專利名稱：可用作抗微生物劑的中鏈脂肪酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及特定范圍的中鏈脂肪酸(MCFA)作為微生物，特別是細(xì)菌和真菌污染和生長的抑制劑的用途。具體地說，本發(fā)明涉及己酸(C6)、庚酸(C7)、辛酸(C8)、壬酸(C9)和癸酸(C10)或其鹽或衍生物或混合物或其乳劑抑制細(xì)菌和真菌污染及生長的用途，并且其中適合抑制這些微生物隨后產(chǎn)生的毒素。
更具體地說，本發(fā)明涉及一種混合物，含有重量基本上相等的C8和C10作為抗微生物劑，它們主要在酸性環(huán)境例如胃中有活性。
背景技術(shù)：
微生物是食品和飼料變質(zhì)的最大根源并且引起主要營養(yǎng)素相當(dāng)大的損失(Bartov等，1982)。所有食品和飼料組分天生受到細(xì)菌、酵母和(主要是發(fā)霉)真菌的污染，最后一種經(jīng)常為孢子的形式。在約4℃以上的溫度下，大多數(shù)食品和飼料是微生物生長的理想的培養(yǎng)基，并且大多數(shù)時間微生物通過就地發(fā)育隨后產(chǎn)生有毒代謝物(內(nèi)毒素、霉菌毒素...)(Smith等，1983；Russel等，1991)。
在本文中，農(nóng)產(chǎn)品被真菌污染是一個非常有說服力的例子。經(jīng)常不可避免地被產(chǎn)霉菌毒素的真菌污染并且這一點(diǎn)也是全世界關(guān)注的(Tuite，1979，Jelinek等，1989)。而且，由于濕度和溫度是真菌生長的重要參數(shù)，因此液態(tài)食品和飼料特別易被真菌污染并生長，隨后產(chǎn)生霉菌毒素。
盡管一些霉菌和真菌沒有毒性并且不難控制甚至允許其繁殖，但是其它就造成相當(dāng)大的麻煩。而且，在標(biāo)準(zhǔn)控制實(shí)踐中不可能區(qū)分非毒性和毒性形式的霉菌和真菌(Hirooka等，1996)。
造成人和動物疾病的真菌和酵母，可以通過直接感染(霉菌病)或者通過產(chǎn)生霉菌毒素引起，這樣進(jìn)一步攝取(霉菌毒素中毒)(wyatt，1995)。霉菌病的實(shí)例是家禽的曲霉病、家畜的Fog熱(Fog Fever)和農(nóng)民肺。這些疾病有時非常難以治愈。另一方面，在二十世紀(jì)六十年代早期全世界關(guān)注霉菌毒素中毒，因?yàn)楫?dāng)時英國約1百萬只鳥(火雞)因黃曲霉毒素中毒(黃曲霉毒素引起的霉菌毒素中毒)死亡。霉菌毒素中毒是由以下霉菌毒素引起的黃曲霉毒素、赭曲霉素、單端孢霉烯、玉米赤霉烯酮、桔霉素、…。
根據(jù)存在的霉菌毒素的性質(zhì)和濃度、接觸時間、動物種類、其年齡和與污染的食品和飼料接觸時的營養(yǎng)健康狀況，霉菌毒素引起各種有害的臨床征兆(Reiss，1978；Bartov等，1982；Harvey等，1989；Hamilton，1990；Pier，1992)。霉菌生長和隨后產(chǎn)生霉菌毒素導(dǎo)致許多影響真菌侵入和在植物部分形成菌落的能力的植物和環(huán)境因素。為此，過去采用了幾種技術(shù)以便將真菌菌落形成、污染和生長以及隨后霉菌毒素的產(chǎn)生最小化。
在用于防止食品和飼料的真菌污染的最古老的那些系統(tǒng)可能是，進(jìn)行風(fēng)干、曬干、通過人工方式干燥、煙熏、于厭氧條件下貯藏、發(fā)酵、腌制、鹽制、糖制和向一些食品和飼料中加入香料。然而，這些傳統(tǒng)方法的成本相對較高并且非常費(fèi)時。此外，如果這些食品和飼料處于運(yùn)輸中或者在完全膳食中已與其它組分混合，那么這些方法不能真正有用。
因此，例如化學(xué)防腐的其它方法在最后十幾年中成為較吸引人的選擇。(高水分)食品和飼料的化學(xué)真菌防腐及其喂食給人和牲畜已得到充分證明(Jones等，1970；English等，1973；Foster等，1987；Yasin和Hanna，1989)。但是現(xiàn)在，為了消除食品和飼料中的真菌生長，通常使用沒有延遲的情況下貯藏、將水分保持盡可能低和加入霉菌抑制劑(例如丙酸鹽)或其它化學(xué)防腐劑(例如酸抑制劑，如苯甲酸、山梨酸、乙酸及其鹽)或其衍生物或其混合物(Smith等，1983)。
丙酸和所有傳統(tǒng)酸防腐劑是非常有效的霉菌抑制劑，但是由于其揮發(fā)性和刺激性以及腐蝕性，這些酸已不被廣泛地使用(Marin等，1999)。為此，目前市售各種緩沖形式的丙酸(干和液體)，但對這些類型的“混合”化學(xué)物質(zhì)的功效僅能獲得有限和不確定的信息(Rahnema和Neal，1992)。為了評價(jià)這些新型“混合”化學(xué)物質(zhì)，進(jìn)行了一些工作(Rahnema和Neal，1994)。再向前，如今可以獲得一些非酸抗真菌劑，例如納他霉素、制霉菌素...(Rybinska等，1997；Emele等，2000)。但是這些新抗真菌劑中一部分受到倫理、情感和經(jīng)濟(jì)方面的約束。
盡管最近百年來，注意力更集中在人營養(yǎng)的微生物污染上，但是動物飼料防腐的實(shí)踐如今也變得重要起來。隨后的實(shí)例描述了抗微生物污染的飼料防腐的重要性。
鑒于現(xiàn)代動物飼養(yǎng)系統(tǒng)為了增加生產(chǎn)率并保持利潤的經(jīng)濟(jì)利益，通常實(shí)踐是通過使特定動物(例如豬仔...)提前斷奶來增加其生長速度。然而提前斷奶使得動物承受許多不利壓力，主要是營養(yǎng)源(Zijlstra等，1996)。這種不利壓力經(jīng)常伴隨有飼料吸收或多或少嚴(yán)重降低和能量不足，因此引起動物身體儲備的動員。消化不良和吸收不良可能使這種狀況進(jìn)一步惡化并導(dǎo)致主要因胃腸道內(nèi)的細(xì)菌和真菌過度生長和/或病毒感染引起的消化失調(diào)(Eckel，1999)。
通常認(rèn)為，早期斷奶的動物的消化疾病主要是由于革蘭氏陰性菌，特別是大腸桿菌屬和沙門氏菌屬種(它們通常存在于動物的小腸內(nèi)或者可以通過飼料進(jìn)入胃腸道)引起的(Guillot，1989)。為了克服消化疾病(經(jīng)常引起動物中體重嚴(yán)重下降并且死亡率增加)的問題，通常是采用低劑量的藥用抗微生物物質(zhì)(例如抗生素)或治療劑量的抗生素(以前命名為“抗生素)補(bǔ)充到動物飼料中(Dupont和Steele，1987；Prescott，1997)。然而如今向飼料中加入抗生素日益受到關(guān)注(Guillot，1989；Barton，1998)。害怕發(fā)生用于人藥的最終手段的抗生素出現(xiàn)對這些抗生素的抗性的情況，這樣需要增加其劑量或者開發(fā)新的、更強(qiáng)的抗生素。還害怕生物在食用已用這些抗生素治療的動物之后可能出現(xiàn)抗性。現(xiàn)在化學(xué)物質(zhì)對環(huán)境干擾的關(guān)注和大多數(shù)這些抗生素已在歐共體受到禁止或者將來將要禁止的事實(shí)，證明需要起抗微生物劑作用的替代品(Muirhead，1998；Ross，1999)。
