周后，從此組織制劑中除去從轉(zhuǎn)化病灶發(fā)出的小植物并種到PhytatrayTMII管(Sigma)中含有250mg/L頭孢噻肟和10mg/LBasta的培養(yǎng)基TOB中。在光照孵育室中培養(yǎng)這些小植株。3周后，進行枝插并在相同的培養(yǎng)基中重新生根。再過2-3周后，植物即可移出至溫室。通過以下步驟將植物移至溫室中從根上洗掉瓊脂，移植到13.75cm見方盆的土壤中，將盆放在Ziploc_袋子(SCJohnson&Son，Inc.)中，在袋子的底部放入自來水并在30℃溫室中直接光照下放置一周。3-7天后，打開袋子，給植物施肥并使其在打開的袋子中生長直至適應(yīng)溫室，此時去掉袋子。在普通溫室條件(30℃，16小時白天、8小時黑夜、最小自然光+補充光＝500μE/m2s1)下培養(yǎng)植物。繁殖前，對T0植物取樣用于DNA分析以測定其插入片段拷貝數(shù)。為方便起見，測定與AAD-1(v3)分子連接的PAT基因。將新鮮組織置于管中并在4℃低壓凍干兩天。組織完全干燥后，將鎢珠(Valenite)放入管中并使用Kelco玻珠研磨機干磨樣品1分鐘。接著遵循標(biāo)準(zhǔn)DNsesyDNA分離方法(Qiagen，DNeasy69109)。接著用PicoGreen(MolecularProbesP7589)染色提取的DNA的等分試樣并與已知標(biāo)準(zhǔn)品一起在florometer(BioTek)中讀數(shù)，以得到以ng/μl計的濃度。將DNA樣品稀釋到9ng/μl，接著通過在熱循環(huán)儀中以95℃孵育10分鐘變性。接著使用制備的寡核苷酸混合物和MgCl2(ThirdWaveTechnologies)制備信號探針。在侵入物測定平板的每個孔中加入7.5μl的等分試樣，接著加入7.5μl對照、標(biāo)準(zhǔn)品和20ng/μl稀釋的未知樣品。用15μl礦物油(Sigma)覆蓋每個孔。接著將平板在63℃孵育1.5小時并在florometer(Biotek)上讀數(shù)。計算靶探針信號對背景的百分比除以內(nèi)參探針背景信號百分比的結(jié)果得出比率。使用已知拷貝數(shù)并用southern印跡分析確認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)品的比率鑒定未知事件的估計拷貝數(shù)(表27)。若干事件的Southern分析證實了對拷貝數(shù)的估計。用得自QiagenDNeasy試劑盒的總DNA進行Southern印跡分析。對總計2μgDNA進行NsiI和HindIII過夜消化以獲得pDAB721的整合數(shù)據(jù)。過夜消化后，在1％凝膠上電泳約100ng的等分試樣以確認(rèn)完全消化。確認(rèn)后使用實施例6第11章節(jié)中的方案處理樣品。還使用相同的提取DNA樣品通過PCR測定所有事件中AAD-1(v3)基因的存在。使用總計100ng總DNA作為模板。使用20mM的每種引物和TakaraExTaq聚合酶試劑盒(MinisTAKRR001A)。用于編碼區(qū)PCRAAD-1的引物為(RdpAcodFATGGCTCATGCTGCCCTCAGCC)(SEQIDNO27)和(RdpAcodRCGGGCAGGCCTAACTCCACCAA)(SEQIDNO28)。在9700Geneamp熱循環(huán)儀(AppliedBiosystems)中進行PCR反應(yīng)，將樣品置于94℃3分鐘，接著是94℃30秒、64℃30秒和72℃1分45秒的35個循環(huán)，接著是72℃10分鐘。在溴化乙啶染色的1％瓊脂糖凝膠上通過電泳分析PCR產(chǎn)物。再生了來自30個PCR陽性事件中每一個事件4到12個克隆譜系并移至溫室。通過前述的ELISA方法測定19個事件中每一事件的代表性植物中AAD-1(v3)的表達。測試的所有事件都顯示可檢測水平的(AAD-1(v3)表27)。蛋白質(zhì)表達在各事件間存在差異。通過對3-4英寸高的植物噴灑廣泛范圍的2，4-滴來攻擊來自30個事件中每一事件的T0植物。如前述以187L/ha的噴灑體積使用履帶式噴霧機進行噴灑應(yīng)用。以0、50、200、800或3200gae/ha(在去離子水中混合)的對每一事件的代表性克隆應(yīng)用2，4-滴二甲胺鹽(RiversideCorp)。每個處理重復(fù)1-3次。在3和14DAT記錄損傷率。測試的每個事件都比未轉(zhuǎn)染對照株系KYI60對2，4-滴更有耐性。在幾個事件中，在800gae/ha或更低的劑量下開始出現(xiàn)了與生長素除草劑相關(guān)的偏上性。一些事件在此用量(等價于1.5×大田用量)下未受損傷。用3200gae/ha處理時，所有的事件在3DAT出現(xiàn)暫時性生長素損傷。由于噴灑溶液的酸性，此高劑量下還出現(xiàn)了一些葉燒傷。推遲了高2，4-滴劑量下的其他試驗。用3200gae/ha2，4-滴(約6×大田用量)處理的T0植物的應(yīng)答將每個事件的相對耐性分為“低”(14DAT損傷＞50％)、“中”(20％-50％損傷)“高”(＜20％損傷)。一些事件的重復(fù)之間應(yīng)答不一致，視為“變化的”(表27)。高2，4-滴耐性的驗證在每個事件中保留在高用量2，4-滴下存活的2到4個T0植物并使其在溫室中自體受精產(chǎn)生T1種子。從T0代中選擇兩個AAD-1(v3)煙草株系(事件721(2)-013.010和721(3)-008.005)。使T1種子成層并以與擬南芥(實施例6.4)十分相似的方式種到選擇盤中，接著用280gai/ha草甘膦(PAT選擇)在此分離群體中選擇性去除未轉(zhuǎn)化空白。將存活株轉(zhuǎn)移到溫室中的單個3英寸盆中。這些株系在T0代中提供中等水平和高水平的2，4-滴強度。預(yù)期在這些不直接來自組織培養(yǎng)的T1植物中具有提高的應(yīng)答一致性。將這些植物與野生型KY160煙草進行比較。使用設(shè)置為187L/ha的履帶式噴霧機對所有植物噴灑。用70-4480gae/ha范圍的2，4-滴二甲胺鹽(DMA)、R-2，4-滴丙酸和兩種除草劑50/50的混合噴灑植物。所有的應(yīng)用都配制在200mMHepes緩沖液(pH7.5)中。每個處理重復(fù)四次。在處理后3和14天評估植物。就發(fā)育障礙、缺綠癥和壞死對植物評定損傷率。T1代是分離的，因此由于接合性的差異可以預(yù)計到一些不同的應(yīng)答(表28)。每個事件在低于1×大田劑量(560gae/ha)的2，4-滴或R-2，4-滴丙酸用量下均未觀察到損傷。甚至在高達8倍大田用量(4480gae/ha)仍幾乎未觀察到損傷，其表現(xiàn)為發(fā)育障礙而不是生長素除草劑損傷。這些結(jié)果表明AAD-1(v3)甚至在高度生長素敏感性的單子葉作物如煙草中也可以提供商品水平的耐性。這些結(jié)果還顯示，可以輸入對單獨或罐混組合中的手性(2，4-二氯苯氧丙酸)和非手性(2，4-二氯苯氧乙酸)苯氧基生長素除草劑的抗性。還對兩個AAD-1(v3)株系(事件721(2)-013.010和721(3)-008.005)中的每一個株系進行了100個植物的子代測定。按以上方法使種子成層、播種并移植，只是不通過Liberty選擇去除空白植物。14DAT后，技術(shù)抗性和敏感植物。經(jīng)卡方分析測定，事件“013”和“008”均以單基因座顯性孟德爾性狀分離(3R:1S)。AAD-1可在多個物種中作為強苯氧基生長素抗性基因遺傳。通過以下證明大田水平的耐性在溫室中種植T1或T2種子，如前述通過Liberty選擇來選擇性去除空白植物，按照上文指出的培養(yǎng)條件在72孔移植平臺(HummertInternational)中在Metro360培養(yǎng)基中培養(yǎng)單個苗。使用工業(yè)蔬菜種植機將單個植物移植到大田。用滴液或頭頂灌溉保持植物旺盛生長。當(dāng)植物高度達到6-12英寸時，如上文所示用廣泛劑量的苯氧基生長素噴灑煙草植物。在大田條件下環(huán)境脅迫更加顯著，然而，基于先前AAD-1轉(zhuǎn)化玉米的經(jīng)驗可以預(yù)計從溫室到大田轉(zhuǎn)移的強抗性。實施例13-大豆轉(zhuǎn)化已通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)完成了對大豆以下性狀的改良如除草劑耐性(Falco等，1995)、氨基酸修飾(Padgette等，1995)和昆蟲抗性(Parrott等，1994)。將外源性狀引入作物物種需要允許使用含有簡單插入片段的選擇標(biāo)記物序列常規(guī)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因株系的方法。轉(zhuǎn)基因應(yīng)以單功能性基因座遺傳以簡化育種。已經(jīng)報道了通過合子胚軸(McCabe等，1988)或體細胞胚發(fā)生培養(yǎng)物(Finer和McMullen，1991)的微粒轟擊和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的有子葉外植體(Hinchee等，1988)或合子胚(Chee等，1989)的轉(zhuǎn)化將外源基因遞送到種植大豆。來自農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體往往具有低拷貝數(shù)的簡單插入片段(Birch，1991)。研究用于將基因轉(zhuǎn)移進大豆的三種靶組織(合子胚軸(Chee等，1989；McCabe等，1988)、子葉(Hinchee等，1988)和體細胞胚發(fā)生培養(yǎng)物(Finer和McMullen，1991))都有各自的優(yōu)缺點。后者已經(jīng)被廣泛研究作為直接基因轉(zhuǎn)移的靶組織。胚發(fā)生培養(yǎng)物往往相當(dāng)高效，并可維持超過延長期。然而，原代轉(zhuǎn)化體的不育和染色體畸變與胚發(fā)生懸液的時期相關(guān)(Singh等，1998)，因此持續(xù)起始新的培養(yǎng)物對使用這種組織的大豆轉(zhuǎn)化系統(tǒng)似乎是必要的。這種系統(tǒng)需要高水平的2，4-滴(40mg/L濃度)來起始胚胎發(fā)生愈傷組織，由于培養(yǎng)基中含有2，4-滴時轉(zhuǎn)化的基因座不能進一步發(fā)育，因此這使AAD-1(v3)基因的使用產(chǎn)生了基本的問題。因此，基于分生組織的轉(zhuǎn)化可理想地用于開發(fā)使用AAD-1(v3)的2，4-滴抗性植物。13.1-轉(zhuǎn)化方法1根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆子葉節(jié)轉(zhuǎn)化最先報道的大豆轉(zhuǎn)化靶向子葉節(jié)區(qū)中的分生細胞(Hinchee等，1988)和來自頂端分生組織的嫩枝增殖物(McCabe等，1988)。在基于根瘤農(nóng)桿菌的子葉節(jié)方法中，外植體制品和培養(yǎng)基組合物刺激節(jié)中輔助分生組織的增殖(Hinchee等，1988)。仍不清楚這些處理是否起始了真正去分化而全能的愈傷組織培養(yǎng)物。從單個外植體再生多個轉(zhuǎn)化事件克隆和少見的嵌合體植物再生(Clemente等，2000；Olhoft等，2003)表明單細胞來源和其后的轉(zhuǎn)基因細胞增殖產(chǎn)生多育的轉(zhuǎn)基因分生組織培養(yǎng)物或單一轉(zhuǎn)化的嫩枝(再經(jīng)歷嫩枝增殖)。由于系統(tǒng)是基于種系嵌合體的成功鑒定，大豆嫩枝增殖方法(最初基于微粒轟擊(McCabe等，1988)，最近改造用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(Martinell等，2002))顯然不經(jīng)歷與子葉節(jié)方法相同的去分化水平或類型。通過基于農(nóng)桿菌的子葉節(jié)方法轉(zhuǎn)化的基因型范圍正逐漸擴大(Olhoft和Somers，2001)。這種從新分生組織和嫩枝增殖方法較少受到具體基因型的限制。這還是不基于2，4-滴的方案，可理想地用于2，4-滴選擇系統(tǒng)。因此，子葉節(jié)方法可能是開發(fā)2，4-滴抗性大豆品種應(yīng)選擇的方法。盡管此方法早在1988年(Hinchee等，1988)即有所描述，但直到最近才將其優(yōu)化用于若干大豆基因型的常規(guī)高頻轉(zhuǎn)化(Zhang等，1999；Zeng等，2004)。13.1.1-農(nóng)桿菌制備質(zhì)粒pDAB721含有擬南芥Ubi10啟動子控制下的AAD-1(v3)基因。這種質(zhì)粒還帶有稻肌動蛋白啟動子控制下的PAT基因，其編碼降解可用作轉(zhuǎn)化體選擇劑的草甘膦的酶。此載體可用于下文所述的轉(zhuǎn)化實驗。通過電穿孔將構(gòu)建體pDAB721轉(zhuǎn)移進農(nóng)桿菌菌株EHA101S。可以在YEP培養(yǎng)基(10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物和5g/LNaCl，pH7.0)中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化中使用的含有pDAB721的農(nóng)桿菌培養(yǎng)物。低速沉淀農(nóng)桿菌培養(yǎng)物并重懸于SCM液體培養(yǎng)基(見下文)中至OD660為0.6以用于接種。13.1.2-植物轉(zhuǎn)化可通過在補充2滴Liqui-Nox_的20％(體積/體積)商品漂白劑(NaCIO)中洗滌20分鐘來消毒“Thome”、“Williams82”或“NE3001”公共基因型大豆的種子。種子應(yīng)在無激素SHGA培養(yǎng)基上用無菌水洗滌5次，接著以18/6小時的光/暗安排在24℃萌發(fā)5天。B5培養(yǎng)基由常量營養(yǎng)素和微量營養(yǎng)素和維生素組成，描述于Gamborg等(1968)(Sigma，目錄號G5893，St.Louis)。用0.8％(重量/體積)洗過的瓊脂(Sigma目錄號A8678)固化所有的培養(yǎng)基?；蛘?，某些基因型的大豆可承受使用氯氣(Cl2)的干燥表面滅菌方法，其中將成熟種子以單層放入100×25mm培養(yǎng)皿中，每皿使用約130個種子。以使所有平板半開且在干燥器中間有足夠空間放下250ml燒杯的方式將約3-4個平板放入通風(fēng)櫥內(nèi)的干燥器中。用95ml商品漂白劑充滿燒杯，沿?zé)谥鸬卧谄渲屑尤?ml濃縮(12N)HCl。立即關(guān)上干燥器，在通風(fēng)櫥中靜置至少16小時。滅菌之后，蓋上平板，接著移到層流櫥中并開蓋約30分鐘以去除過剩的Cl2氣體。接著如前述萌發(fā)種子。在室溫下使干燥表面滅菌的種子保持無菌約2周。如前述制備外植體用于接種(Hinchee等，1988)。外植體應(yīng)孵育30分鐘。共培養(yǎng)培養(yǎng)基和農(nóng)桿菌重懸培養(yǎng)基由補充了1mg/LBAP、1mg/LGA3、3％(重量/體積)蔗糖、20mMMES(2-[N-嗎啉代]乙基磺酸)、400mg/LL-半胱氨酸(OlhoftandSomers，2001)pH5.7、0.99mM二硫蘇糖醇(DTT)和200μM乙酰丁香酮(AS)的B5培養(yǎng)基組成。將外植體在25℃共培養(yǎng)5天。共培養(yǎng)之后在含有100mg/L特美汀和200mg/L頭孢噻肟、無MES和AS的共培養(yǎng)培養(yǎng)基中洗滌外植體。在除草劑選擇之前先將外植體置于嫩枝誘導(dǎo)培養(yǎng)基上并每14天轉(zhuǎn)移一次，共28天。嫩枝誘導(dǎo)培養(yǎng)基由補充了1.7mg/LBAP、100mg/L特美汀、200mg/L頭孢噻肟pH5.7和3％(重量/體積)蔗糖的全濃度B5培養(yǎng)基組成。將子葉以近軸側(cè)向上放置，子葉節(jié)區(qū)浸入培養(yǎng)基中，在8周中每2周在所述培養(yǎng)基中補充水平升高的Basta(2、5、6和7mg/L的草銨膦)或非致死水平的2，4-滴(范圍從10mg到400mg/L)。其后將分化的外植體轉(zhuǎn)移到嫩枝伸長培養(yǎng)基，在同樣的草銨膦選擇或降低的2，4-滴選擇壓(范圍從10mg到100mg/L)下再培養(yǎng)4到10周。伸長培養(yǎng)基由用1mg/L玉米蛋白肌苷、0.1mg/LIAA(吲哚-3-乙酸)、0.5mg/LGA3、50mg/L谷氨酰胺、50mg/L天冬酰胺和3％(重量/體積)蔗糖修正，pH5.8的B5培養(yǎng)基(Sigma目錄號M0404)組成。應(yīng)該在含有全濃度維生素加0.5mg/LNAA(α-萘乙酸)或0.1mg/LIAA和2％(重量/體積)蔗糖的半濃度MS/B5培養(yǎng)基上不進行其他選擇而使伸長的嫩枝生根。在整個選擇過程中在培養(yǎng)基中維持抗生素、特美汀和頭孢噻肟。每兩周將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)基。在轉(zhuǎn)移到溫室之前使外植體適應(yīng)1到2周。13.1.3-子代評估使T0植物在溫室中自體受精以產(chǎn)生T1種子。用一系列的除草劑劑量噴灑T1植物(至產(chǎn)生足夠的T0克隆的程度)以測定轉(zhuǎn)基因大豆中AAD-1(v3)和PAT基因提供的除草劑抗性水平。對T0植物的2，4-滴用量一般使用100-400gae/ha范圍內(nèi)的一個或兩個選擇用量。用更廣泛的除草劑用量(范圍從50-3200gae/ha2，4-滴)處理T1植物。類似的，可以通過分別用的草銨膦進行出苗后處理來篩選T0和T1植物的草銨膦抗性。如實施例9中對擬南芥和玉米的描述進行蛋白質(zhì)表達分析。使用就除草劑耐性的T1和T2子代分離確定AAD-1(v3)的遺傳。13.2-轉(zhuǎn)化方法2不可再生的大豆懸浮細胞的“非搖動”農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化以3天的循環(huán)培養(yǎng)DAS大豆細胞懸液，將10ml沉降的懸浮體積轉(zhuǎn)移到115ml新鮮液體培養(yǎng)基中。如下確定沉降細胞體積劇烈搖動后使細胞懸液在125mL瓶沉降2分鐘，接著用大口10ml移液管將細胞從瓶底吸出。接著將瓶轉(zhuǎn)移到140rpm的定軌搖床上。將0.72OD600的細胞懸液的4ml等分試樣與200μM乙酰丁香酮(AS)一起轉(zhuǎn)移到100×25無菌培養(yǎng)皿上。將加入100μL密度為1.2OD650的EHA105農(nóng)桿菌懸液并充分混合。充分搖動農(nóng)桿菌和懸浮細胞混合物并將平板轉(zhuǎn)移到黑暗的生長室中，其中溫度保持為25℃。13.2.1-選擇大豆懸浮細胞和分離轉(zhuǎn)化集落共培養(yǎng)4天后，再次搖動平板以使懸液充分混合，將1.5ml等分試樣轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基并涂在100×15ml培養(yǎng)皿上的凝膠培養(yǎng)基上。選擇培養(yǎng)基由補充了1.7mg/LBAP、100mg/L特美汀、200mg/L頭孢噻肟pH5.7和3％(重量/體積)的全濃度B5培養(yǎng)基組成，并用5mg/L水平的草銨膦修正了培養(yǎng)基。在通風(fēng)櫥中干燥10分鐘后，于28℃在暗中孵育平板4周。選擇中出現(xiàn)了集落并將來自三個不同實驗的總計11個集落轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基并維持3-4個月。全部11個抗性集落產(chǎn)生了在含有5mg/L草銨膦的選擇培養(yǎng)基上生長的愈傷組織。涂到5mg/L草銨膦培養(yǎng)基上之后，非轉(zhuǎn)化懸浮細胞為敏感性。然而，轉(zhuǎn)化集落對5×濃度的草銨膦有抗性，并保持長達4個月。當(dāng)直徑達到2到3cm時，選取愈傷組織事件的樣品用于分析。至少分析兩個集落分離物(各來自兩個不同實驗)的AAD1蛋白表達。對這兩個分離物進行的ELISA和Western分析顯示AAD1蛋白的陽性表達。對兩個單獨的轉(zhuǎn)化AAD-1(v3)基因的大豆愈傷組織進行的ELISA(表29)和Western印跡(圖18)分析表明愈傷組織表達AAD-1(v3)蛋白。夾層ELISA在兩個不同的愈傷組織樣品中檢測到可溶性蛋白總量的0.0318％和0.0102％的AAD-1(v3)。由于抗血清的敏感性和交叉反應(yīng)性，在Western印跡中觀察到了多個條帶。然而，在兩個愈傷組織樣品中都觀察到了AAD-1(v3)特異性條帶，而野生型(陰性)組織中則沒有。編碼區(qū)PCR分析顯示了這些集落中AAD1和PAT編碼區(qū)預(yù)期大小的產(chǎn)物，說明它們是轉(zhuǎn)化而來。13.3-轉(zhuǎn)化方法3氣溶膠束介導(dǎo)的胚胎發(fā)生大豆愈傷組織的轉(zhuǎn)化如U.S.專利No.6,809,232(Held等)所述進行胚胎發(fā)生大豆愈傷組織的培養(yǎng)和其后的beaming。轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基三天后，分別將若干Stine良種(包括96E750、96E94、，97E986、96E144和96E692)的胚胎發(fā)生愈傷組織收集在B1-303Co5My或B1-303Co5My0.25PA0.5K平板中央。以約0.2μg/ml的濃度使用線性化DNA用pDAB3295beaming組織。Beaming之后，將胚胎發(fā)生愈傷組織轉(zhuǎn)移到新鮮的B1-303Co5My或B1-303Co5My0.25PA0.5K，1個月傳代一次。然后將組織轉(zhuǎn)移到含有1mg/l雙丙氨膦的選擇培養(yǎng)基。就雙丙氨膦而言，一般在前兩次一個月的傳代中將選擇維持在1mg/l，接著在其后的3到7個月升高到2mg/l。當(dāng)轉(zhuǎn)化實驗產(chǎn)生的愈傷組織在含有2，4-滴加雙丙氨膦的選擇培養(yǎng)基上開始組織并發(fā)育成胚胎發(fā)生結(jié)構(gòu)時鑒定轉(zhuǎn)基因事件。