專利名稱：一種用生物反應(yīng)器培養(yǎng)葛仙米的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種利用生物反應(yīng)器生產(chǎn)培養(yǎng)葛仙米的方法。
背景技術(shù)：
葛仙米是一種藍(lán)藻，原名“天仙米”，學(xué)名擬球形念珠藻(Nostoc sphaeroides)，是藍(lán)藻綱，念珠藻科，念珠藻屬的一個種。葛仙米是席上珍品，食療珍品，藥膳珍品。它甚稱天下佳肴，名貴山珍。我國人民食用藍(lán)藻的文字記載是世界上歷史最悠久的，對葛仙米的認(rèn)識也以有2000年了。據(jù)世界名著《本草綱目》記載“葛仙米，生湖廣沿溪山穴石上，遇大雨沖開穴口，此米隨流而出。土人撈取，初取時如小鮮木耳，紫綠色，以醋拌之，肥絕可食。土名天仙菜，干則天仙米……。晉葛洪(注東晉人，醫(yī)學(xué)家，煉丹家，道教倫理家)隱此乏糧，采以為食，故名”。據(jù)鄂西先民世代傳頌的傳說，晉朝葛洪南貶途徑走馬患疾，迫災(zāi)荒采葛仙米以食之，奇獲身疾康復(fù)之功效。后，洪入朝歌，以此奉獻皇上，體弱多病的太子食之，病除體壯，皇帝娘娘食之，四處求醫(yī)無法治愈的夜盲癥病除，皇感洪恩，隨將“天仙米”賜名“葛仙米”。葛仙米營養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量高(52-56％)，氨基酸組分齊全，含有豐富的生物活性多糖(8-12％)，維生素含量是獼猴桃的3倍以上，比柑橘高15倍，其含量接近鮮棗；富含不飽和脂肪酸和多種礦質(zhì)元素如P.S.K.Ca.Fe.Se等十分豐富。因此，葛仙米具有強身健體和許多醫(yī)療保健等功效。據(jù)《全國中草藥匯編》介紹“葛仙米性寒、味淡，可以清熱、收斂、益氣、明目。主治夜盲癥、脫肛，外用可治燒傷，燙傷。”由于葛仙米的生態(tài)生境比較特殊，葛仙米的生長對自然條件的選擇極為嚴(yán)格。它的生長繁殖受生態(tài)條件所限制，因而在國內(nèi)，僅在我國個別山區(qū)的少數(shù)稻田中生長。葛仙米要求的生長條件是多種多樣的，如礦質(zhì)營養(yǎng)，溫度，光照，水的酸堿度，以及有無有害氣體、農(nóng)藥、自然天敵等。全球氣候變暖，環(huán)境變化和污染已不是短期內(nèi)憑一部分人的意志可以改變的，欲求糧食的豐收，農(nóng)藥與化肥的使用也不可避免。于是矛盾就出來了，一方面是葛仙米產(chǎn)量下降，產(chǎn)品質(zhì)量逐步降低；而人們的需求上升，另一方面是產(chǎn)地減少，加上大量采收，自然生態(tài)遭到破壞，使得本來就貧乏葛仙米的產(chǎn)量不斷下降。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)葛仙米的方法，此方法易行，操作方便，適宜工業(yè)化生產(chǎn)；解決了葛仙米生長快，產(chǎn)量高、成本低的問題。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)措施A、培養(yǎng)液配制將稱好或配制好的貯藏液加入水中的順序是按每升水中加入硫酸鎂0.07-0.08g、氯化鈣0.03-0.042g、檸檬酸0.005-0.007g、檸檬鐵銨0.005-0.007g、乙二酸四乙酸二鈉鹽(EDTA)0.001-0.002g、碳酸鈉0.03-0.05g、微量元素A51mL、磷酸氫二鉀0.07-0.09g，即可得培養(yǎng)液。
B、葛仙米種子制備1)一級種子由試管原種接到小三角瓶(150ml)，靜止培養(yǎng)或通氣培養(yǎng)；培養(yǎng)到出現(xiàn)細(xì)微小顆粒后轉(zhuǎn)入二級種子培養(yǎng)。
2)二級種子由一級種子接到500-1000ml培養(yǎng)瓶通氣培養(yǎng)，達(dá)到微小圓珠狀后進入三級種子培養(yǎng)。
3)三級種子由二級種子接入到5-10L培養(yǎng)瓶進行養(yǎng)殖，葛仙米顆粒達(dá)到小顆粒狀時，轉(zhuǎn)入規(guī)?；B(yǎng)殖容器中(10L以上容器)進行生產(chǎn)。
4)二或三級培養(yǎng)物得到的球形體長到約直徑0.8-1.2mm的培養(yǎng)物就可作為大量培養(yǎng)的接種種源；也可用收獲物中通過篩濾出的直徑在1-1.5mm的葛仙米小球體作為種子繼續(xù)培養(yǎng)。
