專利名稱：一種基于核酸的樹表型預(yù)測方法
背景技術(shù)：
a)發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明屬于分子生物學和樹改良、紙漿和紙張性質(zhì)評價領(lǐng)域，本發(fā)明可以更有效地從自然的和種植的樹木群中篩選有給定纖維性質(zhì)的樹用于特定紙漿和紙生產(chǎn)線。
B)背景技術(shù)很長時間以來，認為漸滲現(xiàn)象(一種自然形式的遺傳雜交)普遍出現(xiàn)在云杉屬植物物種北美云杉(Picea sitchensis)、白云杉(P.glauca)和恩格曼氏云杉(P.engelmannii)之間(Daubenmire，R.(1968)Can.J.Bot，46787-798)。這種雜交發(fā)生的區(qū)域被稱為“漸滲帶”，一個例子能在大不列顛哥倫比亞Nass Skeena過渡中找到(圖1)。在這個帶中出現(xiàn)了兩個主要的這種自然雜種群“interior”雜種(它主要是白云杉和恩格曼氏云杉的混合物)和interior與北美云杉的雜種(Sutton，B.C.S.，等，(1991)Theor.Appl.Genet.82242-248)，盡管此帶的準確范圍并不清楚，基因型的繼承(representation)(家系)也很難確定(Roche，L.(1996)NewPhytol.68505-554)。
已知interior和北美云杉被報道有本質(zhì)上不同的基本纖維特性-interior纖維細，2.0-3.5mm×25-30μm；北美云杉纖維粗，3.2-5.6mm×35-45μm(I senberg，I.H.Pulp woods of the unitedstate and canada，vol.I-Softwoods.第3版.Inst.Pap.Chem.Appleton，WI(1981))-可以合理地推想，在漸滲帶發(fā)現(xiàn)的雜種樹可能遺傳了這些特性，并不同程度地依靠于物種之間雜交的程度。
為了表征這些區(qū)帶并測試是否自然遺傳雜交對這些樹的木材質(zhì)量產(chǎn)生影響，一種重要的前提條件是，開發(fā)以逐株樹為基礎(chǔ)確定區(qū)帶內(nèi)雜交程度的方法。通常，樹木的鑒定是以總體形態(tài)學性狀的視覺檢驗為基礎(chǔ)來做的。然而，這個技術(shù)當企圖區(qū)分關(guān)系很相近、但遺傳學上顯著不同的雜種時，可證明是不準確的。同功酶分析等方法也有一些用途，但是它很費時費力，并缺少能區(qū)分有很近關(guān)系克隆的精確性(Murphy，R.W.Protein IIsozyme electrophoresis，InHillis，D.M.；Moritz，C.，編.Molecular Systematics.Sunderland，MA，U.S.A.Sinauer Associates，45-126(1990))。區(qū)別雜種樹木的好得多的方法是基于DNA多型性(每株樹具有的基因結(jié)構(gòu)的微小改變)來區(qū)分的方法(Potter，S.(1998)PPR 1356)。
在先的研究已經(jīng)報道了基于細胞器(葉綠體和線粒體)遺傳模式對interior和北美云杉的物種特異性DNA探針的分離(Sutton，b.c.s.等，(1993)Can.J.For.Res.24278-285)，這可以用于在interior/北美云杉基礎(chǔ)上對克隆作指紋分析。但這些探針給不出在漸滲的克隆中雜交程度的信息。基于核酸序列的探針也已經(jīng)取得了不同的成功——例如，已知紅、黑云杉(red and black spruce)核糖體DNA(rDNA)區(qū)域顯示一些多態(tài)區(qū)域的種內(nèi)變異，這已經(jīng)被用于產(chǎn)生種特異性RAPD標記。這些標記本質(zhì)上基于其一般適用性(即跨物種時)難以確定的隨機序列(Bobola，M.S.等，(1992)Mol.Biol.Evol，9125-137；Perron，M.等，(1997)Molecular ecology 6725-734)。