鑒定后，按以下方案將成熟中的結(jié)構(gòu)再生成植物將胚胎發(fā)生結(jié)構(gòu)從B1-303Co5My或B1-303/co5My0.25PA0.5K轉(zhuǎn)移到B3培養(yǎng)基。在B3培養(yǎng)基上生長3到4周后，將單個結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基。再過3到4周后，將成熟的胚轉(zhuǎn)移到B5G培養(yǎng)基并置于光下。將具有伸長和拉長的根的胚轉(zhuǎn)移到含有1/2B5G培養(yǎng)基的管中(在此繼續(xù)發(fā)育成小植株)并從管中移出置于盆中。測試了表30中提到的培養(yǎng)基變更，如通過在B1-30中加入3％椰汁和5gm/l肌醇產(chǎn)生的B1-303Co5My。其他變更包括含有以下成分的B1-303Co5My0.25PA0.5KB1-30基礎(chǔ)培養(yǎng)基加3％椰汁、5gm/l肌醇、0.25gm/l植酸和0.5gm/l額外KH2PO4的和含有一半濃度的B5G培養(yǎng)基所有成分的1/2B5G。實施例14-在棉花中啟動AAD-1(v3)14.1-棉花轉(zhuǎn)化方案使棉花種子(Co310基因型)在95％乙醇中表面滅菌1分鐘、洗滌、用50％商品漂白劑滅菌20分鐘并用無菌蒸餾水漂洗三次，其后使其在MagentaGA-7管中的G培養(yǎng)基(表31)上萌發(fā)并在40-60μE/m2的高光強下維持，光周期設(shè)置為28℃下16小時光照和8小時黑暗。從7-10天齡的苗分離子葉節(jié)段(約5mm)到培養(yǎng)皿中的液體M液體培養(yǎng)基(表31)。用農(nóng)桿菌溶液處理剪下的片段(約30分鐘)，其后轉(zhuǎn)移到半固體M培養(yǎng)基(表31)共培養(yǎng)2-3天。共培養(yǎng)之后將片段轉(zhuǎn)移至MG培養(yǎng)基(表31)。用羧芐青霉素作為殺死農(nóng)桿菌的抗生素，用草銨膦作為僅允許含有轉(zhuǎn)移基因的細胞生長的選擇劑。農(nóng)桿菌的制備接種35mlY培養(yǎng)基(表31)(含有鏈霉素(100mg/ml貯存液)和紅霉素(100mg/ml貯存液))和1菌環(huán)細菌在28℃在黑暗中生長過夜。第二天將農(nóng)桿菌溶液倒入無菌oakridge管(Nalge-Nunc，3139-0050)中并在BeckmanJ2-21中以8000rpm離心5分鐘。倒掉上清液并將沉淀重懸于25mlM液體(表31)中并渦旋。將等分試樣放入玻璃培養(yǎng)管(Fisher，14-961-27)用于Klett讀數(shù)(Klett-Summerson，model800-3)。以總體積40ml用M液體培養(yǎng)基將新懸液稀釋到Klett計讀數(shù)為每mL108個菌落形成單位。三周后，分離來自子葉的愈傷組織并轉(zhuǎn)移至新鮮MG培養(yǎng)基。愈傷組織轉(zhuǎn)移到MG培養(yǎng)基上再過3周。接著將愈傷組織轉(zhuǎn)移至CG培養(yǎng)基(表31)，并在三周后再轉(zhuǎn)移至新鮮的選擇培養(yǎng)基。再經(jīng)過三周后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移至缺少植物生長調(diào)節(jié)劑的D培養(yǎng)基(表31)用于胚胎發(fā)生愈傷組織誘導(dǎo)。在此培養(yǎng)基上經(jīng)過4-8周后形成了胚胎發(fā)生愈傷組織，可通過其淡黃白色的顏色和顆粒細胞區(qū)別于非胚胎發(fā)生愈傷組織。胚在其后很快開始再生，顏色為不同的綠色。分離較大的發(fā)育良好的胚轉(zhuǎn)移到DK培養(yǎng)基(表31)用于胚發(fā)育。3周后(或當(dāng)胚已發(fā)育時)將萌發(fā)的胚轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基用于嫩枝和根發(fā)育。4-8周后，將任何發(fā)育良好的植物轉(zhuǎn)移到土壤中培養(yǎng)至成熟。在接下來的兩三個月中，植物已經(jīng)生長至可以噴灑以確定其是否具有2，4-滴抗性的點。14.2-實驗細節(jié)此實驗用pDAB721處理500個子葉節(jié)段。處理的500個節(jié)段中的475個在選擇中分離了愈傷組織(95％轉(zhuǎn)化頻率)。構(gòu)建體中包含PAT基因，由于已經(jīng)開發(fā)了選擇方案，因此在草銨膦上選擇愈傷組織。起始了PCR和侵入物形式的愈傷組織株系分析以測定插入模式和確定在愈傷組織期中存在該基因，接著將胚胎發(fā)生的愈傷組織株系用于Western分析。14.3-愈傷組織分析結(jié)果該分析的目的是消除任何不含有完整PTU、無表達或具有高拷貝數(shù)的任何株系，從而不再生這些株系。在475個pDAB721轉(zhuǎn)化愈傷組織株系中，將306個用于PCR分析和侵入物測定(表32)。很少的株系為PCR陰性。此時侵入物結(jié)果尚未完成，因為提取后一些樣品的DNA量很低而進行了重新提交。然而，目前的侵入物數(shù)據(jù)顯示提交的株系中少量具有高拷貝數(shù)(＞2的拷貝數(shù))(表32)。由于通過分析的株系數(shù)量龐大，由于容量的緣故有必要降低維持的胚胎發(fā)生愈傷組織株系。將90個株系送交Western分析，其中8個為陰性。Western分析在多數(shù)株系中顯示了高表達(表32)?；诜治鼋Y(jié)果(和未決的結(jié)果)維持了82個胚胎發(fā)生愈傷組織株系用于植物再生。表32.棉花愈傷組織分析標(biāo)準(zhǔn)AAD15μg/ml*****標(biāo)準(zhǔn)AAD10.5μg/ml**14.4-植物再生將按上述方案產(chǎn)生植物的兩個AAD-1(v3)棉花株系送至溫室。為證明AAD-1(v3)基因在棉花中提供對2，4-滴的抗性，用設(shè)置為187L/ha的履帶式噴霧機噴灑兩種AAD-1(v3)棉花植物和野生型棉花植物。以配制在200mMHepes緩沖液(pH7.5)中的560gae/ha2，4-DMA噴灑植物。在處理后3、7和14天評估植物。就發(fā)育障礙、缺綠癥和壞死對植物評定損傷率。評定為90％或以上損傷率的植物認(rèn)為是死亡。處理后3天(DAT)，野生型開始顯示epinasy，損傷率為15％；相反，AAD-1(v3)植物顯示0％損傷。到7DATepinasy在野生型上繼續(xù)存在，并且新長出的嫩枝開始變成褐色。此時其損傷率為50％。在14DAT，AAD-1(v3)植物仍無損傷，而野生型形成嚴(yán)重的發(fā)育障礙，新長出的部分為褐色并枯萎。因此，野生型在14DAT損傷率為90％。此研究證明棉花中的AAD-1(v3)基因提供對高達至少560gae/ha的2，4-滴顯著的耐性。實施例15-其他作物的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化按照本文公開的內(nèi)容，可以根據(jù)本發(fā)明使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)轉(zhuǎn)化其他作物。對于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黑麥轉(zhuǎn)化，參閱如Popelka和Altpeter(2003)。對于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆轉(zhuǎn)化，參閱如Hinchee等，1988。對于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高粱轉(zhuǎn)化，參閱如Zhao等，2000。對于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大麥轉(zhuǎn)化，參閱如Tingay等，1997。對于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥轉(zhuǎn)化，參閱如Cheng等，1997。對于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的稻轉(zhuǎn)化，參閱如Hiei等，1997。下文給出了這些和其他植物的拉丁名。應(yīng)該明確，這些和其他(非農(nóng)桿菌)轉(zhuǎn)化技術(shù)可用于將例如AAD-1(v3)轉(zhuǎn)化進這些植物和其他植物，包括但不僅限于玉米(GramineaeZeamays)、小麥(PooideaeTriticum屬)、Rice(GramineaeOryza屬和Zizania屬)、大麥(PooideaeHordeum屬)、棉花(AbromaDicotyledoneaeAbromaaugusta和MalvaceaeGossypium屬)、大豆(SoyaLeguminosaeGlycinemax)、甜菜(ChenopodiaceaeBetavulgarisaltissima)、甘蔗(Arengapinnata)、西紅柿(SolanaceaeLycopersiconesculentum和其他屬、Physalisixocarpa、Solariumincanum和其他屬，以及Cyphomandrabetacea)、馬鈴薯、甘薯、黑麥(PooideaeSecale屬)、胡椒(SolanaceaeCapsicumannuum、sinense和frutescens)、萵苣(CompositaeLactucasativa，perennis，andpulchella)、卷心菜、芹菜(UmbelliferaeApiumgraveolens)、茄子(SolanaceaeSolariummelongena)、高粱(所有Sorghum物種)、苜蓿(LeguminosaeMedicagosativum)、胡蘿卜(UmbelliferaeDaucuscarotasativa)、豆類(LeguminosaePhaseolus屬和其他屬)、燕麥(AvenaSativa和Strigosa)、豌豆(LeguminosaePisum、Vigna和Tetragonolobus屬)向日葵(CompositaeHelianthusannuus)、南瓜(DicotyledoneaeCucurbita屬)黃瓜(Dicotyledoneaegenera)、煙草(SolanaceaeNicotiana屬)、擬南芥(CruciferaeArabidopsisthaliana)、Turfgrass(Loliwn、Agrostis和其他科)和三葉草(Leguminosae)。帶有如AAD-1(v3)的這些植物包括于本發(fā)明中。實施例16-將AAD-1(v3)與AHAS除草劑抗性基因疊加實施例7.9中描述了將AAD-1(v3)與AHAS除草劑抗性基因疊加。實施例17-令人驚奇的結(jié)果的其他證據(jù)AAD-1對AAD-217.1-AAD-2(v1)起始克隆從NCBI數(shù)據(jù)庫(參閱ncbi.nlm.nih.gov網(wǎng)址，登錄號AP005940)鑒定了與tfdA只有44％氨基酸同一性的另一個基因。為保持一致性，此基因在本文中稱為AAD-2(v1)。通過以下測定同一性百分比首先將AAD-2和tfdADNA序列(分別為SEQIDNO12和GENBANK登錄號M16730)翻譯成蛋白質(zhì)(分別為SEQIDNO13和GENBANK登錄號M16730)，接著使用VectorNTI軟件包中的ClustalW進行多重序列比對。含有AAD-2(v1)基因的大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)菌株得自NorthernRegionalResearchLaboratory(NRRL，菌株號B4450)。按照NRRL方案復(fù)蘇低壓凍干的菌株并以Dow細菌菌株DB663在20％甘油中保存于-80℃用于內(nèi)部用途。將來自此冰凍原種的一菌環(huán)細菌涂在Triptic大豆瓊脂上用于分離，并在28℃孵育3天。用單菌落接種到500ml三角瓶中的100mlTryptic大豆培養(yǎng)液中，在150rpm的平板搖床上以28℃孵育過夜。使用Qiagen的DNeasy試劑盒(Qiagen目錄號69504)的革蘭氏陰性方案從其中分離總DNA。設(shè)計以下引物以從基因組DNA中擴增靶基因，正向5′ACTAGTAACAAAGAAGGAGATATACCATGACGAT3′[brjap5′(speI)SEQIDNO14(加入了SpeI限制性位點和核糖體結(jié)合位點(RBS))]和反向5′TTCTCGAGCTATCACTCCGCCGCCTGCTGCTGC3′[brjap3′(xhol)SEQIDNO15(加入了XhoI位點)]。按如下建立50μl的反應(yīng)FailSafeBuffer25μl、ea.引物1μl(50ng/μl)、gDNA1μl(200ng/μl)、H2O21μl、Taq聚合酶1μl(2.5單位/μl)。在三個分開的反應(yīng)中使用三種ThreeFailSafeBuffer-A、B和C。使用FailSafePCR系統(tǒng)(Epicenter目錄號FS99100)在以下條件下進行PCR反應(yīng)95℃3.0分鐘的熱變性循環(huán)；95℃1.0分鐘、50℃1.0分鐘、72℃1.5分鐘的30個循環(huán)；接著是72℃5分鐘的終循環(huán)。使用化學(xué)感受態(tài)的TOP10F’大腸桿菌作為宿主菌株，按照所包含的方案將得到的約1kb的PCR產(chǎn)物克隆進pCR2.1(Invitrogen目錄號K4550-40)以驗證核苷酸序列。挑出10個得到的白色克隆至3μlLuria培養(yǎng)液+1000μg/ml氨芐青霉素(LBAmp)并在37℃搖動培養(yǎng)過夜。按照所包含的方案使用NucleospinPlus質(zhì)粒小量制備試劑盒(BDBiosciences目錄號K3063-2)從每個培養(yǎng)物中純化質(zhì)粒。用限制性內(nèi)切酶EcoRI(NewEnglandBiolabs目錄號R0101S)消化質(zhì)粒DNA。按照生產(chǎn)商的說明使用M13正向[5′GTAAAACGACGGCCAGT3′](SEQIDNO16)和反向[5′CAGGAAACAGCTATGAC3′](SEQIDNO17)引物用BeckmanCEQQuickStart試劑盒(BeckmanCoulter目錄號608120)進行測序。為了內(nèi)部一致性，給予此基因序列及其相應(yīng)蛋白質(zhì)新的通用名AAD-2(v1)。17.2-AAD-2(vl)二元載體的完成從pDAB3202中PCR擴增AAD-2(v1)基因。在PCR反應(yīng)中，在引物內(nèi)進行了改變，以在5’引物和3’引物中分別引入AfIIII和SacI限制性位點。使用FailSafePCR系統(tǒng)(Epicentre)用引物“NcolofBrady”[5′TATACCACATGTCGATCGCCATCCGGCAGCTT3′](SEQIDNO18)和“SacIofBrady”[5′GAGCTCCTATCACTCCGCCGCCTGCTGCTGCAC3′](SEQIDNO19)擴增DNA片段。將PCR產(chǎn)物克隆進pCR2.1TOPOTA克隆載體(Invitrogen)，使用BeckmanCoulter″DyeTerminatorCycleSequencingwithQuickStartKif″測序試劑用M13正向和M13反向引物驗證序列。測序數(shù)據(jù)鑒定了一個具有正確序列的克隆(pDAB716)。接著將Afllll/SacIAAD-2(v1)基因片段克隆進NcoI/SacIpDAB726載體。通過(用NcoI/SacI)限制性消化驗證得到的構(gòu)建體(pDAB717)；AtUbi10啟動子NtOSM5′UTRAAD-2(v1)NtOSM3′UTRORF1polyA3′UTR。將此構(gòu)建體以NotI-NotIDNA片段克隆進二元載體pDAB3038。(用NotI、EcoRI、HinDIII、Ncol、PvuII和Sal)限制性消化得到的構(gòu)建體(pDAB767)；AtUbi10啟動子NtOSM5′UTRAAD-2(v1)NtOSM3′UTRORF1polyA3′UTRCsVMV啟動子PATORF25/263′UTR以驗證正確的方向。接著用完成的構(gòu)建體(pDAB767)轉(zhuǎn)化進農(nóng)桿菌中。17.3-AAD-2(v1)和AAD-1(v1)底物特異性的比較測試了如實施例11制備的來自表達AAD-2(v1)(pDAB3202)的大腸桿菌提取物對四種除草劑2，4-滴、(R，S)-2，4-滴丙酸、(R，S)-吡氟氯禾靈和(R)-吡氟氯禾靈(均為0.5mM終濃度)的活性，每個測定使用15μl(42μg)大腸桿菌提取物和15分鐘的測定期。圖22顯示AAD-2(v1)對底物的相對活性為2，4-滴＝2，4-滴丙酸＞(R，S)-吡氟氯禾靈＞＞(R)-吡氟氯禾靈。因此AAD-2(v1)與AAD-1(v1)的差異在于它對2，4-滴和2，4-滴丙酸具有相似水平的活性(而AAD-1(v1)對2，4-滴的活性僅為2，4-滴丙酸的約10％)。AAD-2(v1)與AAD-1(v1)的差異還在于它不能作用于(R)-吡氟氯禾靈。表33顯示了來自用AAD-1(v1)和AAD-2(v1)測試其他底物的數(shù)據(jù)，證實了與(R)對映體特異性的AAD-1(v1)相反，AAD-2(v1)對(S)對映體底物具有特異性。在另一個測試中發(fā)現(xiàn)，AAD-2(v1)與AAD-1(v1)的差異在于它不或幾乎不從磺酸2，4-滴(其中磺酸基取代了的羧基)中釋放可檢測的酚，而AAD-1(v1)由此底物產(chǎn)生顯著水平的酚(約2，4-滴的25％)。使用2，4-滴作為底物比較了部分純化的AAD-1(v1)和AAD-2(v1)的酶動力學(xué)。見圖19。AAD-1(v1)和AAD-2(v1)對2，4-滴的Km值分別為97和423μM，表觀Vmax值分別為0.11和0.86A510單位(表34)。由于在測定中使用了等價量的酶(通過SDS-PAGE分析測定)，因此可以得出結(jié)論，AAD-2(v1)對2，4-滴的kcat幾乎比AAD-1(v1)高8倍，而kcat/Km高2倍。因此在體外AAD-2(v1)能比AAD-1(v1)顯著更高效的裂解2，4-滴。令人驚奇地，這與下文報道的植物中的發(fā)現(xiàn)相反，在報道中相對于AAD-2(v1)而言，表達AAD-1(v1)的植物能顯著更好的賦予2，4-滴抗性。注在MOPSpH6.75+1mMα酮戊二酸+0.1mM維生素C酸鈉+0.1mMFe2+中進行測定，使用4-氨基安替比林/鐵氰化物用色度法測定釋放的酚。17.4-轉(zhuǎn)化擬南芥的評估在室溫下使新收獲的轉(zhuǎn)化天然[AAD-1(v2)]、植物優(yōu)化的[AAD-1(v3)]或天然AAD-2(v1)基因的T1種子干燥7天。將T1種子種到26.5×51cm的萌發(fā)盤(T.O.PlasticsInc.，Clearwater，MN)中，每盤容納200mg(約10000個種子)的成層T1種子等分試樣，種子事先懸于40ml0.1％瓊脂糖溶液并在4℃保存2天以完成休眠的需要并保證同步的種子萌發(fā)用細蛭石覆蓋SunshineMixLP5(SunGroHorticultureInc.，Bellevue，WA)并用Hoagland溶液地下灌溉至濕透，接著重力排水。用移液管將成層種子的每個40ml的等分試樣均勻種在蛭石上并用保濕罩(KORDProducts，Bramalea，Ontario，Canada)覆蓋4-5天。在使用草甘膦出苗后噴灑(選擇共轉(zhuǎn)化的PAT基因)起始轉(zhuǎn)化體選擇之前1天去除蓋。種植后5到6天(DAP)以及10DAP用Liberty除草劑(200gai/L草銨膦，BayerCropSciences，KansasCity，MO)的0.2％溶液噴灑T1植物(分別為子葉期和2-4葉期)，在每次應(yīng)用中以10ml/盤(703L/ha)的噴灑體積使用DeVilbiss壓縮空氣噴霧頭使用280gai/ha有效劑量的草銨膦。在最后應(yīng)用5-7天后鑒定存活株(活躍生長的植物)并單獨移植到用盆栽基質(zhì)(MetroMix360)制備的3英寸盆中用保濕罩覆蓋移植的植物3-4天并如前置于22℃生長室中。其后去除蓋，并測試AAD-1(v3)、AAD-1(v2)或AAD-2(v1)提供苯氧基生長素除草劑抗性的能力之前至少1天將植物移至溫室(22+5℃、50±30％RH、14小時光照10小時黑暗、最小500μE/mV的自然+補充光)。選擇用于上述草銨膦抗性的隨機單個T1植物使用PATELISA試劑盒(部件號7000045，StrategicDiagnostics，Inc.，Newark，DE)確認(rèn)PAT蛋白質(zhì)的表達，以非破壞性的確認(rèn)選擇方法的保真度(生產(chǎn)商的方案)。接著將植物隨機提交多種用量的2，4-滴(50-800gae/ha)。以187L/ha的噴灑體積通過履帶式噴霧機應(yīng)用除草劑。使用的2，4-滴為混合在200mMTris緩沖液(pH9.0)中的商品二甲胺鹽配方(456gae/L，NuFarm，StJoseph，MO)。17.5-轉(zhuǎn)化植物的選擇結(jié)果首先使用AAD-1(v3)進行擬南芥轉(zhuǎn)化。首先使用草銨膦選擇方案從未轉(zhuǎn)化種子的背景中選擇T1轉(zhuǎn)化體。篩選了超過400000個T1種子，鑒定了493個草銨膦抗性植物(PAT基因)，等同于0.12％的轉(zhuǎn)化/選擇率。取決于測試種子的批次，其范圍從0.05-0.23％(見上文實施例6.5的表15)。還使用草銨膦選擇劑選擇了一小批天然AAD-1(v2)轉(zhuǎn)化種子。從篩選的84000個種子中鑒定了278個草銨膦抗性T1個體(0.33％的轉(zhuǎn)化/選擇率)。令人驚奇地，當(dāng)對草銨膦耐性(PAT選擇標(biāo)記物功能)進行選擇時，使用天然AAD-2(v1)基因的擬南芥轉(zhuǎn)化提供了極低的轉(zhuǎn)化率。