因此從所給實(shí)例可以得出，需要發(fā)現(xiàn)新的抗微生物劑代替已知的抗微生物劑并且同時代替受到禁止的抗生素，從而克服微生物(過快)生長并克服動物呈現(xiàn)的消化疾病。
另一目的是提供一種在胃中存在的低pH值下有活性的抗微生物飼料添加劑。這進(jìn)一步避免了消化疾病轉(zhuǎn)移到腸中。
在本文中，由于特定的中鏈脂肪酸MCFA(C6、C7、C8、C9和C10)可用作新型且創(chuàng)新的抗微生物劑，因此它們是一種有價(jià)值的替代品，以便控制微生物污染和生長以及隨后在胃腸道，尤其是在胃中產(chǎn)生毒素。
EP-A1-0 089 376描述了一種加速動物生長的飼料添加劑或飼料，含有至少一種脂肪酸鹽或至少一種脂肪酸鹽和糖的脂肪酸酯。在所述文獻(xiàn)中脂肪酸由約6-24個碳原子組成并且描述了非常寬廣的鏈長。沒有提供比該寬廣范圍效果更好的特定亞范圍。
EP-A1-0 519 458描述了一種家畜的飼料添加劑和家畜的飼料，包括(a)具有6-12個碳原子的中鏈脂肪酸的甘油三酸酯和(b)至少一種選自以下的物質(zhì)具有6-12個碳原子的中鏈脂肪酸、所述脂肪酸的甘油一酸酯和脂肪酸的甘油二酸酯。該組合物公開了脂肪酸的組合。
本發(fā)明的主要目的是提供一種更特定和更活性范圍的中鏈脂肪酸，它們具有提高的抗微生物性能，特別是組合的抗細(xì)菌和抗真菌性能。據(jù)信所述特定組合的活性出人意料地獲得一種有效的飼料添加劑，從而獲得一種提高的飼料轉(zhuǎn)化率(為食用的飼料重量/kg增加的體重)。
因此本發(fā)明提供了一種或多種C6-C10中鏈脂肪酸、鹽、衍生物或乳劑或其混合物用于抑制微生物污染、生長和隨后產(chǎn)生毒素的用途。優(yōu)選其范圍選自C8-C10，更優(yōu)選基本上等量的C8和C10乳劑。
知道脂肪酸及其皂的抗微生物效果已經(jīng)很長時間了并已由J.J.Kabara(1978)于″The pharmacological effects of lipids″中得到評論。在該評論中公開了在相應(yīng)系列的脂肪酸中，已發(fā)現(xiàn)殺菌效果隨鏈長增加而增加。大腸桿菌屬和志賀氏菌屬種呈現(xiàn)被適中濃度的含12個碳原子的月桂酸和含18個碳原子的硬脂酰脂肪酸的飽和皂殺死。鏈長為10-12個碳原子的脂肪酸呈現(xiàn)最佳的抗微生物活性，而具有4-10個碳原子的低級脂肪酸呈現(xiàn)沒有或者幾乎沒有殺菌效果。
在文獻(xiàn)中已公開了脂肪酸產(chǎn)生抗微生物活性的機(jī)理。目前接受的理論是脂類微生物細(xì)胞膜對未離解的脂肪酸可以透過，因此該脂肪酸能夠通過微生物細(xì)胞膜到達(dá)更堿性的內(nèi)部。由于細(xì)胞內(nèi)堿性較高，脂肪酸離解，因此細(xì)胞內(nèi)pH降低至低于其存活水平。因此該脂肪酸事實(shí)上起質(zhì)子層(protonophore)的作用，這樣向內(nèi)泄漏的H+增加并且H+的溢出太慢而不能使內(nèi)部的pH再次增加。使它們起質(zhì)子層的作用的脂肪酸的物理化學(xué)性能，可以改變并且取決于許多參數(shù)。這些參數(shù)的實(shí)例是脂肪酸的鏈長和pKa，以及物理化學(xué)環(huán)境、沉淀、作用位置的pH和決定脂肪酸通過該膜的微生物包膜的化學(xué)組成。在這一方面，根據(jù)本發(fā)明含8-10個碳原子的脂肪酸的較好性能歸因于微生物細(xì)胞膜對該脂肪酸的極度可透過性。這是十分出人意料的，因?yàn)镵abara(1978)公開了含有4-10個碳原子的低級脂肪酸顯示很小的殺菌活性。pH從6.5增加到7.5增加了含有6-8個碳原子的短鏈脂肪酸的最小抑制濃度，并降低了含12-14個碳原子的兩個中鏈脂肪酸(月桂酸、肉豆蔻酸)的最小濃度。
然而在Kabara(1978)中沒有教導(dǎo)含有8-10個碳原子的脂肪酸將能夠控制細(xì)菌。
C8-C10MCFA的這種特定抗微生物作用特別有效地組合抑制真菌、酵母和革蘭氏陰性菌。真菌可以包括以下屬曲霉屬(Aspergillus)、念珠菌屬(Candida)、頭孢霉屬(Cephalosporum)、鐮刀菌屬(Fusarium)、青霉菌屬(Penicillium)以及其它屬于不完全菌綱的真菌。酵母可以包括，糖酵母屬(Saccharomyces)和其它半子囊菌類(hemiascomycetes)(酵母類)。革蘭氏陰性菌包括大腸桿菌(Escherichia coli)、沙門氏菌屬(Salmonella sp.)、志賀氏菌屬(Shigella sp.)和其它革蘭氏陰性和大腸菌和酸敗菌(spoiler)。通過抑制生長和殺死微生物細(xì)胞，各種微生物不再能引起細(xì)胞內(nèi)在疾病和進(jìn)一步產(chǎn)生毒素。
從本領(lǐng)域其他人的這些結(jié)果和這些觀察，應(yīng)希望其它MCFA也可用于本申請。其它MCFA可以包括月桂酸(C12)和肉豆蔻酸(C14)。高達(dá)約100000ppm MCFA的濃度最后與其它(有機(jī))(脂肪)酸、抗微生物和添加劑，例如芳香劑...混合，可用于實(shí)現(xiàn)其特定目標(biāo)。已發(fā)現(xiàn)1200ppm的MCFA混合物特別適用(參見實(shí)施例)。
最后，MCFA(或其鹽或衍生物或混合物或其乳劑)通過殺死微生物細(xì)胞抑制微生物生長。
本發(fā)明尤其涉及特定小范圍的MCFA(C8-C9-C10)，特別是大約相等重量量的C8和C10適宜作為抗微生物劑。結(jié)果，污染期間、生物淤積期間、發(fā)酵期間、生態(tài)系統(tǒng)例如胃腸道中微生物的生長可以與使用傳統(tǒng)抗生素如丙酸、生長促進(jìn)劑和抗生素相比更溫和的方式加以控制。
用與甘油酯結(jié)合的MCFA、游離MCFA和/或用其鹽形式或作為該MCFA的乳劑獲得觀察到的效果。
為了更清楚地理解本發(fā)明，將參照以下實(shí)施例描述其優(yōu)選形式。
可能的用途是微生物污染是不利的并且必須監(jiān)控和控制的所有情況。為此，可以使用特定的MCFA以保護(hù)谷物生長、收獲和貯藏的植物，在粉狀和液體食品和飼料中，作為管和罐中的防腐劑(液體消毒)，在人保健(在腹瀉時或者作為呼吸疾病的氣溶膠或者在局部涂敷期間，例如用于傷口愈合和當(dāng)為陰道感染時、在皮膚病時、在口腔疾病時...)，在食品和飼料防腐時(水果、干酪、蛋糕、面包...)，在飲料中，在清潔(消毒)劑和洗滌劑中...。
下面幾個實(shí)施例將證實(shí)MCFA為50/50wt的C8和C10混合物的抗微生物效果的有效性。顯然，這些實(shí)施例將具有例證的目的并且不限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍是由其權(quán)利要求書定義的。