與對紅、黑云杉報道的情形相反，本發(fā)明描述了一種用于(Nass-Skeena漸滲帶中的)interior/北美云杉雜種的核酸探針，它能定量評價在兩物種間遺傳雜交的程度。這個探針，Eco2.0，基于一段釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)18S rDNA，并以定量方式檢測光密度圖像分析(densitometric image analysis)確定的種特異性18S外部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(external transcribed spacer，ETS)多形性。
提供一種新的方法來鑒定具有優(yōu)良表型的樹木譜系，是有很大需求的。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的之一是提供鑒定具有優(yōu)良表型的個體樹木的方法。
依照本發(fā)明，提供了Eco2.0探針，它的純化和序列表征，以及它作為在Nass-Skeena帶中個體雜種漸滲程度標記的用途。
a)Eco2.0探針被分離并被克隆進大腸桿菌(E.coli)。
b)該探針被純化并被部分地測序以確定其同一性。
c)通過直接比較從橫跨Nass-Skeena漸滲帶的地理區(qū)域中選擇的個體樹木樣品的Southern印跡帶強度型式和纖維性質(zhì)參數(shù)，評價了該探針作為雜種纖維質(zhì)量的標記的有用性。
依照本發(fā)明，提供了鑒定能表達希望的生物學和/或生物化學表型的樹木譜系的方法，包含以下步驟a)從純種和/或其雜種的樹木中獲取核酸樣品，如DNA或者RNA；b)通過將步驟a)的所述核酸樣品用至少一種限制酶處理獲得限制性片段的限制圖譜，其中所述限制酶使純種和/或其雜種的所述限制圖譜之間的差異最大化；c)通過將步驟b)的處理過的核酸樣品與至少一個標記的探針例如但不限于Eco2.0作用，以使所述探針和所述核酸樣品間互補雜交，來顯現(xiàn)步驟b)的所述限制圖譜，其中所述的探針允許檢測雜交程度和/或純種和/或其雜種樹木間的所述限制性片段的不同強度；和d)將步驟c)的所述限制圖譜和/或限制性片段強度與所述樹木的至少一種選擇的生物學和生物化學表型相關(guān)聯(lián)，其中所述表型和與所述表型相關(guān)聯(lián)的遺傳座位相聯(lián)系。
步驟d)可以進一步包括預(yù)測所述限制圖譜和/或限制性片段強度與所述表型之間關(guān)系的標準曲線。
純種和/或其雜種樹木可以是自然或者人工產(chǎn)生的。
步驟a)所述的核酸樣品可以從葉、形成層、根、芽、莖、木栓、韌皮部或木質(zhì)部獲得。
所述樹木可以是云杉屬(Picea)的，或者可以是選自楊屬(Populus)、樺木屬(Betula)、冷杉屬(Abies)、落葉松屬(Larix)、紅豆杉屬(Taxus)、榆屬(Ulmus)、李屬(Prunus)、櫟屬(Quercus)、蘋果屬(Malus)、草莓樹屬(Arbutus)、柳屬(Salix)、懸鈴木屬(Platanus)、槭屬(Acer)、鐵杉屬(Tsuga)、黃杉屬(Pseudotsuga)、松屬(Pinus)、梣屬(Fraxinus)、桉屬(Eucalyptus)、金合歡屬(Acacia)、相思子屬(Abrus)、柏木屬(Cupressus)、水青岡屬(Fagus)、刺柏屬(Juniperus)、崖柏屬(Thuja)和Canya的屬的。
步驟c)可以還包括測量所述限制性片段的強度。
所找尋的生物的或生物化學的表型可以例如選自纖維長度，木材密度，纖維崩散性(collapsibitity)，纖維粗度，細胞壁厚度，生長速率，木質(zhì)素含量，愈創(chuàng)木基木質(zhì)素含量，丁香基木質(zhì)素(syringyllignin)含量，碳水化合物含量，牛皮紙漿產(chǎn)率，機械紙漿能量需要，化學制漿的化學藥品攝取(chemical uptake for chemical pulping)，提取物含量(extractive content)和提取化合物。
本發(fā)明還提供了通過將純種和/或其雜種樹木的核酸樣品用至少一種限制酶處理獲得的限制性片段圖譜用于鑒定能表達希望的生物學和/或生物化學表型的樹譜系的用途，其中所述限制酶使純種和/或其雜種的所述限制性片斷圖譜之間的差異最大化。