篩選了約一百三十萬個種子，僅回收了228個草銨膦轉(zhuǎn)化體，等同于0.018％的轉(zhuǎn)化/選擇率(見表15)。天然AAD-2(v1)的轉(zhuǎn)化率僅為天然AAD-1(v2)的6％。接著合成優(yōu)化了天然AAD-2(v1)基因、克隆并使用前述方法(見表5)以pDAB3705轉(zhuǎn)化進擬南芥。植物優(yōu)化的AAD-2(v2)(編碼SEQIDNO30的SEQIDNO29)獲得了使用Liberty除草劑的正常T1擬南芥選擇率，約為0.11％(見表15)。其后將以上選擇的T1植物移植到單個盆中并用多種用量的芳氧基鏈烷酸酯商品除草劑噴灑。(上文實施例6.5中的)表16比較了AAD-1(v2)、AAD-1(v3)、AAD-2(v1)和AAD-2(v2)輸入2，4-滴抗性到擬南芥T1轉(zhuǎn)化體的應(yīng)答。相對于轉(zhuǎn)化和未轉(zhuǎn)化對照株系，所有基因都確實提供了一些顯著的2，4-滴抗性，然而，各個構(gòu)建體在其輸入2，4-滴抗性到個體T1擬南芥植物的能力上存在廣泛的差異。在給定的處理中，植物的應(yīng)答水平差異很大，這可歸因于每個植物代表獨立的轉(zhuǎn)化事件。要著重指出的是，在測試的每個2，4-滴用量下都存在未受影響的個體，而另外一些則受到嚴(yán)重的影響?？傮w種群平均損傷率示于表16，僅用于證明在轉(zhuǎn)化了AAD-1(v2)、AAD-1(v3)、AAD-2(v1)或AAD-2(v2)的植物和野生型或轉(zhuǎn)化PAT/CryIF的對照之間的顯著差異。令人驚奇地，從高耐性植物的頻率以及總體平均損傷來看，AAD-2(v1)轉(zhuǎn)化體對2，4-滴的耐性遠低于AAD-1(v2)或AAD-1(v3)(表16)。沒有轉(zhuǎn)化AAD-2(v1)的植物能相對無損傷(的可見損傷)的在200gae/ha2，4-滴下存活，總體種群損傷約為83％。相反，56％(80個中的45個)的AAD-1(v2)轉(zhuǎn)化T1植物無損傷的在下存活(種群平均損傷＝34％)，＞73％(15個中的11個)的AAD-1(v3)轉(zhuǎn)化植物無損傷(種群平均損傷＝14％)。見表20。植物優(yōu)化的AAD-2(v2)的耐性比天然基因略有提高，然而，AAD-1和AAD-2植物優(yōu)化基因的比較表明AAD-1(v3)在植物中具有顯著的優(yōu)勢(見表16)。由于AAD-1(v2)和AAD-2(v1)的體外比較表明AAD-2(v1)更好的降解2，4-滴，因此這些結(jié)果是未曾預(yù)料到的。AAD-2(v1)在T1植物個體中以預(yù)期的大小以變化的水平表達，然而這種表達的蛋白質(zhì)幾乎不提供對2，4-滴損傷的保護。Western印跡指出的表達水平和同一植物的2，4-滴損傷水平之間幾乎沒有關(guān)系。見圖21。天然和植物優(yōu)化的AAD-2基因(在植物中)的蛋白質(zhì)表達水平?jīng)]有明顯的大差異。這些數(shù)據(jù)證實了之前的發(fā)現(xiàn)，即在植物中產(chǎn)生AAD-1(v3)的功能性表達以輸入對2，4-滴和AOPP除草劑的抗性是意外。實施例18-種植前滅生性應(yīng)用此實施例和其后的實施例是本發(fā)明AAD-1帶來的新除草劑用途的具體實例，所述除草劑可能是由本發(fā)明的AAD-1制成。種植前滅生性除草劑應(yīng)用旨在在種植給定作物前殺死在冬天或早春出現(xiàn)的雜草。一般在種植前未完成物理除草的非耕地或減少的耕地管理系統(tǒng)中使用這些應(yīng)用。因此除草劑程序必須控制種植時存在的廣譜闊葉和禾本科雜草。草甘膦、對草快和草銨膦是種植前滅生除草劑應(yīng)用中廣泛使用的非選擇性無殘留除草劑的實例。然而，由于以下一種或多種原因使這個季節(jié)的一些雜草很難控制雜草物種或生物型對除草劑的內(nèi)在不敏感性、冬性一年生雜草的相對較大的大小和限制除草劑攝取和活性的涼爽的天氣條件。一些除草劑選擇可以與這些除草劑罐混以提高譜和對非選擇性除草劑不太有效的雜草的活性。實例為2，4-滴與草甘膦罐混應(yīng)用以輔助控制Conyzacanadensis(加拿大蓬)。用于存在的多數(shù)雜草的種植前滅生的草甘膦用量可從420到1680gae/ha，更一般的從560到840gae/ha，然而，可以應(yīng)用280-1120gae/ha的2，4-滴以輔助控制許多闊葉雜草物種(如加拿大蓬)。2，4-滴是優(yōu)選的除草劑，因為它對多種闊葉雜草有效、甚至在低溫下也有效并且非常廉價。然而，如果其后的作物為敏感性雙子葉作物，則土壤中的2，4-滴殘留(盡管殘留很短)可能對作物產(chǎn)生負影響。大豆是敏感性作物，需要在滅生應(yīng)用和種植之間存在至少7天(對于280gae/ha的2，4-滴用量)到至少30天(對于1120gae/ha的2，4-滴應(yīng)用)的時間。在棉花種植前禁止用2，4-滴進行滅生性處理(參閱聯(lián)邦label，多數(shù)通過CPR，2003提供或在cdms.net/manuf/manuf.asp在線提供)。使用AAD-1(v3)轉(zhuǎn)化的大豆，這些作物在土壤中來自之前甚至在種植后作物出苗前的滅生性應(yīng)用的2，4-滴殘留下存活。罐混(或商品預(yù)混)伴侶中提高的靈活性和降低的費用可改善雜草控制的選擇并提高重要的非耕地或減少耕地條件下滅生性應(yīng)用的強度。此實施例是可能的多種選擇之一。通過使用聯(lián)邦除草劑標(biāo)簽(CPR，2003)中所述產(chǎn)品和例如AgrilianceCropProtectionGuide(2003)所描述的用途，雜草控制領(lǐng)域的技術(shù)人員會注意到多種其他應(yīng)用，包括但不僅限于對草快+2，4-滴或草銨膦+2，4-滴。本領(lǐng)域技術(shù)人員還會認(rèn)識到，以上實施例可應(yīng)用于任何由AAD-1(v3)基因(如果穩(wěn)定轉(zhuǎn)化后)保護的2，4-滴敏感性(或其他苯氧基生長素)作物。實施例19-苯氧基生長素除草劑在僅轉(zhuǎn)化AAD-1(v3)的大豆、棉花和其他雙子葉作物中的植物內(nèi)應(yīng)用AAD-1(v3)使得可以在通常對2，4-滴敏感的作物中使用苯氧基生長素除草劑(如2，4-滴、2，4-滴丙酸、MCPA等)直接控制廣譜闊葉雜草。280到2240gae/ha的2，4-滴應(yīng)用可控制農(nóng)業(yè)環(huán)境中存在的多數(shù)闊葉雜草物種。更一般的使用560-1120gae/ha。就完全的雜草控制系統(tǒng)而言，禾本科雜草必須受到控制。目前已批準(zhǔn)將多種闊葉譜禾本科除草劑(包括但不僅限于吡氟氯禾靈、喹禾靈、fenoxaprop、二氫吡啶、sethoxydim和clethodim)用于多數(shù)天然耐受這些除草劑的雙子葉作物。喹禾靈(20-100gae/ha)加2，4-滴(420-840gae/ha)的組合可在轉(zhuǎn)化了AAD-1(v3)雙子葉作物(即大豆或棉花)提供兩種除草劑作用模式，可以與草甘膦在草甘膦耐性作物中相似的方式控制多數(shù)農(nóng)業(yè)雜草(見雜草控制譜，參閱AgrilianceCropProtectionGuide性能評定)。這種額外的工具的優(yōu)勢是闊葉除草劑組分極低的費用和以較高用量使用時較高用量的2，4-滴和/或AOPP除草劑提供的可能的短期殘留雜草控制，而非殘留除草劑如草甘膦不提供對后來的禾本科雜草的控制。這種工具還提供了借助HTC作為整合的除草劑抗性輪換除草劑作用模式的機制和草甘膦耐性作物/AAD-1(v3)HTC輪作策略中雜草轉(zhuǎn)換管理的策略(無論是否輪作作物物種)。另外，此系統(tǒng)的禾本科和闊葉雜草控制組分彼此獨立，因此允許雜草控制領(lǐng)域的技術(shù)人員確定生長素和AOPP除草劑最經(jīng)濟和高效的比例。例如，如果當(dāng)需要除草劑應(yīng)用時闊葉雜草是僅存的顯著雜草，則可以無另一種除草劑的進行560到1120gae/ha2，4-滴的除草劑應(yīng)用。這可以降低不必要的除草劑應(yīng)用，提供降低輸入費用和降低殺蟲劑環(huán)境載荷的靈活性，并降低不必要的發(fā)展除草劑抗性雜草的選擇壓。其他益處包括對以2，4-滴漂移或揮發(fā)為機制的遠距離2，4-滴對雙子葉作物的損傷的耐性；在2，4-滴應(yīng)用后種植之前不需要間隔(見前述實施例)和較少的由未完全清潔的含有2，4-滴的大罐引起的對雙子葉作物的污染損傷問題。二氯甲氧苯酸(和其他除草劑)仍可用于繼續(xù)控制轉(zhuǎn)化了AAD-1(v3)的雙子葉作物自生作物。本領(lǐng)域技術(shù)人員還會認(rèn)識到，以上實施例可用于可被穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的AAD-1(v3)基因保護的任何2，4-滴(或其他苯氧基生長素除草劑)敏感性作物。雜草控制領(lǐng)域的技術(shù)人員會認(rèn)識到，AAD-1(v3)轉(zhuǎn)化使得可以使用單獨或與多種商品AOPP除草劑組合的多種商品苯氧基生長素除草劑?？梢酝ㄟ^CPR(《作物保護參考》)書中匯編的除草劑標(biāo)簽或類似的匯編或任何商品或?qū)W術(shù)作物保護參考(如來自Agriliance的《作物保護指南》(2003))確定這些化學(xué)中其他代表性除草劑的具體用量。每種由于AAD-1(v3)而可以使用于HTC的(單獨、罐混或順序使用的)備選除草劑都考慮在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實施例20-苯氧基生長素和AOPP除草劑在僅轉(zhuǎn)化AAD-1(v3)的玉米、稻和其他單子葉物種中的植物內(nèi)用途以類似的方式用AAD-1(v3)轉(zhuǎn)化禾本科物種(例如但不僅限于玉米、稻、小麥、大麥或草坪和牧草)將使得可以在通常對高效AOPP禾本科除草劑敏感的作物中使用這些除草劑。多數(shù)禾本科物種對生長素除草劑如苯氧基生長素(即2，4-滴、2，4-滴丙酸等)具有天然耐性。然而，由于應(yīng)用時間窗口變短和替代的闊葉雜草，相對低水平的作物選擇性導(dǎo)致了這些植物中應(yīng)用的減少。因此轉(zhuǎn)化了AAD-1(v3)的單子葉作物可使得使用描述用于處理雙子葉作物的類似組合，如應(yīng)用280到2240gae/ha的2，4-滴控制多數(shù)闊葉雜草物種。更一般的使用560-1120gae/ha。多種廣譜AOPP禾本科除草劑(包括但不僅限于吡氟氯禾靈、喹禾靈、fenoxaprop和吡氟禾草靈)可用于有效控制廣泛使用的禾本科雜草。環(huán)己二酮禾本科除草劑如sethoxydim、clethodim等不能用于這種雙子葉作物系統(tǒng)，因為AAD-1不能提供對此化學(xué)品的保護，并且禾本科作物對環(huán)己二酮化學(xué)品天然敏感。然而，這種屬性可允許將環(huán)己二酮用于轉(zhuǎn)化了AAD-1(v3)的禾本科作物自生作物的繼后控制。現(xiàn)在AAD-1使類似的雜草控制策略可用于雙子葉物種。喹禾靈(20-100gae/ha)加2，4-滴(420-840gae/ha)的組合可在轉(zhuǎn)化了AAD-1(v3)的單子葉作物(如玉米和稻)中提供兩種除草劑作用模式，可以與草甘膦在草甘膦耐性作物中相似的方式控制多數(shù)農(nóng)學(xué)雜草(參考AgrilianceCropProtectionGuide性能評定的雜草控制譜)這種額外的工具的優(yōu)勢是闊葉除草劑組分費用極低和以較高用量使用時較高用量的2，4-滴和/或AOPP除草劑提供的可能的短期殘留雜草控制。相比之下，非殘留除草劑(如草甘膦)不提供對后來的禾本科雜草的控制。這種工具還提供了借助HTC作為整合的除草劑抗性輪換除草劑作用模式的機制和草甘膦耐性作物/AAD-1(v3)HTC輪作策略中雜草轉(zhuǎn)換管理的策略(無論是否輪作作物物種)。另外，此系統(tǒng)的禾本科和闊葉雜草控制組分彼此獨立，因此允許雜草控制領(lǐng)域的技術(shù)人員確定生長素和AOPP除草劑最經(jīng)濟和有效的比例。例如，如果當(dāng)需要除草劑應(yīng)用時闊葉雜草是僅存的顯著雜草，則可以無另一種除草劑的進行560到1120gae/ha2，4-滴的除草劑應(yīng)用。這可以降低不必要的除草劑應(yīng)用，提供降低輸入費用和降低殺蟲劑環(huán)境載荷的靈活性，并降低不必要的發(fā)展除草劑抗性雜草的選擇壓。玉米和其他單子葉植物對苯氧基生長素提高的耐性將能夠在作物中使用這些除草劑而無生長階段限制或作物傾斜、展開現(xiàn)象如“鼠尾”、作物傾斜、玉米中生長調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)的莖脆性或支柱根變形的可能。本領(lǐng)域技術(shù)人員還會認(rèn)識到，以上實施例可用于可被穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的AAD-1(v3)保護免受AOPP除草劑損傷的任何單子葉作物。雜草控制領(lǐng)域的技術(shù)人員會認(rèn)識到，AAD-1(v3)轉(zhuǎn)化使得可以使用單獨或與多種商品AOPP除草劑組合的多種商品苯氧基生長素。可以通過CPR(《作物保護參考》)書中匯編的除草劑標(biāo)簽或類似的匯編、在線(如cdms.net/manuf/manuf.asp)匯編的標(biāo)簽或任何商品或?qū)W術(shù)作物保護參考(如來自Agriliance的《作物保護指南》(2003))確定這些化學(xué)中其他代表性除草劑的具體用量。每種由于AAD-1(v3)而可以使用于HTC的(單獨、罐混或順序使用的)備選除草劑都考慮在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實施例21-任一作物中與草甘膦耐性性狀疊加的AAD-1(v3)北美大田種植的絕大多數(shù)棉花、蕓苔和大豆含有草甘膦耐性(GT)性狀，并且對GT作物的選用正在增加。其他GT作物(如小麥、稻、甜菜和草坪)已在開發(fā)中，但目前尚未獲得商品許可。許多其他草甘膦耐性物種正在實驗至開發(fā)階段(如苜蓿、甘蔗、向日葵、甜菜、豌豆、胡蘿卜、黃瓜、萵苣、洋蔥、草莓、西紅柿和煙草、林業(yè)物種如白楊和香楓以及園藝物種如金盞花、牽?；ê颓锖Ｌ?，萬維網(wǎng)上的isb.vt.edu/cfdocs/fieldtestsl.cfm，2005)。GTC是受控雜草sheerbreadth的有用工具，此系統(tǒng)提供便利性和費用效益。然而，草甘膦作為目前標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)處理的用途正在選擇草甘膦抗性雜草。此外，在實行僅用草甘膦化學(xué)品的程序的大田中草甘膦固有效力較低的雜草正在演替為主要物種。通過常規(guī)育種或共同作為新轉(zhuǎn)化事件將AAD-1(v3)與GT性狀疊加可以改進雜草控制的效力、靈活性和管理雜草演替及除草劑抗性發(fā)展的能力。如前述實施例中所提到的，通過用AAD-1(v3)轉(zhuǎn)化作物，可以在單子葉作物中選擇性應(yīng)用AOPP除草劑，單子葉作物將具有較高的苯氧基生長素安全限度，并可以在雙子葉作物中選擇性應(yīng)用苯氧基生長素。可以想像改善的雜草控制選擇的一些方案，其中在任意單子葉或雙子葉作物物種中疊加了AAD-1(v3)和GT性狀a)可以以標(biāo)準(zhǔn)出苗后用量(420至2160gae/ha，優(yōu)選560至840gae/ha)應(yīng)用草甘膦，用于控制多數(shù)禾本科和闊葉雜草物種。為控制草甘膦抗性闊葉雜草如加拿大蓬或內(nèi)在難以控制的雜草(如鴨跖草科)，可以連續(xù)、罐混或作為預(yù)混料與草甘膦一起應(yīng)用280-2240gae/ha(優(yōu)選560-1120gae/ha)2，4-滴以提供有效控制。b)可以以標(biāo)準(zhǔn)出苗后用量(420至2160gae/ha，優(yōu)選560至840gae/ha)應(yīng)用草甘膦，用于控制多數(shù)禾本科和闊葉雜草物種。為控制草甘膦抗性禾本科物種如Loliumrigidum或Eleusineindica，可以連續(xù)、罐混或作為預(yù)混料與草甘膦一起應(yīng)用10-200gae/ha(優(yōu)選20-100gae/ha)喹禾靈以提供有效控制。c)目前，應(yīng)用于GTC的草甘膦用量范圍一般為每個應(yīng)用時間560至2240gae/ha。草甘膦對于禾本科物種的效力遠高于闊葉雜草物種。AAD-1(v3)+GT疊加性狀可允許禾本科有效的草甘膦用量(105-840gae/ha，更優(yōu)選210-420gae/ha)。接著可以連續(xù)、罐混或預(yù)混與禾本科有效用量的草甘膦一起應(yīng)用2，4-滴(280-2240gae/ha，更優(yōu)選560-1120gae/ha)以提供必要的闊葉雜草控制。AOPP除草劑如10-200gae/ha(優(yōu)選20-100gae/ha且更優(yōu)選20-35gae/ha)的喹禾靈可以用于更強的禾本科雜草控制和/或用于延緩草甘膦抗性草的發(fā)展。草甘膦的低用量還可為闊葉雜草控制提供一些益處，然而初期控制可來自2，4-滴。雜草控制領(lǐng)域的技術(shù)人員會認(rèn)識到，AAD-1(v3)轉(zhuǎn)化進作物使得可以單獨或與一種或多種AOPP除草劑組合(連續(xù)或獨立的)使用一種或多種商品苯氧基生長素除草劑。可以通過CPR(《作物保護參考》)書中匯編的除草劑標(biāo)簽或類似的匯編、在線(如cdms.net/manuf/manuf.asp)匯編的標(biāo)簽或任意商品或?qū)W術(shù)作物保護指南(如Agriliance的《作物保護指南》(2003))確定這些化學(xué)中其他代表性除草劑的具體用量。每種由于AAD-1(v3)而可以在HTC中使用(單獨、罐混或連續(xù)使用)的備選除草劑都考慮在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實施例22-在任意作物中與草銨膦耐性疊加的AAD-1(v3)草銨膦耐性(PAT或bar)目前作為輸入性狀(如昆蟲抗性蛋白)的選擇標(biāo)記物或具體作為HTC性狀存在于北美種植的大量作物中。作物包括但不僅限于草銨膦耐性蕓苔、玉米和棉花。其他的草銨膦耐性作物(如稻、甜菜、大豆和草坪)已在開發(fā)中，但目前尚未準(zhǔn)予上市。與草甘膦相似，草銨膦是相對非選擇性廣譜禾本科和闊葉除草劑。草銨膦的作用方式與草甘膦不同。其作用較快，在除草劑應(yīng)用24-48小時后引起受到處理的葉的脫水和“燒傷”。這對于表現(xiàn)快速雜草控制是有利的。然而，這也限制了草銨膦向靶植物分生組織區(qū)的轉(zhuǎn)移，引起較弱的雜草控制，這被兩種化合物在許多物種中的相對雜草控制性能評定所證明(Agriliance，2003)。通過常規(guī)育種或共同作為新轉(zhuǎn)化事件將AAD-1(v3)與草銨膦耐性性狀疊加可以改進雜草控制的效力、靈活性和管理雜草演替及除草劑抗性發(fā)展的能力。如前述實施例中所提到的，通過用AAD-1(v3)轉(zhuǎn)化作物，可以在單子葉作物中選擇性應(yīng)用AOPP除草劑，單子葉作物將具有較高的苯氧基生長素安全限度，并可以在雙子葉作物中選擇性應(yīng)用苯氧基生長素?？梢韵胂窀纳频碾s草控制選擇的一些方案，其中在任意單子葉或雙子葉作物物種中疊加了AAD-1(v3)和草銨膦性狀a)可以以標(biāo)準(zhǔn)出苗后用量(200至1700gae/ha，優(yōu)選350至500gae/ha)應(yīng)用草甘膦，用于控制多種禾本科和闊葉雜草物種。目前尚未確認(rèn)草銨膦抗性雜草，然而固有對草銨膦更有耐性的雜草數(shù)目多余草甘膦。i)通過罐混10-200gae/ha(優(yōu)選20-100gae/ha)喹禾靈來控制固有耐性的禾本科雜草物種(如Echinochloaspp或Sorghumspp)。ii)內(nèi)在耐性闊葉雜草物種(如Cirsiumarvensis和Apocynumcannabinum)的控制可通過罐混280-2240gae/ha(更優(yōu)選560-2240gae/ha)的2，4-滴以有效控制這些更難以控制的多年生物種并改進對一年生闊葉雜草物種的控制強度。b)三重組合(如草銨膦(200-500gae/ha)+2，4-滴(280-1120gae/ha)+喹禾靈(10-100gae/ha))可提供更強的重疊雜草控制譜。另外，重疊譜提供管理或延緩除草劑抗性雜草的另一種機制。雜草控制領(lǐng)域的技術(shù)人員會認(rèn)識到，AAD-1(v3)轉(zhuǎn)化進作物使得可以單獨或與一種或多種AOPP除草劑組合(連續(xù)或獨立的)使用一種或多種商品苯氧基生長素除草劑?？梢酝ㄟ^CPR(《作物保護參考》)書或類似的匯編中匯編的除草劑標(biāo)簽、在線(如cdms.net/manuf/manuf.asp)匯編的標(biāo)簽或任意商品或?qū)W術(shù)作物保護指南(如Agriliance的《作物保護指南》(2003))確定這些化學(xué)中其他代表性除草劑的具體用量。每種由于AAD-1(v3)而可以在HTC中使用(單獨、罐混或連續(xù)使用)的備選除草劑都考慮在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實施例23-在任一作物中與AHAS性狀疊加的AAD-1(v3)咪唑啉酮除草劑耐性(AHAS等)目前存在于北美種植的大量作物中，包括但不僅限于玉米、稻和小麥。其他的咪唑啉酮耐性作物(如棉花和甜菜)已在開發(fā)中，但目前尚未上市。目前將許多咪唑啉酮除草劑(如甲氧咪草煙、咪草煙、滅草喹和甲咪唑煙酸)選擇性用于多種常規(guī)作物中。通過耐性性狀如AHAS等使得可以使用咪草煙、甲氧咪草煙和非選擇性的咪唑煙酸。咪唑啉酮耐性HTC目前具有轉(zhuǎn)基因的優(yōu)勢。這類化學(xué)品也具有顯著的土壤殘留活性，因此與基于草甘膦和草銨膦的系統(tǒng)不同，它能提供延長超過應(yīng)用時間的雜草控制。