圖1顯示了OD600nm和大腸桿菌K88細(xì)胞的量之間的線性關(guān)系。
圖2顯示了在給藥MCFA之后作為時間(以天計(jì))的函數(shù)的對照動物中胃腸道不同部分的大腸桿菌計(jì)數(shù)(以log10CFU計(jì))。
圖3顯示了在給藥MCFA之后作為時間(以天計(jì))的函數(shù)的處理動物中胃腸道不同部分的大腸桿菌計(jì)數(shù)(以log10CFU計(jì))。
圖4顯示了在給藥MCFA之后作為時間(以天計(jì))的函數(shù)的對照動物中胃腸道不同部分的腸桿菌科計(jì)數(shù)(以log10CFU計(jì))。
圖5顯示了在給藥MCFA之后作為時間(以天計(jì))的函數(shù)的處理動物中胃腸道不同部分的腸桿菌科計(jì)數(shù)(以log10CFU計(jì))。
圖6顯示了在給藥MCFA之后作為時間(以天計(jì))的函數(shù)的對照動物中胃腸道不同部分的細(xì)菌總計(jì)數(shù)(以log10CFU計(jì))。
圖7顯示了在給藥MCFA之后作為時間(以天計(jì))的函數(shù)的處理動物中胃腸道不同部分的細(xì)菌總計(jì)數(shù)(以log10CFU計(jì))。
圖8顯示了在給藥MCFA之后作為時間(以天計(jì))的函數(shù)的對照動物中胃腸道不同部分的乳酸菌計(jì)數(shù)(以log10CFU計(jì))。
圖9顯示了在給藥MCFA之后作為時間(以天計(jì))的函數(shù)的處理動物中胃腸道不同部分的乳酸菌計(jì)數(shù)(以log10CFU計(jì))。
實(shí)施例1MCFA對真菌和酵母在pH4下的生長和存活的影響(主要為酸形式的MCFA)對以下六個真菌/酵母菌株進(jìn)行評價(jià)產(chǎn)黃青霉菌(Penicilliumchrysogenum)MUCL 28658、黑曲霉(Aspergillus niger)MUCL 19001、白色念珠菌(Candida albicans)MUCL 29800、尖鐮孢菌(Fusariumoxysporum)MUCL 781、產(chǎn)黃頭孢(Cephalosporum chrysogenum)MUCL9718和啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)MUCL 31497。每一菌株在25℃下于具有以下pH值和以下濃度的特定MCFA50％/50％wt(C8-C10)的P(馬鈴薯)D(葡萄糖)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)2400ppm(pH4.0)、1200ppm(pH4.0)、600ppm(pH4.0)、300ppm(pH4.0)、0ppm(pH4.0)、0ppm(pH7.0)。7天之后，評價(jià)所有發(fā)酵肉湯培養(yǎng)基的生長。為了測定抑制類型(殺死或靜止的作用模型)，進(jìn)行平皿計(jì)數(shù)。表1概括了生長結(jié)果。在300ppm的特定MCFA下并對所有微生物菌株而言，在PD瓊脂上平皿計(jì)數(shù)之后不能觀察到生長。
表1.真菌/酵母在不同濃度的MCFA下于pH4.0的生長(″+″生長，″-″不生長)。