C、生物反應(yīng)器培養(yǎng)(普通生物反應(yīng)器)1)采用一般生物反應(yīng)器該裝置可以控制溫度、光強、營養(yǎng)液及通氣條件等；控制溫度28-30℃，光強80-100μE.m-2.s-1，容積180-240l/個。
2)培養(yǎng)場地與培養(yǎng)器可在室內(nèi)或塑料大棚中，有條件的地方也可在玻璃溫室安置光生物反應(yīng)器。并配備一個孔徑約0.5cm的不銹鋼篩，用來篩選合格的球形體。
3)接種與培養(yǎng)按每升培養(yǎng)液0.5-2g濕重的比例接種于光生物反應(yīng)器中。用空氣充氣泵通氣(通氣起到攪動和提供CO2的作用)以5-10L/min的速度從通氣口通氣。為了減少氣體對培養(yǎng)物的污染，進入反應(yīng)器之前，將氣體以棉花過濾。通氣量由閥門控制。
D、監(jiān)控建立的監(jiān)控條件和標(biāo)準(zhǔn)。溫度25-30℃；光強700-800μE.m-2.s-1pH8.0-8.5；其它細(xì)菌(主要有粘細(xì)菌)、真菌(主要為霉菌類)和雜藻(主要有小球藻等單細(xì)胞綠藻)檢測(1)涂平板法將培養(yǎng)液涂布在細(xì)菌培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基上，37℃溫培24小時后，觀察是否由菌落出現(xiàn)；(2)顯微觀察取少量培養(yǎng)液，加入DAPI(一種熒光染料)至終濃度1μg/ml染色5分鐘，在熒光顯微鏡下用紫外光激發(fā)觀察。若發(fā)現(xiàn)有藍(lán)綠運動亮點，即為雜菌污染。(3)顯微鏡下直接觀察是否有雜藻存在。營養(yǎng)鹽濃度檢測方法參看美國出版的Standard Methods for Water and Waste Water一書。
若檢測的值不在上述范圍內(nèi)，則需通過相應(yīng)的措施解決。如溫度可通過調(diào)節(jié)室內(nèi)溫度控制；光強度光生物反應(yīng)器內(nèi)光強較穩(wěn)定(700-800μE.m-2.s-1)；pH通過酸或堿調(diào)節(jié)。微生物污染嚴(yán)重時則需徹底更換培養(yǎng)液，并對反應(yīng)器進行滅菌處理。營養(yǎng)不足時則注入新鮮培養(yǎng)液或添加營養(yǎng)鹽等。
E、收獲將欲收獲葛仙米培養(yǎng)物通孔略小于0.5cm的不銹鋼篩子過篩。直徑0.5cm左右的球形體留在篩子上，這些就是所要獲得的葛仙米產(chǎn)品。篩下來的葛仙米小群體和培養(yǎng)液經(jīng)處理后繼續(xù)作種子培養(yǎng)。
F、提高葛仙米球形體的機械強度將過篩后直徑大于0.5cm的葛仙米球形體通過下面任一途徑提高機械強度。一種是在培養(yǎng)液中加入1.5g/L的碳酸鈉，將球形體轉(zhuǎn)移到這種含有新鮮培養(yǎng)液中，以培養(yǎng)時的同樣條件通氣培養(yǎng)3-5天，收獲即可；另一種是將合格的球形體靜置于原培養(yǎng)液中，于低溫下(1-10℃)靜置10-15小時。并注意，在靜止時，要將反應(yīng)器置于少于10μE.m-2.s-1的光強下以防止球形體的裂解。
G、干燥收獲的球形體若不及時干燥，就會腐爛變質(zhì)。干燥時，由于球形體胞外具有的多糖有高粘性，因此極易與盛放器皿黏結(jié)在一起。因此在干燥時把藻體放在絹布或絲網(wǎng)上就可避免黏結(jié)。干燥的方法有篩干，風(fēng)干或烘干。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點和效果方法易行、設(shè)備簡單、操作方便、產(chǎn)量高，產(chǎn)品質(zhì)量好、無污染、安全性高、生長過程短，可廣泛適用于城鄉(xiāng)大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。葛仙米培養(yǎng)的過程中吸收二氧化碳，并向大氣中排放出氧氣，可起到凈化空氣的作用，不產(chǎn)生有害或有毒物質(zhì)，培養(yǎng)液鹽度低，酸堿度接近于自然水體，可循環(huán)利用。生長過程短，葛仙米生長快，10天就可完成對數(shù)生長，效率高，適量接種的培養(yǎng)物，20天后產(chǎn)量可達(dá)2-2.5g(干重)/l，每立方米培養(yǎng)液可收獲2kg干藻。