然而，咪唑啉酮除草劑控制的雜草譜不如草甘膦廣泛(Agriliance，2003)。另外，咪唑啉酮除草劑具有許多雜草已經(jīng)對其發(fā)展出抗性的作用模式(抑制乙酰乳酸合酶，ALS)(Heap，2004)。通過常規(guī)育種或共同作為新轉(zhuǎn)化事件將AAD-1(v3)與咪唑啉酮耐性性狀疊加可以改進雜草控制的效力、靈活性和管理雜草演替及除草劑抗性發(fā)展的能力。如前述實施例中所提到的，通過用AAD-1(v3)轉(zhuǎn)化作物，可以在單子葉作物中選擇性應(yīng)用AOPP除草劑，單子葉作物將具有較高的苯氧基生長素安全限度，并可以在雙子葉作物中選擇性應(yīng)用苯氧基生長素。可以想像改善的雜草控制選擇的一些方案，其中在任意單子葉或雙子葉作物物種中疊加了AAD-1(v3)和咪唑啉酮耐性性狀a)可以以標(biāo)準(zhǔn)出苗后用量(35至280gae/ha，優(yōu)選70至140gae/ha)應(yīng)用草甘膦，用于控制多種禾本科和闊葉雜草物種。目前尚未確認(rèn)草銨膦抗性雜草，然而固有對草銨膦更有耐性的雜草數(shù)目多余草甘膦。i)可以通過罐混280-2240gae/ha(更優(yōu)選560-2240gae/ha)的2，4-滴來控制ALS抑制劑抗性闊葉雜草物種(如Amaranihusrudis、Ambrosiatrifida、Chenopodiumalbum(等等，Heap，2004))。ii)也可以通過罐混280-2240gae/ha(更優(yōu)選560-2240gae/ha)的2，4-滴來控制固有對咪唑啉酮更具耐性的闊葉物種。iii)可以罐混10-200gae/ha(優(yōu)選20-100gae/ha)喹禾靈來控制ALS抑制劑抗性禾本科雜草(如Sorghumhalepense和Loliumspp)。iv)也可以罐混10-200gae/ha(優(yōu)選20-100gae/ha)喹禾靈來控制固有更具耐性的禾本科雜草物種。b)三重組合(如咪草煙(35-280gae/ha，優(yōu)選70-140gae/ha)+2，4-滴(280-1120gae/ha)+喹禾靈(10-100gae/ha))可提供更強的重疊雜草控制譜。另外，重疊譜提供管理或延緩除草劑抗性雜草的另一種機制。雜草控制領(lǐng)域的技術(shù)人員會認(rèn)識到，通過AAD-1(v3)轉(zhuǎn)化并通過常規(guī)育種或遺傳工程與任意咪唑啉酮耐性顯著疊加使得可以單獨或以多種組合使用多種商品咪唑啉酮除草劑、苯氧基生長素除草劑或AOPP除草劑?？梢酝ㄟ^CPR(《作物保護參考》)書或類似的匯編中匯編的除草劑標(biāo)簽、在線(如cdms.net/manuf/manuf.asp)匯編的標(biāo)簽或任意商品或?qū)W術(shù)作物保護指南(如Agriliance的《作物保護指南》(2003))確定這些化學(xué)品中其他代表性除草劑的具體用量。每種由于AAD-1(v3)而可以在HTC中使用(單獨、罐混或連續(xù)使用)的備選除草劑都考慮在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實施例24-稻中的AAD-1(v3)24.1-培養(yǎng)基說明用1MKOH將使用的培養(yǎng)基調(diào)整至pH5.8，并用2.5g/lPhytagel(Sigma)固化。在含有40ml半固體培養(yǎng)基的100×20mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)胚胎發(fā)生愈傷組織。在Magenta盒中的50ml培養(yǎng)基中培養(yǎng)稻小植株。在含有35ml液體培養(yǎng)基的125ml錐形瓶中維持細胞懸液并以125rpm旋轉(zhuǎn)。在25-26℃在黑暗中誘導(dǎo)和維持胚胎發(fā)生培養(yǎng)物，在16小時光周期下進行植物再生和全植物培養(yǎng)(Zhang等1996)。如前述在NB基礎(chǔ)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)和維持胚胎發(fā)生愈傷組織(Li等，1993)，但調(diào)整為含有500mg/l谷氨酰胺。在SZ液體培養(yǎng)基(Zhang等1998)中起始和維持懸浮培養(yǎng)物，其中含有代替麥芽糖的30g/l蔗糖。滲透培養(yǎng)基(NBO)由加入各0.256M的甘露醇和山梨醇的NB培養(yǎng)基組成。在補充了50mg/l潮霉素B的NB培養(yǎng)基上選擇潮霉素B抗性愈傷組織3到4周。在由NB培養(yǎng)基組成的培養(yǎng)基(PRH50)上預(yù)再生一周，其中NB培養(yǎng)基無2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-滴)，但加入了2mg/l6-芐氨基嘌呤(BAP)、1mg/lα-萘乙酸(NAA)、5mg/l脫落酸(ABA)和50mg/l潮霉素B。接著通過在再生培養(yǎng)基(RNH50)上培養(yǎng)至嫩枝再生來再生小植株，所述再生培養(yǎng)基含有無2，4-滴并補充了3mg/lBAP、0.5mg/lNAA和50mg/l潮霉素B的NB培養(yǎng)基。將嫩枝轉(zhuǎn)移到含有半濃度Murashige和Skoog基礎(chǔ)鹽和GamborgB5維生素、補充了1％蔗糖和50mg/l潮霉素B的生根培養(yǎng)基(1/2MSH50)。24.2-組織培養(yǎng)發(fā)育如Zhang等1996所述將日本稻臺北309(OryzasativaL.japonicacv.Taipei309)的成熟干燥種子滅菌。通過在黑暗中在NB培養(yǎng)基上無菌培養(yǎng)成熟稻種誘導(dǎo)胚胎發(fā)生組織。將直徑約1mm的原始愈傷組織從盾片中移出，并用于在SZ液體培養(yǎng)基中起始細胞懸液。接著如Zhang1995所述維持懸液。前述繼代培養(yǎng)后3-5天后將來自懸液的胚胎發(fā)生組織從液體培養(yǎng)基中移出，并置于培養(yǎng)皿中的NBO滲透培養(yǎng)基上以形成跨過約2.5cm的圓圈，在轟擊前培養(yǎng)4小時。轟擊16到20小時后，將組織從NBO培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到NBH50潮霉素B選擇培養(yǎng)基上(保證轟擊表面向上)，并在黑暗中孵育14-17天。接著從原始轟擊外植體分離新形成的愈傷組織放在旁邊的相同培養(yǎng)基上。再過8-12天后，可目測鑒定相對致密、不透明的愈傷組織，并轉(zhuǎn)移到PRH50預(yù)再生培養(yǎng)基在黑暗中經(jīng)過7天。接著將變得更加致密和不透光的生長的愈傷組織繼代培養(yǎng)到RNH50再生培養(yǎng)基上，在16小時光周期下經(jīng)過14-21天的時間。將再生的嫩枝轉(zhuǎn)移到含有1/2MSH50培養(yǎng)基的Magenta盒中。再生自單個外植體的多個植物認(rèn)為是同胞，以一個獨立植物株系處理。如果植物產(chǎn)生粗的白色根并在1/2MSH50培養(yǎng)基上旺盛生長，則將其評定為hph基因陽性。當(dāng)植物達到Magenta盒的頂部時，將其轉(zhuǎn)移到100％濕度下6cm盆里的土壤中一周，接著在移植到溫室中的13cm盆之前移至14小時30℃的光照期和21℃黑暗的培養(yǎng)箱中2-3周。收集種子并在37℃干燥一周，接著保存于4℃。24.3-微粒轟擊用BiolisticPDS-1000/HeTM系統(tǒng)(Bio-Rad，Laboratories，Inc.)實施所有轟擊。將300mg1.0μm直徑的金顆粒用100％乙醇洗滌一次，用無菌蒸餾水洗滌兩次并重懸于經(jīng)硅化處理的Eppendorf管中的50μl水中。在金懸液中加入500μg質(zhì)粒DNA(1∶6摩爾比的pDOW3303(含有Hpt的載體)和pDAB3404)、20μl亞精胺(0.1M)和50μl氯化鈣(2.5M)。在室溫下孵育混合物10分鐘，以10000rpm沉淀10秒，重懸于60μl冷的100％乙醇并給每個巨載體分配8-9μl。以Zhang等(1996)所述的1100psi和27英寸Hg真空轟擊組織樣品。24.4-耐性測試使用DeVilbiss球狀噴霧器(型號15-RD，玻璃噴嘴)用含有1％(體積/體積)Agridex作物油濃縮劑的DuPontTMAssure_II0.3％(體積/體積)溶液噴灑3-5葉期的稻小植株。此濃縮劑對應(yīng)于約140gae/ha。在通風(fēng)櫥中以8-12英寸距離用噴霧器的6次完全噴射噴灑每株植物，以使整個植物被等量的除草劑覆蓋。每次噴射項小植株輸送約100μl溶液。噴灑后，使小植株干燥1小時之后再移出通風(fēng)櫥。在處理后10-14天(DAT)進行敏感性或抗性評定，示于下文表35。24.5-組織收獲、DNA分離和定量將新鮮組織置于管中并在4℃低壓凍干兩天。組織完全干燥后，將鎢珠(Valenite)放進管中并使用Kelco玻珠研磨機將樣品干磨1分鐘。其后遵循標(biāo)準(zhǔn)DNeasyDNA分離方案(Qiagen，DNeasy69109)。將提取的DNA的等分試樣用PicoGreen(MolecularProbesP7589)染色并與已知標(biāo)準(zhǔn)品一起在熒光計(BioTek)中讀數(shù)，以得到以ng/μl計的濃度。24.6-Southern印跡分析用得自QiagenDNeasy試劑盒的總DNA進行Southern印跡分析。用HindIII過夜消化總計2μgDNA以得到整合數(shù)據(jù)。同樣用MfeI過夜消化總計2μgDNA以得到PTU數(shù)據(jù)。過夜消化后在1％凝膠上電泳約100ng的等分試樣以確認(rèn)完全消化。確認(rèn)后將樣品在大塊0.85％瓊脂糖凝膠上以40伏電泳過夜。接著在0.2MNaOH、0.6MNaCl中使凝膠變性30分鐘。接著將膠在pH7.5的0.5MTrisHCl、1.5MNaCl中中和30分鐘。接著裝配含有20×SSC的凝膠裝置，以得到凝膠到尼龍膜(MilliporeINYC00010)的過夜重力轉(zhuǎn)移。過夜轉(zhuǎn)移之后，以1200×100微焦耳通過交聯(lián)儀(stratageneUV交聯(lián)儀1800)將膜置于UV光下。接著在0.1％SDS、0.1SSC中洗膜45分鐘。洗滌45分鐘后，將膜在80℃烘干3小時并保存于4℃至雜交。通過使用質(zhì)粒pDAB3404的編碼區(qū)PCR制備雜交模板片段。將總計100ng總DNA作為模板。使用20mM每種引物和TakaraExTaqPCR聚合酶試劑盒(MirusTAKRR001A)。用于Southern片段PCRAAD-1的引物為(正向-ATGGCTCATGCTGCCCTCAGCC)(SEQIDNO31)和(反向-GGGCAGGCCTAACTCCACCAA)(SEQIDNO32)。在9700Geneamp熱循環(huán)儀(AppliedBiosystems)中進行PCR反應(yīng)將樣品置于94℃3分鐘，94℃30秒、63℃30秒、72℃1分45秒的35個循環(huán)和其后72℃的10分鐘。在1％瓊脂糖凝膠上電泳產(chǎn)物并切開，接著使用Qiagen(28706)凝膠提取方案提取凝膠。接著將膜置于PerfectHyb緩沖液(SigmaH7033)中60℃的預(yù)雜交步驟1小時。使用PrimeitRmTdCTP標(biāo)記反應(yīng)(Stratagene300392)方案開發(fā)基于p32的探針(PerkinElmer)。使用ProbeQuant.G50柱(Amersham27-5335-01)提純探針。用每毫升二百萬計數(shù)CPM與southern印跡雜交過夜。過夜雜交后將印跡置于65℃下在0.1％SDS，0.1SSC中20分鐘的兩次洗滌中。接著使印跡過夜暴露于無機發(fā)光材料顯像屏并用storm掃描儀(MOLECULARDEVICES)掃描。結(jié)果的概述示于表36。植物63-1A和63-1F不是相同的事件。植物63-4A和63-4D是相同的事件。這些事件具有預(yù)期大小的PTU，但是非常復(fù)雜。此Southern印跡PTU數(shù)據(jù)與表達數(shù)據(jù)和噴灑數(shù)據(jù)相關(guān)。樣品63-6C沒有足以進行整合和PTUsouthern印跡的DNA。24.7-Western數(shù)據(jù)樣品制備和分析條件如前述。使用ELISA和Western印跡分析了5個轉(zhuǎn)基因稻株系和1個非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏腁AD-1表達。在4個株系(63-1A、63-1F、63-4B和63-4D)中檢測到了AAD-1，但在株系63-1C和對照植物中沒有。表達水平從可溶性蛋白總量的15.6到183ppm。結(jié)果概述示于表37。實施例25-草坪草轉(zhuǎn)化方法可以如下文一般描述的通過從種子(cv.Penn-A-4)起始的胚胎發(fā)生愈傷組織實現(xiàn)匍匐翦股穎中由根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的用AAD-1(v3)替換“bar”基因的遺傳轉(zhuǎn)化。參閱“EffciencyofAgrobacteriumtumefaciens-medistedturfgrass(AgrostisstoloniferaL)transformation”(Luo等，2004)。用帶有超級二元載體的根瘤農(nóng)桿菌菌株(LBA4404)感染愈傷組織，所述超級二元載體含有由稻泛素啟動子驅(qū)動的除草劑抗性bar基因。總體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化效率范圍從18％到45％。Southern印跡和遺傳分析證實了轉(zhuǎn)基因在匍匐翦股穎基因組中的整合和轉(zhuǎn)基因在T1代中的正常輸入和穩(wěn)定表達。所有的獨立轉(zhuǎn)化事件帶有1到3個轉(zhuǎn)基因拷貝，多數(shù)(60％-65％)僅含有外源基因的單拷貝，沒有明顯的重排。25.1-用于胚胎發(fā)生愈傷組織誘導(dǎo)的種子的制備用砂紙使成熟種子脫皮，并在10％(體積/體積)Clorox漂白劑(6％次氯酸鈉)加0.2％(體積/體積)Tween20(聚山梨酯20)中劇烈振蕩90分鐘表面滅菌。在無菌蒸餾水中洗滌5次后，將種子置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS基礎(chǔ)鹽和維生素、30g/l蔗糖、500mg/l酪蛋白水解物、6.6mg/l3，6-二氯-o-anisicacid(二氯甲氧苯酸)、0.5mg/l6-芐氨基嘌呤(BAP)和2g/l植烷。以120℃高壓滅菌20分鐘前將pH調(diào)整至5.7)上。25.2-胚胎發(fā)生愈傷組織誘導(dǎo)室溫下將含有制備的種子外植體的培養(yǎng)皿保存在黑暗中6周?？梢娺x擇胚胎發(fā)生愈傷組織并繼代培養(yǎng)到新鮮的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在共培養(yǎng)之前在室溫下在黑暗中培養(yǎng)1周。25.3-農(nóng)桿菌感染和共培養(yǎng)農(nóng)桿菌感染前1天，將胚胎發(fā)生愈傷組織分成1-2mm的片，放在含有100μM乙酰丁香酮的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。對每片愈傷組織應(yīng)用10μl等分試樣(LBA4404)的農(nóng)桿菌懸液(660nm處OD＝1.0)，接著在25℃在黑暗中共培養(yǎng)3天。25.4-靜止期和農(nóng)桿菌對照對于抗生素處理步驟，轉(zhuǎn)移愈傷組織并在愈傷組織培養(yǎng)基加125mg/l頭孢噻肟和250mg/l氨芐西林(用于抑制細菌生長)上培養(yǎng)2周。25.5-選擇和潛在轉(zhuǎn)基因集落的鑒定其后，為進行選擇，將愈傷組織移至含有250mg/l頭孢噻肟和10mg/l膦絲菌素(PPT)的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上8周。室溫下在黑暗中進行抗生素處理和整個選擇過程。選擇期間的繼代培養(yǎng)間隔(subcultureinterval)一般為3周。25.6-轉(zhuǎn)基因植物的再生對于植物再生，首先將PPT抗性增育愈傷組織事件移至補充了頭孢噻肟、PPT或潮霉素的再生培養(yǎng)基(MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基、30g/l蔗糖、100mg/l肌醇、1mg/lBAP和2g/lPhytagel)。室溫下使這些愈傷組織保持在黑暗中1周，接著移至光照下2-3周以發(fā)育嫩枝。用PPT避免選擇白化體(如果使用潮霉素作為選擇劑則產(chǎn)生高水平的白化植物)。25.7-根誘導(dǎo)并轉(zhuǎn)移到溫室接著分開小嫩枝并轉(zhuǎn)移到含有PPT和頭孢噻肟的無激素再生培養(yǎng)基，以保持選擇壓的促進根生長并抑制殘留的農(nóng)桿菌細胞。接著將根發(fā)育良好的小植株(3-5周)轉(zhuǎn)移到土壤并在溫室或大田中生長。25.8-轉(zhuǎn)基因植物的春化和異型雜交在封閉苗圃中室外保持轉(zhuǎn)基因植物(3-6個月)至12月冬至。接著將已春化植物轉(zhuǎn)移到溫室中并在16/8小時光周期下保持在25℃，并用非轉(zhuǎn)基因野生型植物圍繞使其與其他花粉來源物理分離。移回溫室后3-4周植物開始開花。它們與周圍野生型植物的花粉異型雜交。使收集自每個個體轉(zhuǎn)基因植物的種子在25℃下在土壤中萌發(fā)，在溫室中培養(yǎng)T1植物用于進一步分析。25.9-其他靶禾本科植物本發(fā)明的AAD-1轉(zhuǎn)化可以靶定的其他禾本科植物包括一年生草坪草(Poaannua)、美洲雀稗、翦股穎、鐵線草、莓系屬的牧草、Bluestems、雀麥草、Browntopbent(Agrostiscapillaries)、Buffalograss、CanaryGrass、Carpetgrass、Centipedegrass、Chewings牛毛草(Festucarubracommutate)、Crabgrass、Creepingbent(Agrostisstolonifera)、紋飾銀須草(Koeleriamacrantha)、Dallisgrass、牛毛草、Festolium、Hard/sheeps牛毛草(Festucaovina)、格蘭馬草、假高粱草、石茅高粱、Lovegrass、mixes(Equine、Pasture等)、NativeGrasses、Orchardgrass、多年生ryegrass(Loliumperenne)、小糠草、雀麥屬草、一年生和多年生Ryegrass、瘦弱匍匐紅色牛毛草(Festucarubratrichophylla)、滑柄草坪草(Poapratensis)、St.Augustine、強壯匍匐紅色牛毛草(Festucarubrarubra)、雙色高粱、柳枝稷、Tall牛毛草(Festucaarundinacea)、梯牧草、叢生銀須草(Deschampsiacaespitosa)、Turfgrasses、芽草和Zoysiagrass。實施例26-蕓苔中的AAD-1(v3)26.1-蕓苔轉(zhuǎn)化以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化用賦予對2，4-滴抗性的AAD-1(v3)基因轉(zhuǎn)化歐洲油菜Nexera*710變種。構(gòu)建體含有CsVMV啟動子驅(qū)動的AAD-1(v3)基因和AtUbi10啟動子驅(qū)動的PAT基因。用10％商品漂白劑使種子表面滅菌10分鐘并用無菌蒸餾水洗滌3次。將種子置于半濃度MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MurashigeandSkoog，1962)上并按設(shè)置為25℃和16小時光照/8小時黑暗的光周期的生長制度下維持。從5-7天齡的苗上剪下下胚軸段(3-5mm)并置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含1mg/l玻璃酸酶和1mg/l2，4-滴的MS培養(yǎng)基)上3天作為預(yù)處理。接著將片段轉(zhuǎn)移進培養(yǎng)皿，用含有pDAB721的農(nóng)桿菌Z707S或LBA4404菌株處理。在28℃下黑暗中在150rpm的振蕩器上將農(nóng)桿菌培養(yǎng)過夜并接著重懸于培養(yǎng)基中。用農(nóng)桿菌處理下胚軸片段30分鐘后，將其放回愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基3天。共培養(yǎng)之后將片段置于K1D1TC(含有250mg/l羧芐青霉素和300mg/l特美汀的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基)恢復(fù)1周?；蛘?，直接將片段置于選擇培養(yǎng)基K1D1H1(帶有1mg/lHerbiace的以上培養(yǎng)基)。用于殺死農(nóng)桿菌的抗生素為羧芐青霉素和特美汀。選擇劑Herbiace允許轉(zhuǎn)化細胞生長。通過PCR測試來自35個獨立事件的愈傷組織樣品。全部35個樣品對AAD-1(v3)的存在測試為陽性，而未轉(zhuǎn)化對照為陰性(PCR測定)。通過ELISA(蛋白質(zhì)分析)證實10個樣品表達AAD-1蛋白。接著將形成愈傷組織的下胚軸片段置于B3Z1H1(MS培養(yǎng)基、3mg/l苯甲酸嘌呤、1mg/l玉米蛋白、0.5gm/lMES[2-(N-嗎啉代)乙磺酸]，5mg/l硝酸鹽、1mg/lHerbiace、羧芐青霉素和特美汀)嫩枝再生培養(yǎng)基。3周后嫩枝開始再生。