從表1可以看出，特定MCFA(C8-C10)在pH4.0下對黑曲霉MUCL19001、白色念珠菌MUCL 29800、尖鐮孢菌MUCL 781和啤酒糖酵母MUCL31497具有抑制活性。這些菌株被殺死，使得生長受到抑制。產(chǎn)黃青霉菌MUCL 28658和產(chǎn)黃頭孢菌MUCL 9718在pH4下不生長(不是最佳pH范圍)。為此，對這兩種菌株不能得出結(jié)論。
實(shí)施例2MCFA對真菌和酵母在pH7下的生長和存活的影響(主要為鹽形式的MCFA)使用如實(shí)施例1所述相同的試驗(yàn)條件。然而，在本試驗(yàn)中，所有發(fā)酵肉湯培養(yǎng)基定在pH7.0。結(jié)果匯總于表2。菌株不生長的，細(xì)胞也被殺死(通過在PD瓊脂上平皿計(jì)數(shù)證實(shí))。
表2.真菌/酵母在不同濃度的MCFA下于pH7.0的生長(″+″生長，″-″不生長)。

從表2可以得出結(jié)論，使用特定的MCFA(C8-C10)對產(chǎn)黃青霉菌MUCL28658、黑曲霉MUCL 19001、白色念珠菌MUCL 29800、尖鐮孢菌MUCL781、產(chǎn)黃頭孢菌MUCL 9718和啤酒糖酵母MUCL 31497有抑制效果。同樣在這里，這些菌株被殺死，從而抑制了生長。
從實(shí)施例1和2可以得出結(jié)論，可以將特定MCFA(C8-C10)用作黑曲霉MUCL 19001、白色念珠菌MUCL 29800、尖鐮孢菌MUCL 781、啤酒糖酵母MUCL 31497、產(chǎn)黃青霉菌MUCL 28658、產(chǎn)黃頭孢菌MUCL 9718的非常有效的抗微生物劑。在廣泛的pH范圍內(nèi)觀察到該抗真菌效果。實(shí)施例3MCFA在早期斷奶的豬仔的體內(nèi)評價(jià)斷奶豬仔的胃腸道對大腸桿菌K88污染非常敏感。大腸桿菌K88污染主要導(dǎo)致腹瀉和能力降低(反應(yīng)在每日生長和飼料轉(zhuǎn)化上)。為了描述借助MCFA控制豬仔中大腸桿菌K88的污染，進(jìn)行以下試驗(yàn)。
制備根據(jù)本發(fā)明的混合物，它含有約40重量份的大麥、14重量份的小麥、10重量份的玉米產(chǎn)品、11重量份的大豆產(chǎn)品和20重量份的含有0.8重量份的具有8-10個碳原子的特定MCFA的飼料補(bǔ)充組合物。每克飼料中還加入108個致病菌(大腸桿菌K88)。
制備一對照飼料，它含有與上述混合物相同的組分，只是對照飼料不含特定MCFA。
在21天之后將一組10頭豬斷奶。所有豬自由地接受水和飼料。第一對照組(組1)喂食對照飼料。第二組(組2)喂食如上所述的本發(fā)明飼料組合物。
斷奶5天之后將所有動物屠宰。對每克胃內(nèi)容物的細(xì)菌數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)果匯總于表3。
表3.每克胃內(nèi)容物中的細(xì)菌數(shù)(以計(jì)數(shù)量的log計(jì))。