本發(fā)明還提供了通過將純種和/或其雜種樹木的核酸樣品用至少一種限制酶處理獲得的限制性片段圖譜，用于鑒定能表達希望的生物學和/或生物化學表型的樹譜系，其中所述限制酶使純種和/或其雜種的所述限制性片斷圖譜之間的差異最大化。
更進一步，本發(fā)明提供了篩選大量各種表型的樹的方法，包括以下步驟a)表征具有不同程度雜交的至少兩株樹的木材質(zhì)量；b)從所述樹建立用于預(yù)測限制圖譜和表型之間關(guān)系的標準曲線；c)評價大量自然種間雜種(species hybrids)的大量雜交標記的限制圖譜；d)將所述雜種的所述限制圖譜和所述標準曲線比較，來推斷所述雜種的表型；和
e)根據(jù)預(yù)測的表型收獲所述雜種。
本發(fā)明也提供了生產(chǎn)大量具有可預(yù)測的、一致的和/或增強的木材或者纖維質(zhì)量特性的克隆樹木的方法，包括以下步驟a)表征具有不同程度雜交的至少兩株樹的木材質(zhì)量；b)從所述樹建立用于預(yù)測限制圖譜和表型之間關(guān)系的標準曲線；c)評價大量自然種間雜種(species hybrids)的大量雜交標記的限制圖譜；d)將所述雜種的所述限制圖譜和所述標準曲線比較，來推斷所述雜種的表型；e)通過實施異花傳粉或者體細胞胚胎發(fā)生從所述親代樹木獲得大量后代樹木；和f)繁殖在步驟e)獲得的所述后代樹木的體細胞胚來產(chǎn)生大量克隆的樹木，基本上所有所述的克隆樹木都有可預(yù)測的、一致的和/或增強的木材或者纖維質(zhì)量特性。
本發(fā)明進一步提供了由本發(fā)明方法產(chǎn)生的具有增強的木材或者纖維特性的克隆樹木的植物群叢(stand)，其中所述樹木的基因組包含了如下限制圖譜，所述的限制圖譜是與所述增強的木材或者纖維特性相聯(lián)系的相同限制圖譜。
根據(jù)本發(fā)明，Eco2.0探針也可以被用做預(yù)測純種或者其雜種的樹樣品的纖維質(zhì)量的標記。
為了本發(fā)明的目的，對下列術(shù)語進行定義。
術(shù)語“座位”是指在染色體上代表特定性狀的基因所占據(jù)的位置?；虻母鞣N替代形式——也就是在作圖中使用的等位基因——都定位在相同的位置。
術(shù)語“限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)”在這里的意思是確定DNA中線性系列位點的限制圖譜，這些位點在核酸序列上以實際長度彼此間隔開來。任何序列的DNA都可以獲得限制圖譜，而無論其中是否鑒定到突變，或者實際上我們是否了解其功能。兩個個體的限制圖譜的不同可以以與任何其他標記完全一樣的方式被用做遺傳標記。為了將限制圖譜與遺傳圖譜相關(guān)聯(lián)，我們必須比較野生型和相應(yīng)的變異體的限制圖譜，或表型。
術(shù)語“限制性片段”在這里的意思是指在純化的核酸用限制酶進行消化后產(chǎn)生的核酸片段。限制性片段可以被認為是限制性標記，這并不限于影響表型的那些改變，它們提供了在分子水平鑒定遺傳座位的極有效技術(shù)的基礎(chǔ)。
術(shù)語”雜交”或者復(fù)性，在這里使用的意思是兩條分開的互補鏈重新形成雙螺旋的能力。復(fù)性取決于互補的兩條鏈間的特異性堿基配對。反應(yīng)分兩個階段發(fā)生。第一階段，溶液中的DNA單鏈隨機地相互碰撞；如果它們的序列是互補的，兩個鏈堿基配對形成一個短的雙螺旋區(qū)。然后堿基配對區(qū)域沿分子通過拉鏈樣效應(yīng)延伸，從而形成長的雙螺旋分子。復(fù)性描述了通過變性而分開的兩個互補序列之間的反應(yīng)。然而，該技術(shù)可以擴展至允許任何兩個互補的核酸序列相互退火從而形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。當涉及兩個不同來源的核酸時，例如一個制品由DNA組成而一個制品由RNA組成的情形，該反應(yīng)通常稱為雜交。兩個核酸制品雜交的能力是表明它們序列互補性的精確測試。
術(shù)語“預(yù)測的關(guān)系”在這里是指以在i)限制圖譜和/或限制性片段強度與特定表型之間；或ii)“隨機擴增的多態(tài)性DNA”(RAPD)圖譜與特定表型之間建立的標準曲線為基礎(chǔ)的相關(guān)因子。