將下胚軸片段與嫩枝一起轉(zhuǎn)移到B3Z1H3培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基、3mg/l苯甲酸嘌呤、1mg/l玉米蛋白、0.5gm/lMES[2-(N-嗎啉代)乙磺酸]、5mg/l硝酸鹽、3mg/lHerbiace、羧芐青霉素和特美汀)再過三周。從下胚軸片段上剪下嫩枝并轉(zhuǎn)移到嫩枝伸長培養(yǎng)基MESH10(MS培養(yǎng)基、0.5gm/lMES、10mg/lHerbiace、羧芐青霉素和特美汀)上2-4周。將伸長的嫩枝在MSI.1(含0.1mg/l吲哚基丁酸的MS)上進行根誘導(dǎo)。待植物具有良好建立的根系時將其移植到土壤中。轉(zhuǎn)移到溫室之前1-2周在Conviron中受控環(huán)境條件下使植物適應(yīng)。在溫室中使轉(zhuǎn)化的T0植物自花受粉以得到T1種子。用一系列的除草劑濃度噴灑T0植物和T1子代以建立通過AAD-1(v3)基因的保護水平。26.2-“分子分析”蕓苔材料和方法26.2.1-組織收獲的DNA的分離和定量將新鮮組織置于管中并在4℃低壓凍干兩天。組織完全干燥后，將鎢珠(Valenite)放進管中并使用Kelco玻珠研磨機將樣品干磨1分鐘。其后遵循標(biāo)準(zhǔn)DNeasyDNA分離方案(Qiagen，DNeasy69109)。將提取的DNA的等分試樣用PicoGreen(MolecularProbesP7589)染色并與已知標(biāo)準(zhǔn)品一起在熒光計(BioTek)中讀數(shù)，以得到以ng/μl計的濃度。26.2.2-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用總計100ng總DNA作為模板。使用20mM每種引物和TakaraExTaqPCR聚合酶試劑盒(MinisTAKRR001A)。用于AAD-1(v3)編碼區(qū)PCR的引物為(正向-ATGGCTCATGCTGCCCTCAGCC)(SEQIDNO27)和(反向-CGGGCAGGCCTAACTCCACCAA)(SEQIDNO28)。在9700Geneamp熱循環(huán)儀(AppliedBiosystems)中進行PCR反應(yīng)將樣品置于94℃3分鐘，94℃30秒、65℃30秒、72℃2分鐘的35個循環(huán)和其后72℃的10分鐘。通過用溴化乙啶染色的1％瓊脂糖凝膠上的電泳分析PCR產(chǎn)物。來自35株含AAD-1(v3)事件的35個樣品測試為陽性。三個對照樣品測試為陰性。26.3-ELIS使用以上章節(jié)描述的ELISA檢測10個不同蕓苔轉(zhuǎn)化事件中的AAD-1蛋白。表達水平從可溶性蛋白總量(TSP)的150到1000ppm。平行測試的三個不同的未轉(zhuǎn)化愈傷組織樣品幾乎未檢測到信號，表明該測定中使用的抗體與蕓苔細胞基質(zhì)具有最小的交叉反應(yīng)性。結(jié)果的概括于表38。參考文獻Adang，M.J.，M.J.Staver，T.A.Rocheleau，J.Leighton，R.F.Barker和D.V.Thompson.1985.Characterizedfull-lengthandtruncatedplasmidclonesofthecrystalproteinofBacillusthuringiensissubspkurstakiHD-73andtheirtoxicitytoManducasexta.Gene36289-300.AgrilianceCropProtectionGuide.2003.Agriliance，LLC.StPaul，MN.588p.Altschul，S.F.，W.Gish，W.Miller，E.W.Myers和D.J.Lipman.1990.BasicIocalalignmentsearchtool.J.Mol.Biol.215403-410.Altschul，S.F.，T.L.Madden，A.A.Schaffer，J.Zhang，Z，Zhang，W.Miller和D.J.Lipman.1997.GappedBLASTandPSIBLASTanewgenerationofproteindatabasesearchprograms.Nucl.AcidsRes.253389-3402.An，G.，B.D.Watson，S.Stachel，M.P.Gordon，E.W.Nester.1985.Newcloningvehiclesfortransformationofhigherplants.EMBOJ.4277-284.ArmstrongC.L.，C.E.Green，R.L.Phillips.1991.DevelopmentandavailabilityofgermplasmwithhighTypeIIcultureformationresponse.MaizeGenetCoopNewsLett6592-93.Beltz，G.A.，K.A.Jacobs，T.H.Eickbush，P.T.Cherbas和F.C.Kafatos.1983MethodsofEnzymology，R.Wu，L.GrossmanandK.Moldave[eds.]AcademicPress，NewYork100266-285BirchR.G.和T.Franks.1991.Developmentandoptimizationofmicroprojectilesystemsforplantgenetictransformation.Aust.J.PlantPhysiol.18453-469.CDMS.CropDataManagementSystemsLabelsandMSDS.在線?；ヂ?lián)網(wǎng)。2004年3月13日。在net/manuf/manuf.asp提供。CheeP.P.，K.A.Fober，J.L.Slightom.1989.Transformationofsoybean(Glycinemax)byinfectinggerminatingseedswithAgrobacteriumtumefaciens.PlantPhysiol.911212-1218.ChengM.，J.E.Fry，S.Pang，H.Zhou，CM.Hironaka，D.R.Duncan，T.W.Conner和Y.Wan.1997.GenetictransformationofwheatmediatedbyAgrobacteriumtumefaciens.PlantPhysiol115971-980.ChuC.C.，C.C.Wang，C.S.Sun，C.Hsu，K.C.Yin，C.Y.Chu，F(xiàn).Y.Bi.1975.Establishmentofanefficientmediumforanthercultureofricethroughcomparativeexperimentsonthenitrogensources.Sci.Sinica18659-668.ClementeT.E.，B.J.LaVallee，A.R.Howe，D.Conner-Ward，R.J.Rozman，P.E.Hunter，D.L.Broyles，D.S.Kasten，M.A.Hinchee.2000.ProgenyanalysisofglyphosateselectedtransgenicsoybeansderivedfromAgrobacterium-mediatedtransformation.CropSci40797-803.CPRCropProtectionReference.2003ChemicalandPharmaceuticalPress，NewYork，NY.2429p.Devine，M.D.2005.Whyaretherenotmoreherbicide-tolerantcrops？PestManag.Sci.61312-317.Dietrich，GabrieleElfriede(1998)hnidazolinoneresistantAHASmutants.U.S.Patent5,731,180.DidierjeanL，L.Gondet，R.Perkins，S.M.Lau，H.Schaller，D.P.O′Keefe，D.Werck-Reichhart.2002.EngineeringHerbicideMetabolisminTobaccoandArabidopsiswithCYP76B1，aCytochromeP450EnzymefromJerusalemArtichoke.PlantPhysiol2002，130179-189.Ditta，G.S.Stranfield，D.Corbin和D.R.Helinski.1980.BroadhostrangeDNAcloningsystemforGram-negativebacteriaConstructionofagenebankofRhizobiumleliloti.PNAS777347-7351.Edwards，R.A.，L.H.Keller和D.M.Schifferli.1998.Improvedallelicexchangevectorsandtheirusetoanalyze987Pfimbriageneexpression.Gene207149-157.FalcoS.C.，T.Guida，M.Locke，J.Mauvais，C.Sanders，R.T.Ward，P.Webber.1995.Transgeniccanolaandsoybeanseedswithincreasedlysine.Bio/Technology13577-582.FinerJ.andM.McMullen.1991.Transformationofsoybeanviaparticlebombardmentofembryogenicsuspensionculturetissue，hiVitroCell.Dev.Biol.27P175-182.Fraley，R.T.，D.G.Rogers和R.B.Horsch.1986.Genetictransformationinhigherplants.Crit.Rev.PlantSci.41-46.FrameB.R.，P.R.Drayton，S.V.Bagnall，C.J.Lewnau，W.P.Bullock，H.M.Wilson，J.M.Dunwell，J.A.Thompson和K.Wang.1994.Productionoffertilemaizeplantsbysiliconcarbidewhisker-mediatedtransformation.PlantJ.6941-948.Fukumori，F(xiàn).和R.P.Hausinger.1993.Purificationandcharacterizationof2，4-滴ichlorophenoxyacetate/a-ketoglutaratedioxygenase.J.Biol.Chem.26824311-24317.Gamborg，O.L.，R.A.Miller和K.Ojima.1968.Nutirentrequirementsofsuspensionsofculturesofsoybeanrootcells.Exp.CellRes.50151-158.Gay，P.，D.LeCoq，M.Steinmetz，E.Ferrari和J.A.Hoch.1983.CloningstructuralgenesacB，whichcodesforexoenzymelevansucraseofBacillussubtilisexpressionofthegeneinEschericiacoli.J.Bacteriol.1531424-1431.Gianessi，L.R.2005Economicandherbicideuseimpactsofglyphosate-resistantcrops.Pest.Manag.Sci.61241-245.Heap，I.TheInternationalSurveyofHerbicideResistantWeeds.在線?；ヂ?lián)網(wǎng)。2005年3月18日。在weedscience.com提供HieiY.，T.Komari和T.Kubo.1997.TranformationofricemediatedbyAgrobacteriumtumefaciens，PlantMol.Biol.35205-218.Hiei，Y.，T.Komari(1997)MethodforTransformingMonocotyledons.U.S.專利5,591,616.HincheeM.A.W.，D.V.Conner-Ward，C.A.Newell，R.E.McDonnell，S.J.Sato，C.S.Gasser，D.A.Fischkoff，D.B.Re，R.T.Fraley，R.B.Horsch.1988.ProductionoftransgenicsoybeanplantsusingAgrobacterium-mediatedDNAtransfer.Bio/Technology6915-922.Hofte，H.andH.R.Whiteley.1989.InsecticidalcristalproteinsofBacillusthuringiensis.1989.Microbiol.Rev.53242-255.Hoekema，A.1985TheBinaryPlantVectorSystem，Offset-durkkerijKantersB.V.，Alblasserdam，第5章。Hogan，D.A.；S.R.Smith，E.A.Saari，J.McCracken，RP.Hausinger.2000.Site-directedmutagenesisof2，4-滴ichlorophenoxyaceticacid/a-ketoglutaratedioxygenase.Identificationofresiduesinvolvedinmetallocenterformationandsubstratebinding.J.Biol.Chem.27512400-12409.Holsters，M.，D.DeWaele，A.Depicker，E.Messens，M.VanMontagu和J.Sckell.1978.TransfectionandtransformationofAgrobacteriumtumefaciens.MolGen.Genet.163181-187.Horsch，R.，J.Fry，N.Hoffman，J.Neidermeyer，S.Rogers和R.Fraley.1988.PlantMolecularBiologyManual，S.Gelvin等編輯，KluwerAcademicPublishers.BostonHorvath，M.，G.Ditzehniiller，M.Lodl和F.Streichsbier.1990.Isolationandcharacterizationofa2-(2，4-滴ichlorophenoxy)propionicacid-degradingsoilbacterium.Appl.MicrobiolBiotechnol.33213-216.Jefferson，R.A.M.Bevan和T.Kavanagh.1987.TheuseofEscherichiacoliB-glucuronidasegeneasagenefustionmarkerforstudiesofgeneexpressioninhigherplants.Biochem.Soc.Trans.1517-19.Karlin，S.和S.F.Altschul.1990.Methodsforassessingthestatisticalsignificanceofmolecularsequencefeaturesbyusinggeneralscoringschemes.PNAS872264-2268.Karlin，S.和S.F.Altschul.1993.Applicationsandstatisticsformultiplehigh-scoringsegmentsinmolecularsequences.PNAS905873-5877Keller，G.H.和M.M.Manak.1987.DNAProbes.StocktonPress，NewYork，NY，169-170頁.Kohler，H.P.E.1999.SphingobiumherbicidovoransMHaversatilephenoxyalkanoicacidherbicidedegrader.J.IndMicrobiolandBiotech.23336-340.LiL，QuR，KochkoAde，F(xiàn)auquetCM，BeachyRN(1993)Animprovedricetransformationsystemusingthebiolisticmethod.PlantCellRep12250-255Linsmaier，E.M.和F.Skoog(1965)Organicgrowthfactorrequirementsoftobaccotissuecultures.Physiol.Plant.18100-127.Lorraine-Colwill，D.F.，S.B.Powles，T.R.Hoawkes，P.H.Hollingshead，S.AJ.Arner和C.Preston.2003.InvestigationsintothemechanismofglyphosateresistanceinLoliumrigidum.Pestic.Biochem.Physiol.7462-73.Luo，H.，Q.Hu，K.Nelson，C.Longo，A.P.Kausch，J.M.Chandlee，J.K.WipffandC.R.Fricker.2004.Agrobacteriumtumefaciens-mediatodcreepingbentgrass(AgrostisstoloniferaL.)transformationusingphosphinothricinselectionresultsinahighfrequencyofsingle-copytransgeneintegration.PlantCellReports22645-652.Lyon，B.R.，D.J.Llewellyn，J.L.Huppatz，E.S.Dennis和W.J.Peacock.1989.Expressionofabacterialgeneintransgenictobaccoconfersresistancetotheherbicide2，4-滴ichlorophenoxyaceticacid.PlantMol.Bio.13533-540.Lyon，B.R.，Y.L.Cousins，D.J.Llewellyn和E.S.Dennis.1993.Cottonplantstransformedwithabacterialdegradationgeneareprotectedfromaccidentalspraydriftdamagebytheherbicide2，4-滴ichlorophenoxyaceticacid.TransgenicRes.2166-169.Maniatis，T.，E.F.Fritsch，J.Sambrook.1982.MolecularCloningALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NYMartin，J.R.和W.W.Witt.2002.Responseofglyphosatetolerantandsusceptiblebiotypesofhorseweed(Conyzacanadensis)tofoliarappliedherbicides.Proc.NorthCent.WeedSci.Soc.57185.MartinellB.J.，L.S.Julson，C.A.Emler，H.Yong，D.E.McCabe，E.J.Williams.2002.SoybeanAgrobacteriumtransformationmethod.U.S.PatentApplicationNo.6384301McCabeD.E.，W.F.Swain，B.J.Martinell，P.Christou.1988.Stabletransformationofsoybean(Glycinemax)byparticleacceleration.Bio/Technology6923-926.MillerS.D.，P.W.Stahlman，P.Westra，G.W.Wicks，R.G.Wilson，J.M.Tichota.2003.Risksofweedspectrumshiftsandherbicideresistanceinglyphosate-resistantcroppingsystems.Proc.West.Soc.WeedSci.5661-62.MullerR，S.Jorks，S.Kleinsteuber，W.Babel.1999.ComamonasacidovoransstrainMCIanewisolatecapableofdegradingthechiralherbicidesdichlorpropandmecopropandtheherbicides2，4-滴andMCPA.Microbiol.Res.154241-246.MurashigeT.和F.Skoog.1962.Arevisedmediumforrapidgrowthandbioassayswithtobaccotissuecultures.Physiol.Plant.15473-497.MurphyG.P.，T.E.Dutt，R.F.Montgomery，T.S.Willard，G.A.Elmore.2002.Controlofhorseweedwithglyphosate.Proc.NorthCent.WeedSci.Soc.57194.Ng，C.H.，R.Wickneswari，S.Salmigah，Y.T.Teng和B.S.Ismail.2003.Genepolymorphismsinglyphosate-resistantand-susceptiblebiotypesofEleusineindicafromMalaysia.WeedRes.43108-115.OlkonP.M.和D.A.Somers.2001.L-CysteineincreasesAgrobacterium-mediatedT-DNAdeliveryintosoybeancotyledonary-nodecells.PlantCellRep20706-711Olhoft，P.M.