從表3看出，通過加入含有8-10個碳原子的MCFA，已在動物胃(酸性條件)中將細(xì)菌殺死。在80％喂食含有本發(fā)明飼料補(bǔ)充物的豬仔中，在胃中幾乎不能發(fā)現(xiàn)任何細(xì)菌，而用對照飼料在胃中僅能殺死20％的現(xiàn)有菌。
顯然，飼料中補(bǔ)充一種或多種含有8-10個碳原子的脂肪酸可以控制幼小動物的消化道中細(xì)菌的生長。最有可能該效果可以通過以下事實(shí)解釋由于這些脂肪酸存在于動物的胃中，產(chǎn)生一能夠調(diào)節(jié)和穩(wěn)定胃腸微生物區(qū)系的生理環(huán)境。這里已發(fā)現(xiàn)，含有8-10個碳原子的脂肪酸能夠殺死已經(jīng)存在于胃中的主要致病菌(例如大腸桿菌K88)，這樣可以阻止致病劑量的細(xì)菌向腸內(nèi)轉(zhuǎn)移并且可以防止胃腸道紊亂的發(fā)生。
而且從本實(shí)施例可以得出結(jié)論，MCFA能夠降低非常復(fù)雜環(huán)境下的大腸桿菌污染，所述復(fù)雜環(huán)境由非常復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)和有機(jī)和無機(jī)物質(zhì)、添加劑、芳香物....的復(fù)雜混合物組成。實(shí)施例4特定MCFA對動物行為的影響重復(fù)實(shí)施例3公開的試驗(yàn)。還發(fā)現(xiàn)用本發(fā)明飼料組合物喂食的這組豬顯示生長性能比對照組提高約7.5％。在55天齡豬仔的平均重量為約19kg。預(yù)期這些豬仔在其生活60天之前達(dá)到20kg的重量，這是長時間內(nèi)不能達(dá)到的目的。這意味著本發(fā)明的飼料組合物獲得較高的日生長。而且，由于對兩種飼料的飼料攝取非常相似，因此本發(fā)明的飼料組合物也獲得較低的飼料轉(zhuǎn)化率。
換句話說，可能通過調(diào)節(jié)胃腸道的微生物生態(tài)系統(tǒng)并通過MCFA非?？斓貜奈改c道吸收并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為能量(可為動物利用的)，可以將特定MCFA喂食給動物以便提高其行為(反應(yīng)在日生長和飼料轉(zhuǎn)化率上)。這樣，特定的MCFA可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)生長促進(jìn)劑。實(shí)施例5MCFA和粘菌素對控制大腸桿菌K88生長的比較將3個100ml發(fā)酵肉湯培養(yǎng)基(腦心浸劑)樣品等量接種有大腸桿菌K88的過夜培養(yǎng)物(豬仔胃腸道的致病菌)并在37℃下進(jìn)一步培養(yǎng)。測定600nm(OD600nm)下的光密度-它與大腸桿菌細(xì)胞的存在量成正比(
圖1)。一獲得OD600nm為0.2-0.5就(1)第一個樣品中什么都不加入，(2)向第二個樣品中加入12ppm的粘菌素和(3)向第三個樣品中加入1200ppm的MCFA(含50％具有8個碳原子的脂肪酸和50％具有10個碳原子的脂肪酸的混合物)的鈉鹽。
這些樣品在37℃、pH4.0下進(jìn)一步培養(yǎng)4小時。每小時測定其OD600nm。培養(yǎng)4小時之后取出樣品，為了記錄培養(yǎng)期間可能的pH變化，測定其pH。結(jié)果匯總于表4。表4.MCFA和粘菌素(陽性對照)對大腸桿菌K88的影響