術(shù)語“其雜種”在這里的意思是指由不同品種、變種、種的樹經(jīng)雜種繁殖產(chǎn)生的后代，特別是通過為獲得特定遺傳或者表型特征而進行樹木雜交育種產(chǎn)生的那些。其雜種是通過對兩個不同樹種雜交育種而得來。


圖1大不列顛哥倫比亞云杉物種分布圖解圖，表明了Nass Skeena過渡漸滲帶；圖2該漸滲帶中的采樣森林生境(site)圖。黑色和灰色的圓圈表明先前研究的采樣森林生境。紅色圓圈指示本研究的采樣森林生境；
圖3ApEco2.0質(zhì)粒圖解圖。多克隆位點區(qū)被放大以表示限制酶位點的精確順序。并指明2kb酵母rDNA探針在其中的插入點；圖3B顯示該質(zhì)粒和探針插入片斷的瓊脂糖凝膠分析。泳道在文中描述。C使用M13 F/R引物的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠分析。泳道從左到右為分子量標準和使用不同專有緩沖液的PCR產(chǎn)物；圖4顯示2kb酵母rDNA探針的序列。粗體序列表示探針，其末端被確定并發(fā)現(xiàn)與GENEBANK Z73326相同；圖5顯示了使用M13r(反向)和f(正向)引物對Eeo2.0質(zhì)粒進行的序列分析；圖6B圖，探針與interior和北美云杉的雜種的總DNA消化物雜交的Southern條帶圖譜和光密度分析。泳道在文中說明。*森林生境2的樣品裝載不足。在文中，所見條帶從上至下被稱為條帶1-5。A和C圖顯示純種的典型條帶圖譜和這些圖譜的光密度分析；圖7顯示纖維特性是樹齡的函數(shù)。選擇60-80年的類群用來比較，因為這一范圍所有的樣品都沒有中心木質(zhì)部(juvenile wood)；圖8纖維的粗度對長度加權(quán)纖維長度(length-weighted fibrelength)的作圖，表現(xiàn)出很強的正相關(guān)；圖9顯示纖維特性、森林生境指數(shù)、條帶強度數(shù)據(jù)的散點圖矩陣(scatterplot matrix)；圖10顯示在云杉雜種中條帶強度和長度加權(quán)纖維長度(LWFL)之間關(guān)系。條帶2和LWFL之間表現(xiàn)出極好的線性關(guān)系；圖11顯示從印跡1(圖5)獲得的條帶2的相對強度和長度加權(quán)纖維長度之間關(guān)系的標準曲線。虛線表示纖維長度預(yù)測分析中使用的印跡2上探測到的云杉樣品條帶2強度值；圖12用于纖維長度預(yù)測實驗的第二個雜交分析(印跡2)。條帶2被標出。泳道1，pEco2.0質(zhì)粒插入片斷陽性對照；泳道2，Nass-Skeena“黑云杉”樣品；泳道3-8，樹7-9，6-4，5-8，4-5，2-4；和圖13纖維長度作為森林生境生產(chǎn)能力的函數(shù)顯示沒有全面相關(guān)。特定的生物地理氣候區(qū)被描繪為突出了可能的區(qū)帶內(nèi)相關(guān)性。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了一種新的使用DNA探針為已知紙漿和紙張生產(chǎn)線預(yù)測所選表型和快速選擇優(yōu)等樹木的方法。該方法包括從云杉活組織中分離樹木的基因組DNA，將該基因組DNA與DNA探針雜交，對獲得的雜交圖譜的強度進行光密度評價。
本發(fā)明的一個特定實施方案是測定雜種群體中兩個親本物種的遺傳混合(或漸滲)的確切程度。由于——例如在雜種云杉群體中——在遺傳漸滲程度和纖維長度之間的線性關(guān)系(就本發(fā)明而言)，DNA探針雜交圖譜的強度可以用于直接、精確并可重復(fù)地預(yù)測群體中單個北美云杉/interoir云杉雜種(對于給定的樹木年齡)的纖維長度。
本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案是使用DNA探針在林業(yè)樹木改良項目中作為預(yù)測工具，因為它是這種應(yīng)用的第一個成功實踐證據(jù)。
本發(fā)明的一個實施方案是提供一種快速評價各種林木物種的纖維質(zhì)量的新技術(shù)。
盡管本發(fā)明有可能適用于所有的林木物種，但本發(fā)明的另一個特定實施方案是本發(fā)明在雜種云杉上的具體應(yīng)用。