具體實施例方式
利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)葛仙米方法的具體實施步驟如下1、培養(yǎng)液配制將稱好或配制好的貯藏液加入水中的順序是按每升水這加入硫酸鎂0.075g、氯化鈣0.036g、檸檬酸0.006g、檸檬鐵銨0.006g、乙二酸四乙酸二鈉鹽(EDTA)0.001g、碳酸鈉0.03g、微量元素A51ml、磷酸氫二鉀0.07g。
2、葛仙米種子制備2.1一級種子制備由試管原種接到小三角瓶(150ml)，放置在培養(yǎng)架(或箱)上，在光照10μE.m-2.s-1，溫度28℃條件下靜止培養(yǎng)或通氣培養(yǎng)；培養(yǎng)到出現(xiàn)細(xì)微小顆粒后轉(zhuǎn)如二級種子培養(yǎng)。
2.2二級種子制備由一級種子接到500-1000ml培養(yǎng)瓶，放置在培養(yǎng)架(或箱)上，在光照50μE.m-2.s-1，溫度28℃條件下通氣培養(yǎng)，達(dá)到微小圓珠狀后進入三級種子培養(yǎng)。
2.3三級種子制備由二級種子接入到5-10L培養(yǎng)瓶進行養(yǎng)殖，在光照80μE.m-2.s-1，溫度28℃條件下通氣培養(yǎng)，葛仙米小顆粒達(dá)到約直徑在1mm左右時，為制備好的規(guī)模化生產(chǎn)所用的種子。
3.接種培養(yǎng)(生物反應(yīng)器培養(yǎng))3.1生物反應(yīng)器可以控制溫度、光強、營養(yǎng)液及通氣條件等；控制溫度28-30℃，光強100μE.m-2.s-1，容積180L/個。
3.2培養(yǎng)場地與培養(yǎng)器可在室內(nèi)或塑料大棚中，有條件的地方也可在玻璃溫室安置光生物反應(yīng)器。并配備一個孔徑約0.5cm的不銹鋼篩，用來篩選合格的球形體。
3.3接種與培養(yǎng)按每升培養(yǎng)液0.5-2g濕重的比例接種于光生物反應(yīng)中。用空氣充氣泵通氣(通氣起到攪動和提供CO2的作用)以5-10L/min的速度從通氣口通氣。為了減少氣體對培養(yǎng)物的污染，進入反應(yīng)器之前，將氣體以棉花過濾。通氣量由閥門控制。
4、監(jiān)控建立的監(jiān)控條件和標(biāo)準(zhǔn)。溫度28℃；光強800μE.m-2.s-1pH8.0；其它微生物如細(xì)菌，真菌和雜藻檢測(1)涂平板法將培養(yǎng)液涂布在細(xì)菌培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基上，37℃溫培24小時以上后，觀察是否由菌落出現(xiàn)；(2)顯微觀察取少量培養(yǎng)液，加入DAPI(一種熒光染料)至終濃度1μg/ml染色5分鐘，在熒光顯微鏡下用紫外光激發(fā)觀察。若發(fā)現(xiàn)有藍(lán)綠運動亮點，即為污染微生物。(3)顯微鏡下直接觀察是否有雜藻存在。營養(yǎng)鹽濃度檢測方法參看美國出版的Standard Methods for Water and Waste Water一書。若檢測的值不在上述范圍內(nèi)，則需通過相應(yīng)的措施解決。如溫度可通過調(diào)節(jié)室內(nèi)溫度控制；光強度光生物反應(yīng)器內(nèi)光強較穩(wěn)定(700-800μE.m-2.s-1)；pH通過酸或堿調(diào)節(jié)。微生物污染嚴(yán)重時則需徹底更換培養(yǎng)液，并對反應(yīng)器進行滅菌處理。營養(yǎng)不足時則注入新鮮培養(yǎng)液或添加營養(yǎng)鹽等等。
5、收獲將欲收獲葛仙米培養(yǎng)物通孔略小于0.5cm的不銹鋼篩子過篩。直徑0.5cm左右的球形體留在篩子上，這些就是我們所要獲得的葛仙米產(chǎn)品。篩下來的葛仙米小群體和培養(yǎng)液經(jīng)處理后繼續(xù)作種子培養(yǎng)。
6、提高葛仙米球形體的機械強度將過篩后直徑大于0.5cm的葛仙米球形體通過下面任一途徑提高機械強度。一種是在培養(yǎng)液中加入1.5g/L的碳酸鈉，將球形體轉(zhuǎn)移到這種含有新鮮培養(yǎng)液中，以培養(yǎng)時的同樣條件通氣培養(yǎng)3-5天，收獲即可；另一種是將合格的球形體靜置于原培養(yǎng)液中，于低溫下(1-10℃)靜置10-15小時。并注意，在靜止時，要將反應(yīng)器置于少于10μE.m-2.s-1的光強下以防止球形體的裂解。