*由MCFA引起的內(nèi)在濁度使得OD600nm值較高從表4看出，加入粘菌素，大腸桿菌的生長延緩56％，加入本發(fā)明的MCFA，大腸桿菌的生長延緩96％。由于這三個樣品的pH大致相同，因此本發(fā)明的MCFA的效果非常顯著?？梢缘贸鼋Y(jié)論，作為傳統(tǒng)抗生素的粘菌素能夠被MCFA有效地取代。實(shí)施例6MCFA(50/50 C8和C10)和可商購獲得的抗微生物劑的抗微生物活性的體外比較試驗(yàn)數(shù)量隨已知產(chǎn)品的零售商提供的技術(shù)信息而變化。其目的是評價(jià)C8/C10MCFA和可商購獲得的CRINA產(chǎn)品(Akzo Nobel產(chǎn)品)在胃中的抗微生物活性。使用4個試驗(yàn)物質(zhì)a.空白b.MCFA →8g/kg飼料c.CRINAHC 豬仔 →100mg/kg飼料d.CRINAHC 739→50mg/kg飼料e.CRINAHC 成豬/母豬 →75mg/kg飼料如下制備試驗(yàn)溶液。向1kg飼料(組成表5)中加入精確測定量的大腸桿菌K88。接著，產(chǎn)生20％飼料和80％生理溶液(0.85％生理鹽水)的懸液。為了模擬在胃環(huán)境中的20％懸液，用0.1HCl使pH為3.5-4.0。表5.試驗(yàn)飼料組成

現(xiàn)在將酸化懸液分散在100ml的樣品中。完成t＝0時的微生物計(jì)數(shù)。將樣品于37℃下培養(yǎng)3小時。3小時之后取出樣品并測定pH和微生物計(jì)數(shù)。在Coli ID培養(yǎng)基(Bio Merieux，42017)上對大腸桿菌菌株計(jì)數(shù)。
有計(jì)劃的觀察是a.t＝0時對照樣品(空白)和處理樣品的微生物計(jì)數(shù)b.t＝3小時時對照樣品(空白)和處理樣品的微生物計(jì)數(shù)。
表6描述了證明本發(fā)明MCFA(50/50 C8/C10)化合物在胃中抗微生物效力的有效性的計(jì)算結(jié)果。表6.在37℃和pH4.0下培養(yǎng)3小時之后不同處理對大腸桿菌的影響。這些值以log10CFU/ml溶液表示。

實(shí)施例7MCFA鹽水溶液和MCFA乳劑的抗微生物效力本實(shí)施例的目的是研究以飲用水中的鹽水溶液提供的C8和C10(等于50％wt)MCFA的混合物對小雞的畜牧學(xué)行為(生長、飼料轉(zhuǎn)化率、飼料攝取、死亡)的效力。
40只ROSS 308公雞放在4個不同柵欄中。隨意給予飲用水和飼料。試驗(yàn)耗時36天。在整個期間向所有小雞給予相同的飼料。飼料既不含任何生長促進(jìn)劑也不含抑球蟲劑(coccidiostaticum)。在試驗(yàn)期間對柵欄2、3和4提供C8-C10混合物的飲用水。柵欄1提供有純飲用水，柵欄2、3和4提供有依次為以下量的MCFA鹽0.5kg、1kg和2kg/1000L。
這些試驗(yàn)的結(jié)果列于表7、8、9、10和11。表7.0-12天的畜牧學(xué)結(jié)果

表8. 12-23天的畜牧學(xué)結(jié)果

表9.23-28天的畜牧學(xué)結(jié)果

表10. 29-36天的畜牧學(xué)結(jié)果

表11. 0-36天的畜牧學(xué)結(jié)果

*1DFI每日飼料攝取量*2BW體重*3DWG每日體重增加*4FCR飼料轉(zhuǎn)化率，為每公斤體重增加所消耗的飼料重量。
從表7-11可以看出，在頭3周內(nèi)在這4組中沒有顯示出特定的差異。然而顯然在第36天，在給予MCFA處理的3個柵欄中獲得較高的體重和較好的FCR。顯然本發(fā)明的特定MCFA組合物對小雞的畜牧學(xué)行為具有正面效果。
將MFCA(50/50wt C8-C10)以乳劑提供進(jìn)行另一試驗(yàn)。當(dāng)使用以鹽加入到飲用水中的MCFA高達(dá)幾公斤的較高濃度時，可能形成泡沫。為了避免這些問題，可以向飲用水中加入幾種消泡劑。然而，本發(fā)明出人意料地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的MCFA的特定部分可以較好地以乳劑形式呈現(xiàn)。這種方案避免了產(chǎn)生泡沫。
將其鹽形式(1200ppm)與使用共嵌段聚合物丙烯-乙烯作為黃原膠和水中的乳化劑的50％ MCFA乳劑(0.3％)比較進(jìn)行另一試驗(yàn)。顯然，可以選擇例如本領(lǐng)域已知的其它乳化劑。盡管其鹽形式獲得抗微生物效果，但是試驗(yàn)乳劑的活性要大幾倍。實(shí)施例8MCFA在豬上的用途本試驗(yàn)的目的是評價(jià)MCFA(50％/50％wt)在豬試驗(yàn)(從30到105kg)中的效果。
試驗(yàn)農(nóng)場位于West-Flanders并由2個區(qū)域組成，每個區(qū)域含有10個柵欄。
每個柵欄(2m×4m)內(nèi)有14頭豬。每個柵欄，在走廊側(cè)安裝有一飼料供應(yīng)器(隨意)。在柵欄的另一側(cè)供應(yīng)水(隨意)。小母豬和公豬混合。在整個試驗(yàn)期間，柵欄通風(fēng)。
飼料以這種方式供應(yīng)，在動物試驗(yàn)開始時對所有飼料的平均豬重/飼料是相似的(±30kg)。
在試驗(yàn)期間監(jiān)控以下飼料飼料1對照飼料2對照+0.1％ MCFA(生長階段)對照+0.05％ MCFA(成熟階段)觀察以下參數(shù)豬重和飼料攝取。
這些豬分別稱重為’30kg’、’50kg’和’100kg’。動物試驗(yàn)在2000年5月19日開始。所有豬分別稱重。第二次稱重在2000年6月26日進(jìn)行。最后稱重在2000年9月25日進(jìn)行。每頭豬按照其Sanitel號進(jìn)行追蹤。從所得數(shù)據(jù)(表12)可以獲得以下結(jié)論表12.接受不同膳食的豬生長重量膳食19/05/2000 26/06/200025/09/2000(開始) (最后生長階段)(最后成熟階段)1 29,80±5,6551,64±8,26105,06±15,302 29,94±4,9453,29±7,68104,87±15,04從表12看出，膳食2使得在生長階段生長最高。在試驗(yàn)結(jié)束時，該效果消失。似乎該MCFA可以有效地用作生長階段的生長促進(jìn)劑。
還記錄了飼料攝取/柵欄。在2000年6月26日，將最初(生長物)飼料改變并對豬進(jìn)一步喂食精制飼料。在生長階段和成熟階段測定飼料攝取/豬(表13)。從這些數(shù)據(jù)可以進(jìn)一步計(jì)算飼料轉(zhuǎn)化率(表14)。表13.接受不同膳食的豬的飼料攝取飼料 攝取(kg)/豬生長階段 成熟階段