，L.E.Flagel，CM.Donovan和D.A.Somers.2003.EfficientsoybeantransformationusinghygromycinBselectioninthecotyledonary-nodemethod.Planta216723-735PadgetteS.R.，K.H.Kolacz，X.Delannay，D.B.Re，B.J.LaVallee，C.N.Tinius，W.K.Rhodes，Y.I.Otero，G.F.Barry，D.A.Eichholtz，V.M.Peschke，D.L.Nida，N.B.Taylor和G.M.Kishore.1995.Development，identification和characterizationofaglyphosate-tolerantsoybeanline.CropSci.1995；351451-1461.ParrottW.A.，J.N.All，M.J.Adang，M.A.Bailey，H.R.Boerma和C.N.Stewart，Jr.1994.RecoveryandevaluationofsoybeanplantstransgenicforaBacillusthuringiensisvar.kurstakiinsecticidalgene.InVitroCell.Dev.Biol.30P144-149.Popelka，J.C.和F.Altpeter2003.Agrobacteriumtumefaciens-mediatedgenetictransformationofrye(SecalecerealeL)Mol.Breed11203-211Saari，R.E.，D.A.Hogan和R.P.Hausinger.1999.Stereospecificdegradationofthepheonxypropionateherbicidedichlorprop.J.Mol.Catal.BEnz.6421-428.Saiki，R.K.，S.Scharf，F(xiàn).Faloona，KB.Mullis，G.T.Horn，H.A.Erlich和N.Arnheim.1985.EnzymaticAmplificationofp-GlobinGenomicSequencesandRestrictionSiteAnalysisforDiagnosisofSickleCellAnemia.Science2301350-1354.Sambrook，J.，E.F.Fritsch和T.Maniatis.1989.MolecularCloning，ALaboratoryManual，ColdSpringHarborPress.Sambrook，J.和D.W.Russell.2000.MolecularCloning.ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY.Schenk，R.U.和A.C.Hildebrandt(1972)Methodsandtechniquesforinductionandgrowthofmonocotyledenousanddicotyledenousplantcellcultures.Can.J.Bot.50199-204.Sfiligoj，E.2004.Spreadingresistance.CropLife.Marchissue.Simarmata，M.，J.E.Kaufmann和D.Penner.2003.PotentialbasisofglyphosateresistanceinCaliforniarigidryegrass(Loliumrigidum).WeedSci.51678-682.SinghR.J.，T.M.Klein，C.J.Mauvais，S.Knowlton，T.Hymowitz，CM.Kostow.Cytologicalcharacterizationoftransgenicsoybean.Theor.Appl.Genet.1998；96319-324.Smejkal，C.W.，T.Vallaeys，S.K.Burton和H.M.Lappin-Scott.2001.Substratespecificityofchlorophenoxyalkanoicacid-degradingbacteriaisnotdependentuponphylogeneticallyrelatedtfdAgenetypes.Biol.Fertil.Sols33507-513.Streber，W.和L.Willmitzer.1989.Transgenictobaccoplantsexpressingabacterialdetoxifyingenzymeareresistantto2，4-滴.Bio/Technology7811-816.Streber，W.R.，K.N.Timmis和M.H.Zenk.2000.Microorganismsandplasmidsfor2，4-滴ichlorophenoxyaceticacid(2，4-滴)monooxygenaseformationandprocessfortheproductionoftheseplasmidsandstrains.US專利6,153,401.Streber，W.R.，K.N.Timmis和M.H.Zenk.1987.Analysis，cloning和high-levelexpressionof2，4-滴ichlorophenixyaceticmonooxygenasegenetfdAofAlcaligeneseutrophusJMP134.J.Bacterid.1692950-2955.Suggs，S.V.，T.Miyake，E.H.Kawashime，M.J.Johnson，K.Itakura和R.B.Wallace.1981.ICN-UCLASymp.Dev.Biol.UsingPurifiedGenes，D.D.Brown編輯，AcademicPress，NewYork，23683-693.Tingay，S.，D.McElroy，R.Kalla，S.Fieg，W.Mingbo，S.Thornton和R.Bretell.1997.Agrobacteriumtumefaciens-medi&tedbarleytransformation.Plant.1.111369-1376.Weigel，D.和J.Glazebrook.2002.ArabidopsisALaboratoryManual.ColdSpringHarborLabPress，ColdSpringHarbor，N.Y.，358頁.Weising，K.，J.Schell和G.Kahl.1988.Foreigngenesinplantstransfer，structure，expressionandapplications.Ann.Rev.Genet.22421-477.Welter，M.E.，D.S.Clayton，M.A.miler和J.F.Petolino.1995.Morphotypesoffriableembryogenicmaizecallus.PlantCellRep.14725-729.WestendorfA.，D.Benndorf，R.Muller，W.Babel.2002.Thetwoenantiospecificdichlorprop/a-ketoglutarate-dioxygenasesfromDelftiaacidovoransMCI-proteinandsequencedataofRdpAandSdpA.Microbiol.Res.157317-22.Westendorf.A.，R.H.Muller和W.Babel.2003.PurificationandcharacterizationoftheenantiospecificdioxygenasesfromDelftiaacidovoransMCIinitiatingthedegradationofphenoxypropionatesandphenoxyacetateherbicides.ActaBiotechnol.233-17.WSSA.2002.HerbicideHandbook(8thed).WeedScienceSocietyofAmerica.Lawrence，KS492頁.ZengP，D.Vadnais，Z.Zhang和J.Polacco.2004.RefinedglufosinateselectioninAgrobacterium-mediatedtransformationofsoybean[Glycinemax(L.)Merr.].PlantCellRep.22478-482.ZhangS(1995)Efficientplantregenerationfromindica(group1)riceprotoplastsofoneadvancedbreedinglineandthreevarieties.PlantCellRep1568-71ZhangS，ChenL，QuR，MarmeyP，BeachyRN，F(xiàn)auquetCM(1996)Efficientplantregenerationfromindica(group1)riceprotoplastsofoneadvancedbreedinglineandthreevarieties.PlantCellRep15465-469.ZhangS，SongW，ChenL，RuanD，TaylorN，RonaldP，BeachyRN，F(xiàn)auquetCM(1998)TransgeniceliteIndicaricevarieties，resistanttoXanthomonasoryzaepv.oryzae.MolBreed4551-558.Zhang，Z.，A.Xing，P.E.Staswick和T.E.Clemente.1999.TheuseofglufosinateasaselectiveagentinAgrobacterium-mediatedtransformationofsoybean.PlantCell，Tissue和OrganCulture5637-46.Zhao，Z.Y.，T.Cai，L.Tagliani，M.Miller，N.Wang，H.Pang，M.Rudert，S.Schroeder，D.Hondred，J.Seltzer和D.Pierce.2000.Agrobacterium-mediatedsorghumtransformation，PlantMol.Biol.44789-798.Zipper，C，M.Bunk，A.Zehnder，H.Kohler.1998.Enantioselectiveuptakeanddegradationofthechiralherbicidedichlorprop[(RS)-2-(2，4-滴ichlorophenoxy)propanoicacid]bySphingobiumherbicidovoransMH.J.Ract.133368-3374序列表<110>美國陶氏益農(nóng)公司<120>新除草劑抗性基因<130>DAS-115XC1<150>US60/567,052<151>2004-04-30<160>32<170>PatentIn版本3.2<210>1<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于擴增rdpA/AAD-1(v1)基因的正向引物<400>1tctagaaggagatataccatgcatgctgcactgtcccccctctcccagcg50<210>2<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于擴增rdpA/AAD-1(v1)基因的反向引物<400>2ctcgagttactagcgcgccgggcgcacgccaccgaccg38<210>3<211>915<212>DNA<213>Sphingobiumherbicidovorans<220><221>misc_feature<222>(1)..(18)<223>引物接頭<220><221>misc_feature<222>(907)..(915)<223>引物接頭<400>3tctagaaggagatataccatgcatgctgcactgtcccccctctcccagcgctttgagcgc60atcgcggtccagccgctgaccggcgtcctgggcgccgagatcaccggcgtcgacctgcgc120gagccgctcgacgacagcacctggaacgaaatcctcgacgcgttccacacttaccaggtc180atctattttcccggccaggcgatcaccaacgaacagcacatcgccttcagccggcgcttc240ggccccgtcgatcccgtgcccctgctcaagagcatcgaagggtatccagaggtgcagatg300atccgccgcgaagccaacgaaagcgggcgtgtgatcggtgaygactggcacaccgacagc360accttcctggacgcaccgccggccgccgtggtgatgcgcgcgatcgacgtgcccgagcat420ggcggcgacaccggttttctgagcatgtacaccgcgtgggagacgctgtcgcccaccatg480caggccaccatcgaagggttgaacgtagtgcacagcgccacgcgtgtgttcggctcgctc540taccaggcccagaaccggcgcttcagcaacaccagcgtcaaggtgatggacgtcgacgcg600ggcgaccgtgaaaccgtgcaccccctggtggtgacccatccgggcagcggccgcaagggc660ctgtacgtgaaccaggtctattgccagcgcatcgagggcatgaccgatgccgaaagcaaa720ccgctgctgcagttcctgtacgagcatgcgacacggttcgatttcacctgccgcgtgcgc780tggaagaaggaccaggtcctggtctgggacaacctgtgcacgatgcaccgggccgtaccc840gactacgcgggcaagttccgctacctgacgcgcaccacggtcggtggcgtgcgcccggcg900cgctagtaactcgag915<210>4<211>897<212>DNA<213>人工序列<220><223>AAD-1(v2)引物序列<220><221>misc_feature<222>(1)..(2)<223>引物接頭<220><221>misc_feature<222>(891)..(897)<223>引物接頭<400>4ccatggctgctgcactgtcccccctctcccagcgctttgagcgcatcgcggtccagccgc60tgaccggcgtcctgggcgccgagatcaccggcgtcgacctgcgcgagccgctcgacgaca120gcacctggaacgaaatcctcgacgcgttccacacttaccaggtcatctattttcccggcc180aggcgatcaccaacgaacagcacatcgccttcagccggcgcttcggccccgtcgatcccg240tgcccctgctcaagagcatcgaagggtatccagaggtgcagatgatccgccgcgaagcca300acgaaagcgggcgtgtgatcggtgatgactggcacaccgacagcaccttcctggacgcac360cgccggccgccgtggtgatgcgcgcgatcgacgtgcccgagcatggcggcgacaccggtt420ttctgagcatgtacaccgcgtgggagacgctgtcgcccaccatgcaggccaccatcgaag480ggttgaacgtagtgcacagcgccacgcgtgtgttcggctcgctctaccaggcccagaacc540ggcgcttcagcaacaccagcgtcaaggtgatggacgtcgacgcgggcgaccgtgaaaccg600tgcaccccctggtggtgacccatccgggcagcggctgcaagggcctgtacgtgaaccagg660tctattgccagcgcatcgagggcatgaccgatgccgaaagcaaaccgctgctgcagttcc720tgtacgagcatgcgacacggttcgatttcacctgccgcgtgcgctggaagaaggaccagg780tcctggtctgggacaacctgtgcacgatgcaccgggccgtacccgactacgcgggcaagt840tccgctacctgacgcgcaccacggtcggtggcgtgcgcccggcgcgctagtgagctc897<210>5<211>919<212>DNA<213>人工序列<220><223>AAD-1(v3)引物序列<220><221>misc_feature<222>(1)..(2)<223>引物接頭<220><221>misc_feature<222>(6)..(8)<223>附加的丙氨酸密碼子(GCT)<220><221>misc_feature<222>(894)..(919)<223>引物接頭<400>5ccatggctcatgctgccctcagccctctctcccaacgctttgagagaatagctgtccagc60cactcactggtgtccttggtgctgagatcactggagtggacttgagggaaccacttgatg120acagcacctggaatgagatattggatgccttccacacttaccaagtcatctactttcctg180gccaagcaatcaccaatgagcagcacattgcattctcaagaaggtttggaccagttgatc240cagtgcctcttctcaagagcattgaaggctatccagaggttcagatgatccgcagagaag300ccaatgagtctggaagggtgattggtgatgactggcacacagactccactttccttgatg360cacctccagctgctgttgtgatgagggccatagatgttcctgagcatggcggagacactg420ggttcctttcaatgtacacagcttgggagaccttgtctccaaccatgcaagccaccatcg480aagggctcaacgttgtgcactctgccacacgtgtgttcggttccctctaccaagcacaga540accgtcgcttcagcaacacctcagtcaaggtgatggatgttgatgctggtgacagagaga600cagtccatcccttggttgtgactcatcctggctctggaaggaaaggcctttatgtgaatc660aagtctactgtcagagaattgagggcatgacagatgcagaatcaaagccattgcttcagt720tcctctatgagcatgccaccagatttgacttcacttgccgtgtgaggtggaagaaagacc780aagtccttgtctgggacaacttgtgcaccatgcaccgtgctgttcctgactatgctggca840agttcagatacttgactcgcaccacagttggtggagttaggcctgcccgctgagtagtta900gcttaatcacctagagctc919<210>6<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>rdpA(ncoI)5’引物<400>6cccatggctgctgcactgtcccccctctcc30<210>7<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>3’saci引物<400>7gagctcactagcgcgccgggcgcacgccaccga33<210>8<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>BstEII/DelNotI5’引物<400>8tggtggtgacccatccgggcagcggctgcaagggcc36<210>9<211>295<212>PRT<213>Sphingobiumherbicidovorans<400>9MetHisAlaAlaLeuSerProLeuSerGlnArgPheGluArgIleAla151015ValGlnProLeuThrGlyValLeuGlyAlaGluIleThrGlyValAsp202530LeuArgGluProLeuAspAspSerThrTrpAsnGluIleLeuAspAla354045PheHisThrTyrGlnValIleTyrPheProGlyGlnAlaIleThrAsn505560GluGlnHisIleAlaPheSerArgArgPheGlyProValAspProVal65707580ProLeuLeuLysSerIleGluGlyTyrProGluValGlnMetIleArg859095ArgGluAlaAsnGluSerGlyArgValIleGlyAspAspTrpHisThr100105110AspSerThrPheLeuAspAlaProProAlaAlaValValMetArgAla115120125IleAspValProGluHisGlyGlyAspThrGlyPheLeuSerMetTyr130135140ThrAlaTrpGluThrLeuSerProThrMetGlnAlaThrIleGluGly145150155160LeuAsnValValHisSerAlaThrArgValPheGlySerLeuTyrGln165170175AlaGlnAsnArgArgPheSerAsnThrSerValLysValMetAspVal180185190AspAlaGlyAspArgGluThrValHisProLeuValValThrHisPro195200205GlySerGlyArgLysGlyLeuTyrValAsnGlnValTyrCysGlnArg210215220IleGluGlyMetThrAspAlaGluSerLysProLeuLeuGlnPheLeu225230235240TyrGluHisAlaThrArgPheAspPheThrCysArgValArgTrpLys245250255LysAspGlnValLeuValTrpAspAsnLeuCysThrMetHisArgAla260265270ValProAspTyrAlaGlyLysPheArgTyrLeuThrArgThrThrVal275280285GlyGlyValArgProAlaArg290295<210>10<211>295<212>PRT<213>人工序列<220><223>AAD-1v2翻譯<220><221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>與v1不同<220><221>MISC_FEATURE<222>(212)..