7、干燥收獲的球形體若不及時干燥，就會腐爛變質(zhì)。干燥時，由于球形體胞外具有的多糖有高粘性，因此極易與盛放器皿黏結(jié)在一起。因此在干燥時把藻體放在絹布或絲網(wǎng)上就可避免黏結(jié)。干燥的方法有篩干，風(fēng)干或烘干。
權(quán)利要求
1.一種用生物反應(yīng)器培養(yǎng)葛仙米的方法，包括下列步驟A、培養(yǎng)液配制按每升水加入硫酸鎂0.07-0.08g、氯化鈣0.03-0.042g、0.001-0.002g、碳酸鈉0.03-0.05g、微量元素A51ml、磷酸氫二鉀0.07-0.09g；B、葛仙米種子制備一是一級種子制備，由試管原種接到三角瓶，放置在培養(yǎng)架上，在光照10μE.m-2.s-1，溫度25-30℃條件下靜止培養(yǎng)，培養(yǎng)到小顆粒后轉(zhuǎn)二級種子培養(yǎng)；二是二級種子制備，由一級種子接到培養(yǎng)瓶，放置在培養(yǎng)架上，在光照10μE.m-2.s-1，溫度25-30℃條件下通氣培養(yǎng)，達(dá)到圓珠狀后進入三級種子培養(yǎng)；三是三級種子制備，由二級種子接入到培養(yǎng)瓶進行養(yǎng)殖，在光照10μE.m-2.s-1，溫度25-30℃條件下通氣培養(yǎng)，葛仙米顆粒直徑在0.8-1.2mm時，為制備好的規(guī)模化生產(chǎn)所用的種子；C、生物反應(yīng)器培養(yǎng)一是采用生物反應(yīng)器控制溫度28-30℃，光強80-100μE.m-2.s-1，容積180-240L/個；二是培養(yǎng)場地與培養(yǎng)器在室內(nèi)或塑料大棚中，有條件的地方也可在玻璃溫室安置光生物反應(yīng)器；三是接種與培養(yǎng)按每升培養(yǎng)液0.5-2g濕重的比例接種于光生物反應(yīng)中，用空氣充氣泵通氣，以5-10L/min的速度從通氣口通氣，進入反應(yīng)器之前，將氣體滅菌以棉花過濾，通氣量由配氣閥門控制；D、監(jiān)控建立的監(jiān)控條件和標(biāo)準(zhǔn)為，溫度28-30℃，光強700-800μE.m-2.s-1，pH8.0-8.5；E、收獲將收獲葛仙米培養(yǎng)物通孔小于0.5cm的不銹鋼篩子過篩，直徑0.5cm的球形體留在篩子上，為葛仙米產(chǎn)品，篩下來的葛仙米小群體和培養(yǎng)液經(jīng)處理后繼續(xù)作種子培養(yǎng)；F、提高葛仙米球形體的機械強度將過篩后直徑為0.5cm的球形體在培養(yǎng)液中加入1.5g/L的碳酸鈉，將球形體轉(zhuǎn)移到含有新鮮培養(yǎng)液中，以培養(yǎng)時的同樣條件通氣培養(yǎng)3-5天，收獲即可；G、干燥干燥時把藻體放在絹布或絲網(wǎng)上就可避免黏結(jié)，干燥有篩干，風(fēng)干或烘干。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用生物反應(yīng)器培養(yǎng)葛仙米的方法，1.培養(yǎng)液配制，采用硫酸鎂、氯化鈣、檸檬酸、檸檬鐵銨、乙二酸四乙酸二鈉鹽、碳酸鈉、微量元素液A5、磷酸氫二鉀按比例配制；2.藻種制備，二或三級培養(yǎng)物得到的球形體的培養(yǎng)物作為培養(yǎng)的接種種源；3.生物反應(yīng)器培養(yǎng)，控制溫度、光強、培養(yǎng)液通氣條件；4.制備接種物；5.培養(yǎng)；6.監(jiān)控；7.收獲；8.提高葛仙米球形體的機械強度；9.干燥。本發(fā)明方法易行、設(shè)備簡單、操作方便、產(chǎn)量高，產(chǎn)品質(zhì)量好、無污染、安全性高、生長過程短，廣泛適用于城鄉(xiāng)大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號A01H13/00GK1528127SQ20031011121
公開日2004年9月15日 申請日期2003年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月10日
發(fā)明者沈銀武, 劉永定, 吳國樵, 李敦海, 劉其芳, 丘昌強 申請人:中國科學(xué)院水生生物研究所