表14.接受不同膳食的豬的飼料轉(zhuǎn)化率飼料轉(zhuǎn)化率生長階段成熟階段

從表13和14看出，向飼料中補(bǔ)充MCFA使得在結(jié)束階段飼料轉(zhuǎn)化率低。盡管MCFA對生長沒有任何影響，但是在成熟階段對飼料轉(zhuǎn)化率具有正面效果。
最后，MCFA可以有效地用作生長階段的“生長促進(jìn)劑，而該效果后來消失。實(shí)施例9MCFA的MIC值測定本試驗(yàn)轉(zhuǎn)包給University Gent。
進(jìn)行試驗(yàn)以測定通常與腸道有關(guān)的不同收藏的細(xì)菌菌株對MCFA的體外敏感性。產(chǎn)品對收藏菌株的最小抑制濃度(MIC)從0.25％到0.005％不同。在pH7.2，看到在低pH下厭氧生長的腸球菌(enterococci)的活性最高。注意到腸桿菌科(Enterobacteriaceae)和需氧生長的假單胞菌(Pseudomonas)的活性最低。
在該研究中包括17種收藏菌株，它們代表了各種兼性需氧生長的腸道菌(表15)。還測定了3種抗菌譜對照菌株金黃色葡萄球菌(S.aureus)ATCC 25922、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)ATCC29212和大腸桿菌(E.coil)25923。
在蒸餾水中制備3個10倍稀釋的10％產(chǎn)品懸液。為了獲得所需最終濃度，將1.5、0.75和0.36ml的這些稀釋物吸移到陪替氏培養(yǎng)皿中并小心地與熔融生長培養(yǎng)基混合。3個培養(yǎng)基使用pH為7.2的Mueller-Hinton II培養(yǎng)基(BBL)、pH6.2的MRS培養(yǎng)基(Oxoid)平皿和pH調(diào)整到4.6的MRS培養(yǎng)基。
將保存菌株于Columbia血液瓊脂平皿或MRS培養(yǎng)基上生長。由37℃下培養(yǎng)的過夜16-26小時肉湯培養(yǎng)物制備接種物。這些是通過適應(yīng)McFarland等級測定(bioMerieux)的光度計(jì)中于無菌鹽水中懸浮生長獲得的。將匹配0.5McFarland的溶液在鹽水中稀釋10倍并使用Denley多點(diǎn)接種器(Mast)接種在抗生素和對照平皿上。這樣，將約10,000菌落形成單位的每一菌株接種到這些平皿上。這些MRS平皿在H2+CO2環(huán)境中無氧培養(yǎng)。將Mueller-Hinton平皿有氧培養(yǎng)。
在37℃下培養(yǎng)2天之后進(jìn)行讀數(shù)。該MIC是以生長完全受到抑制或者幾乎完全受到抑制，因此生長或單菌落引起的模糊生長可忽略不計(jì)的最低濃度。
最小抑制濃度示于表1。僅4種乳酸桿菌菌株在pH4.6下生長得非常好。大多數(shù)腸球菌菌株的生長在該pH下生長相當(dāng)好，但是在其它培養(yǎng)基上差得多。剩余菌株沒有生長。除革蘭氏陰性的之外的所有菌株在MRS上于pH6.2下生長。乳酸桿菌在Mueller-Hinton瓊脂上僅呈現(xiàn)模糊生長。
所有分離物的MIC都位于0.25％-0.0025％ MCFA乳劑之間。產(chǎn)品于pH4.6下對能夠生長的腸球菌和乳酸桿菌活性最高。在最佳體外生長條件下該MIC從0.25到0.1％變化。
表15.MCFA對細(xì)菌菌株的體外抑制活性