(212)<223>與v1不同<400>10MetAlaAlaAlaLeuSerProLeuSerGlnArgPheGluArgIleAla151015ValGlnProLeuThrGlyValLeuGlyAlaGluIleThrGlyValAsp202530LeuArgGluProLeuAspAspSerThrTrpAsnGluIleLeuAspAla354045PheHisThrTyrGlnValIleTyrPheProGlyGlnAlaIleThrAsn505560GluGlnHisIleAlaPheSerArgArgPheGlyProValAspProVal65707580ProLeuLeuLysSerIleGluGlyTyrProGluValGlnMetIleArg859095ArgGluAlaAsnGluSerGlyArgValIleGlyAspAspTrpHisThr100105110AspSerThrPheLeuAspAlaProProAlaAlaValValMetArgAla115120125IleAspValProGluHisGlyGlyAspThrGlyPheLeuSerMetTyr130135140ThrAlaTrpGluThrLeuSerProThrMetGlnAlaThrIleGluGly145150155160LeuAsnValValHisSerAlaThrArgValPheGlySerLeuTyrGln165170175AlaGlnAsnArgArgPheSerAsnThrSerValLysValMetAspVal180185190AspAlaGlyAspArgGluThrValHisProLeuValValThrHisPro195200205GlySerGlyCysLysGlyLeuTyrValAsnGlnValTyrCysGlnArg210215220IleGluGlyMetThrAspAlaGluSerLysProLeuLeuGlnPheLeu225230235240TyrGluHisAlaThrArgPheAspPheThrCysArgValArgTrpLys245250255LysAspGlnValLeuValTrpAspAsnLeuCysThrMetHisArgAla260265270ValProAspTyrAlaGlyLysPheArgTyrLeuThrArgThrThrVal275280285GlyGlyValArgProAlaArg290295<210>11<211>296<212>PRT<213>人工序列<220><223>AAD-1v3翻譯<220><221>MISC_FEATURE<222>(2)..(3)<223>與v1不同<400>11MetAlaHisAlaAlaLeuSerProLeuSerGlnArgPheGluArgIle151015AlaValGlnProLeuThrGlyValLeuGlyAlaGluIleThrGlyVal202530AspLeuArgGluProLeuAspAspSerThrTrpAsnGluIleLeuAsp354045AlaPheHisThrTyrGlnValIleTyrPheProGlyGlnAlaIleThr505560AsnGluGlnHisIleAlaPheSerArgArgPheGlyProValAspPro65707580ValProLeuLeuLysSerIleGluGlyTyrProGluValGlnMetIle859095ArgArgGluAlaAsnGluSerGlyArgValIleGlyAspAspTrpHis100105110ThrAspSerThrPheLeuAspAlaProProAlaAlaValValMetArg115120125AlaIleAspValProGluHisGlyGlyAspThrGlyPheLeuSerMet130135140TyrThrAlaTrpGluThrLeuSerProThrMetGlnAlaThrIleGlu145150155160GlyLeuAsnValValHisSerAlaThrArgValPheGlySerLeuTyr165170175GlnAlaGlnAsnArgArgPheSerAsnThrSerValLysValMetAsp180185190ValAspAlaGlyAspArgGluThrValHisProLeuValValThrHis195200205ProGlySerGlyArgLysGlyLeuTyrValAsnGlnValTyrCysGln210215220ArgIleGluGlyMetThrAspAlaGluSerLysProLeuLeuGlnPhe225230235240LeuTyrGluHisAlaThrArgPheAspPheThrCysArgValArgTrp245250255LysLysAspGlnValLeuValTrpAspAsnLeuCysThrMetHisArg260265270AlaValProAspTyrAlaGlyLysPheArgTyrLeuThrArgThrThr275280285ValGlyGlyValArgProAlaArg290295<210>12<211>888<212>DNA<213>大豆慢生根瘤菌USDA110<400>12atgacgatcgccatccggcagcttcagacgcattttgtcggccaggtttccggcctcgat60ttgcgaaagccgctcacgccgggcgaggcccgcgaggtcgagtccgccatggacaaatac120gcggtgctcgttttccacgaccaggacatcaccgacgagcagcagatggctttcgcgctg180aacttcggccagcgcgaggacgcgcgcggcggcacggtcaccaaggagaaggactaccgg240ctgcaatccggcctgaacgacgtctccaatctcggcaaggacggcaagccgctggccaag300gacagccgcacgcacctgttcaatctcggcaactgcctctggcactccgacagctcgttc360cgtcccattcccgcaaaattctcgctgctgtcggcgcgcgtggtgaacccgacgggcggc420aacaccgaattcgcggacatgcgcgccgcctatgacgcgctcgacgacgagaccaaggcc480gaaatcgaggacctcgtctgcgagcactcgctgatgtattcgcgcggctcgctcggcttc540accgagtacaccgacgaagagaagcagatgttcaagccggtcctgcaacgcctcgtgcgc600acccatccggtccaccgccgcaagtcgctgtatctctcgtcgcatgccggcaagatcgcc660agcatgagcgtgccggaggggcggctgctgttgcgcgatctcaacgagcacgcgacgcag720ccggaattcgtctacgtccacaaatggaagctgcatgacctcgtgatgtgggacaaccgc780cagaccatgcaccgcgtccgccgctacgaccagtcccagccccgcgacatgcgccgcgcg840acggtggcggggacggagccgacggtgcagcagcaggcggcggagtag888<210>13<211>289<212>PRT<213>大豆慢生根瘤菌USDA110<400>13MetThrIleAlaIleArgGlnLeuGlnThrHisPheValGlyGlnVal151015SerGlyLeuAspLeuArgLysProLeuThrProGlyGluAlaArgGlu202530ValGluSerAlaMetAspLysTyrAlaValLeuValPheHisAspGln354045AspIleThrAspGluGlnGlnMetAlaPheAlaLeuAsnPheGlyGln505560ArgGluAspAlaArgGlyGlyThrValThrLysGluLysAspTyrArg65707580LeuGlnSerGlyLeuAsnAspValSerAsnLeuGlyLysAspGlyLys859095ProLeuAlaLysAspSerArgThrHisLeuPheAsnLeuGlyAsnCys100105110LeuTrpHisSerAspSerSerPheArgProIleProAlaLysPheSer115120125LeuLeuSerAlaArgValValAsnProThrGlyGlyAsnThrGluPhe130135140AlaAspMetArgAlaAlaTyrAspAlaLeuAspAspGluThrLysAla145150155160GluIleGluAspLeuValCysGluHisSerLeuMetTyrSerArgGly165170175SerLeuGlyPheThrGluTyrThrAspGluGluLysGlnMetPheLys180185190ProValLeuGlnArgLeuValArgThrHisProValHisArgArgLys195200205SerLeuTyrLeuSerSerHisAlaGlyLysIleAlaSerMetSerVal210215220ProGluGlyArgLeuLeuLeuArgAspLeuAsnGluHisAlaThrGln225230235240ProGluPheValTyrValHisLysTrpLysLeuHisAspLeuValMet245250255TrpAspAsnArgGlnThrMetHisArgValArgArgTyrAspGlnSer260265270GlnProArgAspMetArgArgAlaThrValAlaGlyThrGluProThr275280285Val<210>14<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>brjap5’(speI)<400>14actagtaacaaagaaggagatataccatgacgat34<2l0>15<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>brjap3’(xhoI)<400>15ttctcgagctatcactccgccgcctgctgctgc33<210>16<2ll>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>M13forward引物<400>16gtaaaacgacggccagt17<210>17<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>M13reverse引物<400>17caggaaacagctatgac17<210>18<21l>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>NcoIofBrady<400>18tataccacatgtcgatcgccatccggcagctt32<210>19<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>SacIofBrady<400>19gagctcctatcactccgccgcctgctgctgcac33<210>20<211>525<212>PRT<213>大豆<400>20MetAlaGlnValSerArgValHisAsnLeuAlaGlnSerThrGlnIle151015PheGlyHisSerSerAsnSerAsnLysLeuLysSerValAsnSerVal202530SerLeuArgProArgLeuTrpGlyAlaSerLysSerArgIleProMet354045HisLysAsnGlySerPheMetGlyAsnPheAsnValGlyLysGlyAsn505560SerGlyValPheLysValSerAlaSerValAlaAlaAlaGluLysPro65707580SerThrSerProGluIleValLeuGluProIleLysAspPheSerGly859095ThrIleThrLeuProGlySerLysSerLeuSerAsnArgIleLeuLeu100105110LeuAlaAlaLeuSerGluGlyThrThrValValAspAsnLeuLeuTyr115120125SerGluAspIleHisTyrMetLeuGlyAlaLeuArgThrLeuGlyLeu130135140ArgValGluAspAspLysThrThrLysGlnAlaIleValGluGlyCys145150155160GlyGlyLeuPheProThrSerLysGluSerLysAspGluIleAsnLeu165170175PheLeuGlyAsnAlaGlyThrAlaMetArgProLeuThrAlaAlaVal180185190ValAlaAlaGlyGlyAsnAlaSerTyrValLeuAspGlyValProArg195200205MetArgGluArgProIleGlyAspLeuValAlaGlyLeuLysGlnLeu210215220GlyAlaAspValAspCysPheLeuGlyThrAsnCysProProValArg225230235240ValAsnGlyLysGlyGlyLeuProGlyGlyLysValLysLeuSerGly245250255SerValSerSerGlnTyrLeuThrAlaLeuLeuMetAlaAlaProLeu260265270AlaLeuGlyAspValGluIleGluIleValAspLysLeuIleSerVal275280285ProTyrValGluMetThrLeuLysLeuMetGluArgPheGlyValSer290295300ValGluHisSerGlyAsnTrpAspArgPheLeuValHisGlyGlyGln305310315320LysTyrLysSerProGlyAsnAlaPheValGluGlyAspAlaSerSer325330335AlaSerTyrLeuLeuAlaGlyAlaAlaIleThrGlyGlyThrIleThr340345350ValAsnGlyCysGlyThrSerSerLeuGlnGlyAspValLysPheAla355360365GluValLeuGluLysMetGlyAlaLysValThrTrpSerGluAsnSer370375380ValThrValSerGlyProProArgAspPheSerGlyArgLysValLeu385390395400ArgGlyIleAspValAsnMetAsnLysMetProAspValAlaMetThr405410415LeuAlaValValAlaLeuPheAlaAsnGlyProThrAlaIleArgAsp420425430ValAlaSerTrpArgValLysGluThrGluArgMetIleAlaIleCys435440445ThrGluLeuArgLysLeuGlyAlaThrValGluGluGlyProAspTyr450455460CysValIleThrProProGluLysLeuAsnValThrAlaIleAspThr465470475480TyrAspAspHisArgMetAlaMetAlaPheSerLeuAlaAlaCysGly485490495AspValProValThrIleLysAspProGlyCysThrArgLysThrPhe500505510ProAspTyrPheGluValLeuGluArgLeuThrLysHis515520525<210>21<211>525<212>PRT<213>人工序列<220><223>雙突變大豆EPSPS蛋白蘇氨酸183轉(zhuǎn)變成異亮氨酸；脯氨酸187轉(zhuǎn)變成絲氨酸<400>21MetAlaGlnValSerArgValHisAsnLeuAlaGlnSerThrGlnIle151015PheGlyHisSerSerAsnSerAsnLysLeuLysSerValAsnSerVal202530SerLeuArgProArgLeuTrpGlyAlaSerLysSerArgIleProMet354045HisLysAsnGlySerPheMetGlyAsnPheAsnValGlyLysGlyAsn505560SerGlyValPheLysValSerAlaSerValAlaAlaAlaGluLysPro65707580SerThrSerProGluIleValLeuGluProIleLysAspPheSerGly859095ThrIleThrLeuProGlySerLysSerLeuSerAsnArgIleLeuLeu100105110LeuAlaAlaLeuSerGluGlyThrThrValValAspAsnLeuLeuTyr115120125SerGluAspIleHisTyrMetLeuGlyAlaLeuArgThrLeuGlyLeu130135140ArgValGluAspAspLysThrThrLysGlnAlaIleValGluGlyCys145150155160GlyGlyLeuPheProThrSerLysGluSerLysAspGluIleAsnLeu165170175PheLeuGlyAsnAlaGlyIleAlaMetArgSerLeuThrAlaAlaVal180185190ValAlaAlaGlyGlyAsnAlaSerTyrValLeuAspGlyValProArg195200205MetArgGluArgProIleGlyAspLeuValAlaGlyLeuLysGlnLeu210215220GlyAlaAspValAspCysPheLeuGlyThrAsnCysProProValArg225230235240ValAsnGlyLysGlyGlyLeuProGlyGlyLysValLysLeuSerGly245250255SerValSerSerGlnTyrLeuThrAlaLeuLeuMetAlaAlaProLeu260265270AlaLeuGlyAspValGluIleGluIleValAspLysLeuIleSerVal275280285ProTyrValGluMetThrLeuLysLeuMetGluArgPheGlyValSer290295300ValGluHisSerGlyAsnTrpAspArgPheLeuValHisGlyGlyGln305310315320LysTyrLysSerProGlyAsnAlaPheValGluGlyAspAlaSerSer325330335AlaSerTyrLeuLeuAlaGlyAlaAlaIleThrGlyGlyThrIleThr340345350ValAsnGlyCysGlyThrSerSerLeuGlnGlyAspValLysPheAla355360365GluValLeuGluLysMetGlyAlaLysValThrTrpSerGluAsnSer370375380ValThrValSerGlyProProArgAspPheSerGlyArgLysValLeu385390395400ArgGlyIleAspValAsnMetAsnLysMetProAspValAlaMetThr405410415LeuAlaValValAlaLeuPheAlaAsnGlyProThrAlaIleArgAsp420425430ValAlaSerTrpArgValLysGluThrGluArgMetIleAlaIleCys435440445ThrGluLeuArgLysLeuGlyAlaThrValGluGluGlyProAspTyr450455460CysValIleThrProProGluLysLeuAsnValThrAlaIleAspThr465470475480TyrAspAspHisArgMetAlaMetAlaPheSerLeuAlaAlaCysGly485490495AspValProValThrIleLysAspProGlyCysThrArgLysThrPhe500505510ProAspTyrPheGluValLeuGluArgLeuThrLysHis515520525<210>22<211>1604<212>DNA<213>人工序列<220><223>編碼公開于SEQIDN021的具有附加序列的雙突變EPSPS的大豆偏愛DNA序列<220><221>misc_feature<222>(1)..(1575)<223>編碼SEQIDN021的雙突變EPSPS的大豆偏愛DNA序列的編碼序列<220><22l>misc_feature<222>(1576)..(1578)<223>翻譯終止子tga<220><22l>misc_feature<222>(1579)..(1604)<223>包括來用于在所有6個開放閱讀框引入翻譯終止密碼子并引入用于克隆的SacI限制酶識別位點的序列<400>22atggctcaagtctcccgtgttcacaatcttgctcagtcaacccaaatctttggacattca60agcaactcaaacaaactgaagtctgtgaattctgtctcacttcgcccacgcctttgggga120gcatccaagagtcgcataccaatgcacaagaatgggagtttcatgggcaacttcaatgtt180gggaaaggcaattctggtgtcttcaaagtttcagcttctgttgcagccgcagagaaaccc240agcacttcccctgagattgttcttgaacccattaaggacttcagtggaacaatcactctg300cctggatcaaagagtctttcaaacagaatacttctcttggcagctctgagtgaaggaacc360actgtagttgacaaccttttgtactctgaagatattcattacatgttgggtgctctcaga420actcttgggttgagagttgaagatgacaagaccacaaaacaagccatagttgaaggatgt480ggtgggttgtttccaacaagcaaagaatccaaagatgagatcaacttgtttcttggcaat540gctggaattgcaatgagaagcctcactgctgcagtagttgcagctggtgggaatgcaagt600tatgtccttgatggtgtccccagaatgagggaaaggcccatcggtgaccttgtggctggc660ctgaaacagcttggagcagatgttgattgcttcttgggcacaaactgccctccagtgaga720gtgaatgggaagggaggtttgcctggtggaaaggtcaaactgagtggatcagtctcttcc780cagtatctgactgccttgctcatggctgcccctctggctttgggtgatgtggagattgaa840atagtggacaagttgatttctgttccatatgtggaaatgaccctcaaactcatggagagg900tttggagtttctgttgaacattctggcaactgggatcgtttccttgtacatggaggtcag960aagtacaaaagccctggcaatgcctttgttgaaggggatgcaagctctgcttcctatctc1020ttggctggggctgccatcactggtgggaccatcactgtgaatggctgtggcacctcatcc1080cttcaaggtgatgtaaagtttgcagaggtcttggagaaaatgggtgccaaggtcacctgg1140tctgagaacagtgtaactgtgtctggacctcccagagacttcagtggcagaaaggttctc1200cgtggaattgatgtgaacatgaacaagatgccagatgtggccatgaccctcgctgttgta1260gccctgtttgcaaatggaccaactgcaatccgtgatgttgcttcatggagggtgaaggag1320acagagaggatgattgccatttgcacagaactccgcaaacttggtgcaacagttgaagag1380ggaccagattactgtgtgataaccccacctgagaagctcaatgtgacagccattgacacc1440tatgatgaccacagaatggcaatggctttctcccttgctgcctgtggtgatgtgcctgtg1500actatcaaagaccctgggtgcacaaggaagacatttccagactactttgaagttttggag1560aggttgacaaagcactgagtagttagcttaatcacctagagctc1604<210>23<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物Pat5-3<400>23agatacccttggttggttgc20<210>24<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物Pat3-3<400>24cagatggatcgtttggaagg20<210>25<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>AAD-1PTU正向引物<400>25ataatgccagcctgttaaacgcc23<210>26<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>AAD-1PTU反向引物<400>26ctcaagcatatgaatgacctcga23<210>27<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于編碼區(qū)PCRAAD-1(RdpAcodF)的正向引物<400>27atggctcatgctgccctcagcc22<210>28<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于編碼區(qū)PCRAAD-1(RdpAcodR)的反向引物<400>28cgggcaggcctaactccaccaa22<210>29<211>932<212>DNA<213>人工序列<220><223>AAD-2v2植物優(yōu)選的核苷酸<400>29ccatggctaccatagcaatcagacagctccagacccactttgtgggtcaagtttctggat60tggacctcagaaagccactcactcctggagaagccagagaagttgaatcagctatggaca120agtacgcagttcttgtcttccatgaccaagacatcacagatgagcaacagatggcctttg180ccctcaactttggtcagagggaggatgcacgtggtggcactgtcaccaaagagaaggatt240accgtcttcagtctggcctcaatgatgtttccaacttgggcaaagatggaaagccacttg300ccaaggacagccgcacccatttgttcaaccttggaaactgcttgtggcattctgactcca360gcttcagaccaatcccagccaagttcagcctcctttctgctcgtgttgtgaacccaactg420gtgggaacactgagtttgctgacatgagagctgcctatgatgctcttgacgatgaaacca480aagctgagattgaggaccttgtgtgtgagcactctctcatgtactcaaggggctcacttg540gcttcactgagtacacagatgaagagaagcaaatgttcaagcccgtcttgcagcgcttgg600tccgcacacaccctgtgcaccgtcgcaaatcactctacctctccagccatgccggaaaga660ttgccagcatgtccgtccctgaagggaggctccttttgagggatttgaatgaacatgcta720ctcagcctgagttcgtctatgttcacaaatggaagttgcatgatcttgtgatgtgggaca780ataggcaaaccatgcacagagtgaggagatatgaccagtcccaacccagagacatgcgcc840gtgcaacagttgctgggaccgagcccacagtgcaacagcaagcagcagagtgagtagtta900gcttaatcacctagagctcggtcaccagatct932<210>30<211>296<212>PRT<213>人工序列<220><223>翻譯的AAD-2v2蛋白質(zhì)<400>30MetAlaThrIleAlaIleArgGlnLeuGlnThrHisPheValGlyGln151015ValSerGlyLeuAspLeuArgLysProLeuThrProGlyGluAlaArg202530GluValGluSerAlaMetAspLysTyrAlaValLeuValPheHisAsp354045GlnAspIleThrAspGluGlnGlnMetAlaPheAlaLeuAsnPheGly505560GlnArgGluAspAlaArgGlyGlyThrValThrLysGluLysAspTyr65707580ArgLeuGlnSerGlyLeuAsnAspValSerAsnLeuGlyLysAspGly859095LysProLeuAlaLysAspSerArgThrHisLeuPheAsnLeuGlyAsn100105110CysLeuTrpHisSerAspSerSerPheArgProIleProAlaLysPhe115120125SerLeuLeuSerAlaArgValValAsnProThrGlyGlyAsnThrGlu130135140PheAlaAspMetArgAlaAlaTyrAspAlaLeuAspAspGluThrLys145150155160AlaGluIleGluAspLeuValCysGluHisSerLeuMetTyrSerArg165170175GlySerLeuGlyPheThrGluTyrThrAspGluGluLysGlnMetPhe180185190LysProValLeuG1nArgLeuValArgThrHisProValHisArgArg195200205LysSerLeuTyrLeuSerSerHisAlaGlyLysIleAlaSerMetSer210215220ValProGluGlyArgLeuLeuLeuArgAspLeuAsnGluHisAlaThr225230235240GlnProGluPheValTyrValHisLysTrpLysLeuHisAspLeuVal245250255MetTrpAspAsnArgGlnThrMetHisArgValArgArgTyrAspGln260265270SerGlnProArgAspMetArgArgAlaThrValAlaGlyThrGluPro275280285ThrValGlnGlnGlnAlaAlaGlu290295<210>31<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>Southern片段PCRAAD-1正向引物<400>31atggctcatgctgccctcagcc22<210>32<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>Southern片段PCRAAD-1反向引物<400>32gggcaggcctaactccaccaa2權(quán)利要求1.轉(zhuǎn)基因植物細胞，其含有編碼AAD-1蛋白的多核苷酸的，所述AAD-1蛋白含有SEQIDNO9或SEQIDNO9變體的氨基酸序列，其中所述變體具有芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶活性、至少一個氨基酸缺失或保守性替換以及與SEQIDNO9至少95％的序列同一性。2.權(quán)利要求1的細胞，其中所述植物細胞選自雙子葉植物細胞和單子葉植物細胞。3.權(quán)利要求2的細胞，其中所述植物細胞為雙子葉植物細胞，并選自棉花細胞、煙草細胞、蕓苔細胞、大豆細胞和擬南芥細胞。4.權(quán)利要求2的細胞，其中所述植物細胞為單子葉植物細胞，并選自稻細胞和玉米細胞。5.含有多個根據(jù)權(quán)利要求1的細胞的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述多核苷酸的表達賦予所述細胞對芳氧基鏈烷酸酯除草劑的耐性。6.權(quán)利要求5的植物，其中所述除草劑為苯氧基生長素除草劑。7.權(quán)利要求5的植物，其中所述除草劑選自2，4-二氯苯氧乙酸、MCPA、2，4-滴丙酸和2-甲-4-氯丙酸。8.權(quán)利要求5的植物，其中所述除草劑為芳氧基苯氧丙酸酯。9.權(quán)利要求5的植物，其中所述除草劑選自吡氟禾草靈、吡氟氯禾靈、禾草靈、喹禾靈、fenoxaprop、metamifop、cyhalofop和clodinofop。10.權(quán)利要求5的植物，其中所述多核苷酸的表達同時賦予所述植物對苯氧基生長素除草劑和芳氧基苯氧丙酸酯除草劑的抗性。11.權(quán)利要求5的植物，其中所述植物還含有第二種除草劑抗性基因。12.權(quán)利要求11的植物，其中所述第二種除草劑抗性基因賦予所述植物對選自以下的除草劑的抗性草甘膦、草銨膦、ALS抑制劑、4-羥苯基丙酮酸雙加氧酶(HPPD)抑制劑、和原卟啉原氧化酶(PPO)抑制劑。13.控制大田中至少一種雜草的方法，其中所述大田中包含至少一種權(quán)利要求5的植物，其中所述方法包括對所述大田的至少一部分應(yīng)用選自苯氧基生長素除草劑和芳氧基苯氧丙酸酯除草劑的第一種除草劑。14.權(quán)利要求13的方法，其中所述除草劑為手性苯氧基生長素的R-對映體。15.權(quán)利要求14的方法，其中所述除草劑選自R-2，4-滴丙酸和R-2-甲-4-氯丙酸。16.權(quán)利要求13的方法，其中所述除草劑為非手性苯氧基生長素。17.權(quán)利要求16的方法，其中所述除草劑選自2，4-滴和MCPA。18.權(quán)利要求13的方法，其中所述第一種除草劑芳氧基苯氧丙酸酯，且所述植物為單子葉植物。19.權(quán)利要求18的方法，其中所述單子葉植物選自玉米、稻、小麥、大麥、黑麥、草坪草、燕麥、高粱和牧草。20.權(quán)利要求13的方法，其中所述第一種除草劑為苯氧基生長素，且所述植物為雙子葉植物。21.權(quán)利要求20的方法，其中所述雙子葉植物選自棉花、煙草、蕓苔和大豆。22.權(quán)利要求13的方法，其中所述方法包括應(yīng)用第二種除草劑。23.權(quán)利要求22的方法，其中相繼應(yīng)用所述第一種除草劑和所述第二種除草劑。24.權(quán)利要求22的方法，其中同時應(yīng)用所述第一種除草劑和所述第二種除草劑。25.權(quán)利要求22的方法，其中所述第一種除草劑為苯氧基生長素，第二種除草劑為芳氧基苯氧丙酸酯。26.權(quán)利要求13的方法，其中所述植物對草甘膦具有抗性。27.權(quán)利要求14的方法，其中所述R-對映體是消旋混合物的組分。28.權(quán)利要求22的方法，其中所述植物還含有第二種除草劑抗性基因，其賦予所述植物對所述第二種除草劑的抗性。29.權(quán)利要求28的方法，其中所述第二種基因選自修飾的AHAS(乙酰羥酸合酶)、SurA、SurB、Csr1、Csr1-1、Csr1-2和修飾的EPSPS(5-烯醇丙酮莽草酸-3磷酸合酶)、GOX、GAT、PAT(膦絲菌素-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶)、bar和二氯甲氧苯酸降解酶。30.權(quán)利要求28的方法，其中所述第二種除草劑選自草甘膦、草銨膦、二氯甲氧苯酸、乙酰乳酸合酶抑制劑、原卟啉原氧化酶抑制劑和羥苯基丙酮酸雙加氧酶抑制劑。31.權(quán)利要求30的方法，其中所述第二種除草劑為選自咪唑啉酮、磺酸脲和三唑嘧啶除草劑的乙酰乳酸合酶抑制劑。32.權(quán)利要求31的方法，其中所述第二種除草劑為選自imizamox、咪草煙、imizaquin和imizapic的咪唑啉酮。33.權(quán)利要求28的方法，其中所述第一種除草劑為苯氧基生長素，第二種除草劑選自草甘膦和草銨膦。34.權(quán)利要求33的方法，其中所述苯氧基生長素為2，4-滴，第二種除草劑為草甘膦。35.權(quán)利要求28的方法，其中所述第一種除草劑為芳氧基苯氧丙酸酯，所述第二種除草劑為草甘膦。36.權(quán)利要求35的方法，其中所述第一種除草劑選自喹禾靈、吡氟氯禾靈和氰氟草酯。37.權(quán)利要求31的方法，其中所述第二種除草劑為選自酰嘧磺隆、芐嘧黃隆、氯嘧磺隆、氯磺隆、醚磺隆、氟啶嘧磺隆、甲酰胺磺隆、氯吡嘧磺隆、煙嘧黃隆、氟嘧磺隆、三氟丙磺隆、玉嘧磺隆、甲嘧磺隆、磺?；锹?、噻磺隆、醚苯黃隆、三氟啶磺隆和氟胺磺隆的磺酸脲。38.權(quán)利要求28的方法，其中所述方法還包括應(yīng)用第三種除草劑。39.權(quán)利要求38的方法，其中所述除草劑為2，4-滴、喹禾靈和草銨膦。40.控制大田中雜草的方法，其中所述方法包括對所述大田應(yīng)用第一種除草劑并在應(yīng)用所述第一種除草劑之后14天內(nèi)在所述大田中播種種子，其中所述種子含有權(quán)利要求1的細胞，且其中所述第一種除草劑選自苯氧基生長素和芳氧基苯氧丙酸酯。41.權(quán)利要求40的方法，其中所述第一種除草劑為酸、無機鹽、有機鹽、酯、R-對映體特異性異構(gòu)體或消旋混合物的組分。42.權(quán)利要求40的方法，其中所述種子含有賦予所述植物對第二種除草劑的抗性的第二種基因，且所述方法還包括在所述播種前對所述大田應(yīng)用所述第二種除草劑。43.權(quán)利要求42的方法，其中所述第二種除草劑選自草甘膦、對草快和草銨膦。44.優(yōu)化用于在植物中表達的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶活性的蛋白質(zhì)，其中編碼所述蛋白質(zhì)的核酸分子在嚴(yán)格條件下與選自SEQIDNO3、SEQIDNO4或SEQIDNO5的序列的完全互補物雜交。45.權(quán)利要求44的多核苷酸，其中所述多核苷酸優(yōu)化用于在雙子葉植物或單子葉植物中表達。46.權(quán)利要求44的多核苷酸，其中所述多核苷酸含有SEQIDNO5。47.分離的多核苷酸，其編碼酶降解選自苯氧基生長素和芳氧基苯氧丙酸酯的除草劑的蛋白質(zhì)，其中編碼所述蛋白質(zhì)的核酸分子在嚴(yán)格條件下與選自SEQIDNO3、SEQIDNO4或SEQIDNO5的序列的完全互補物雜交，其中所述多核苷酸與在植物細胞中具有功能的啟動子有效連接。48.權(quán)利要求47的多核苷酸，其中所述啟動子為植物啟動子。49.權(quán)利要求47的多核苷酸，其中所述啟動子為木薯葉脈花葉病毒啟動子。50.選擇轉(zhuǎn)化的植物細胞的方法，其中所述方法包括用權(quán)利要求44或47的多核苷酸轉(zhuǎn)化多個植物細胞，并在允許表達所述多核苷酸的轉(zhuǎn)化細胞生長而殺死未轉(zhuǎn)化細胞或抑制其生長的除草劑濃度下培養(yǎng)所述細胞，其中所述除草劑選自苯氧基生長素和芳氧基苯氧鏈烷酸酯。51.權(quán)利要求50的方法，其中所述細胞為植物細胞，并使用所述方法選擇轉(zhuǎn)化的植物。52.權(quán)利要求47或50的多核苷酸，其中所述多核苷酸用作權(quán)利要求50的方法中的選擇標(biāo)記物。53.檢測植物是否含有權(quán)利要求47或50的多核苷酸的方法，其中所述方法包括收集來自所述植物的樣品并測定所述樣品中所述多核苷酸的存在。54.權(quán)利要求53的方法，其中所述方法包括測定所述樣品中所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)的存在。55.權(quán)利要求53的方法，其中所述方法包括使用PCR引物或探針檢測所述多核苷酸的存在。56.權(quán)利要求54的方法，其中所述方法包括使用抗體檢測所述蛋白質(zhì)的存在。57.種子，其含有權(quán)利要求1的植物細胞。58.從權(quán)利要求57的種子長成的植物。59.權(quán)利要求5的植物的部分、后代或無性繁殖體。60.權(quán)利要求13的方法，其中所述方法用于處理或預(yù)防除草劑抗性雜草。61.權(quán)利要求5的植物，其中所述植物還含有昆蟲抗性基因，所述昆蟲抗性基因來自選自蘇蕓金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)、光桿狀菌(Photorhabdus)和致病桿菌(Xenorhabdus)的生物。62.權(quán)利要求5的植物，其中所述植物還含有用于農(nóng)學(xué)性狀的基因，所述農(nóng)學(xué)性狀選自真菌抗性、脅迫耐性、提高的產(chǎn)量、改善的油譜、改善的纖維質(zhì)量、病毒抗性、推遲成熟、寒冷耐性和鹽耐性。63.賦予作物2，4-滴除草劑抗性的方法，其中所述方法包括將編碼酶的核酸引入所述作物的至少一個植物細胞，所述酶具有與2，4-滴除草劑相關(guān)的R-特異性芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶活性。64.控制草甘膦耐性作物植物的大田中草甘膦抗性雜草的方法，其中所述植物含有權(quán)利要求47的多核苷酸，且所述方法包括對所述大田的至少一部分應(yīng)用芳氧基鏈烷酸酯除草劑。65.權(quán)利要求64的方法，其中所述除草劑為苯氧基生長素。66.權(quán)利要求64的方法，其中所述除草劑為芳氧基苯氧丙酸酯。67.權(quán)利要求64的方法，其中所述植物為雙子葉植物。68.權(quán)利要求64的方法，其中所述植物為單子葉植物。全文摘要本發(fā)明提供不僅對2，4－滴和其他苯氧基生長素除草劑具有抗性，而且還對芳氧基苯氧丙酸酯除草劑具有抗性的新植物。迄今為止，還沒有預(yù)期或提出可通過引入單基因產(chǎn)生具有這兩種有利特性的植物。本發(fā)明還包括這樣的植物其產(chǎn)生單獨或與其他除草劑抗性基因(優(yōu)選草甘膦抗性基因)“疊加”的一種或多種本發(fā)明的酶，以提供更廣更強的雜草控制、提高的處理靈活性和改進的除草劑抗性管理選擇。更具體的，本發(fā)明用途中優(yōu)選的酶和基因在本文中稱為AAD(芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶)基因和蛋白。先前已經(jīng)報道的α酮戊二酸依賴性雙加氧酶均不具有降解不同化學(xué)類別和作用方式的除草劑的能力。這一高度新穎的發(fā)現(xiàn)是重要的除草劑耐受作物的可能性以及開發(fā)選擇標(biāo)記物技術(shù)的基礎(chǔ)。本發(fā)明還包括控制雜草的相關(guān)方法。本發(fā)明使得可以以新的方式使用除草劑的新組合。此外，本發(fā)明提供預(yù)防形成對一種或多種除草劑(如草甘膦)具有抗性(或天然更具耐性)的雜草或控制這些雜草的方法。文檔編號A01H5/00GK1984558SQ20058002206公開日2007年6月20日申請日期2005年5月2日優(yōu)先權(quán)日2004年4月30日發(fā)明者T·R·萊特,J·M·里拉,D·J·默洛,N·霍普金斯申請人:美國陶氏益農(nóng)公司