實(shí)施例10MCFA對豬仔(7-20kg)的效力對腸桿菌的效力將是實(shí)施例10的目的。使用一群豬仔(7-20kg)評價(jià)50％MCFA的抗微生物活性。
將早期斷奶的豬(7kg)分2群各10個樣品放置。提供水和飼料隨意攝取。群體(C)提供有不含抗生素也不含生長促進(jìn)劑的基本飼料。
種群(B)給予補(bǔ)充有0.50％ 50％ MCFA乳劑(50/50 C8-C10，具有乳化劑共嵌段聚合物乙烯-丙烯)的基本飼料。對每一樣品，從對照和處理組分兩次選擇2個動物，并根據(jù)批準(zhǔn)的倫理過程進(jìn)行解剖。從胃腸道的以下幾個部分胃、十二指腸、回腸和盲腸的前面部分收集其內(nèi)容物。于胃腸道每一部位各制備兩個混合樣品分別用做對照和處理樣本并在4個不同的培養(yǎng)基上分析營養(yǎng)瓊脂，用于計(jì)數(shù)總污染物；紫紅色膽汁葡萄糖瓊脂，用于計(jì)數(shù)腸桿菌；大腸菌群ID，用于計(jì)數(shù)大腸桿菌；和Rogosa瓊脂，用于計(jì)數(shù)乳酸桿菌。
這些不同計(jì)數(shù)的結(jié)果描述于圖2-9。顯然，大腸桿菌和腸桿菌菌群降低，尤其是開始部分，它是胃腸道的最酸性部分。
圖8和9顯示了對微生物的出人意料的選擇效果。不想要的和可能的致病菌如大腸桿菌、腸桿菌的菌群基本上消滅掉。想要的菌種菌群如乳酸桿菌保持不受影響。
顯然，這些實(shí)施例僅是描述性的，并不限制本發(fā)明。本發(fā)明的飼料補(bǔ)充物的可能范圍的重量％以20-50％ C8、20-50％ C10和高達(dá)約100％的C6-C24的任何其它MCFA的混合物可能是適宜的。
對幾種這些飼料補(bǔ)充物進(jìn)行測定并且與用于引證的實(shí)施例中的標(biāo)準(zhǔn)50％/50％ C8-C10組合物相似地進(jìn)行。
使用后面的范圍也呈現(xiàn)了對特定菌株的出人意料的選擇作用。
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權(quán)利要求
1.一種或多種C6-C10中鏈脂肪酸(MCFA)、鹽、衍生物或其混合物用于抑制微生物污染、生長和/或隨后產(chǎn)生毒素的用途。
2.如權(quán)利要求1的用途，其中所述MCFA選自己(C6)酸、庚(C7)酸、辛(C8)酸、壬(C9)酸和癸(C10)酸。
3.如權(quán)利要求2的用途，其中所述MCFA選自辛(C8)酸、壬(C9)酸和癸(C10)酸。
4.如權(quán)利要求3的用途，其中所述MCFA選自C8和C10，優(yōu)選重量大致相等，更具體地說重量％是-20-50％ C8-20-50％ C10-和任選選自C6-C24的其它MCFA。
5.如權(quán)利要求1-4任意的用途，其中所述MCFA以甘油一酸酯、甘油二酸酯和/或甘油三酸酯存在。
6.如權(quán)利要求1-4的用途，其中所述MCFA是以乳劑或溶液存在的NH4+-、Na+-、K+-和/或Ca2+-鹽。
7.如權(quán)利要求1-6的用途，與其它MCFA如月桂酸(C12)和肉豆蔻酸(C14)、其它抗真菌劑或其它(有機(jī))(脂肪)酸或添加劑如香料和植物提取物組合。
8.如權(quán)利要求1-7任意的用途，用于對抗選自以下的真菌和酵母的生長青霉菌屬、曲霉屬、鐮刀菌屬、頭孢霉屬、糖酵母屬、念珠菌屬、以及其它不完全菌和半子囊菌類(酵母類)。
9.如權(quán)利要求1-7任意的用途，用于選擇性對抗革蘭氏陰性菌如大腸桿菌、沙門氏菌屬、志賀氏菌屬和其它革蘭氏陰性和大腸菌和食品/飼料酸敗菌的生長。
10.如權(quán)利要求8-9任意的用途，用于選擇性地控制和調(diào)節(jié)任何動物或人的胃腸道中的微生物生態(tài)系統(tǒng)。
11.如權(quán)利要求10的用途，其中所述動物處于其早期斷奶階段。
12.動物用飼料組合物，包括含選自辛(C8)酸和癸(C10)酸中的一種或多種中鏈脂肪酸(MCFA)、鹽、乳劑或其混合物的飼料補(bǔ)充物，其重量％為-20-50％ C8-20-50％ C10-和任選選自C6-C24的其它MCFA。
13.如權(quán)利要求12的飼料組合物，其中所述MCFA是NH4+-、Na+-、K+-和/或Ca2+-鹽或者存在于乳劑中。
14.如權(quán)利要求12或13的用途，其中所述MCFA濃度高達(dá)約100000ppm。
15.如權(quán)利要求14的用途，其中所述MCFA濃度是100-3000ppm，優(yōu)選約1200ppm。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種或多種C
文檔編號A01N37/02GK1437467SQ01811409
公開日2003年8月20日 申請日期2001年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月20日
發(fā)明者K·莫利, G·布魯格曼 申請人:營養(yǎng)科學(xué)公司