這里描述的本方法發(fā)明的一個實施方案涉及基于DNA的測試——就對于使木材適合于各種緊密材和紙漿及紙張生產(chǎn)用途重要的所有木材質(zhì)量參數(shù)進行測試，該測試使得可以加快對自然種群的評價過程并使得可以及早篩選出用于造林的原種株系。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，對于測量起來困難和昂貴的性狀(木材的質(zhì)量性狀是一個非常好的例子)，基于核酸的測試在選擇優(yōu)等樹木種類時降低費用及提高產(chǎn)量方面具有高度增加的能力。材料和方法跨漸滲帶采取樹木樣品并進行森林生境評價利用Sutton等先前的報道作為指導(dǎo)(Sutton，B.C.S.等，(1993)Can.J.For.Res.24278-285)，基于期望的云杉物種(純種北美云杉云杉，北美云杉和interior雜種，interior云杉——圖2)和立地品質(zhì)跨漸滲帶自西向東鑒定到七個森林生境位置。通過考察森林生境位置、樹的總體形態(tài)學并通過球果(cone)的鑒定來確定樹種。每個云杉物種的球果和鱗(scales)在大小和形狀上不同(Farrar，J.L.Trees in Canadian.Fitzhenry and Whiteside，Ltd.and CanandianForest Service，第95-107頁(1997))。雜種的樹木外觀(輪廓)和球果表現(xiàn)出親本物種的特征，但是真正物種鑒定和雜交程度很難通過這樣的粗放方法確定。就立地品質(zhì)而言，以物種的平均或者典型的森林生境作為目標。
生態(tài)系統(tǒng)，即生物和它們的物理/化學環(huán)境的相互作用復(fù)合體，被劃分為生物地理氣候區(qū)，生物地理氣候區(qū)可以進一步分為亞區(qū)(Steen，D.A.等，(1997).A field guide to forest site identification andinterpretation of the Cariboo forest region.B.C.Ministry ofForests，Victoria，B.C.Land management handbook No.39)。大不列顛哥倫比亞被分為13個生物地理氣候區(qū)，這些區(qū)是有著大致相似的大氣候的大地理區(qū)域(Forestry undergraduate society，Uni.Brit.Col.Forestry handbook for British Columbia，第4版.D.W.Friesen and son Ltd.223-231頁(1983))。利用用于森林生境鑒定和分析的生物地理氣候生態(tài)系統(tǒng)分類(BEC)法來確定區(qū)域內(nèi)的立地品質(zhì)。該方法利用植被、土壤、氣候、地形來分類生態(tài)系統(tǒng)和評價立地品質(zhì)(Banner.A.等，(1993)，A field guide to site identificationand interpretation for the Prince Rupert forest region.B.C.Ministry of forests，Victoria，B.C.Land management handbookNo.26)。從估計的土壤濕度和土壤養(yǎng)分季節(jié)變化特征(regimes)確定森林生境系列(site series)。然后這通過評價森林生境指數(shù)與森林生境生產(chǎn)能力(site productivity)(SIBEC)相關(guān)連。森林生境指數(shù)——群落地段(stand)生產(chǎn)能力的量度——提供了森林生境之間生產(chǎn)潛力的標準化比較，并且也通過森林生境指數(shù)曲線法來確定，這種方法是50年胸高年齡的樹高的測量(How to determine site indexin silviculture.Participants work book，B.C.Ministry offorests，F(xiàn)orest renewal B.C.(1998))。
平均地，橫跨一系列生物地理氣候區(qū)從每個森林生境取10棵樹作為樣品。采樣包括采集樹葉樣品、測量樹高和胸高處的直徑(DBH)和在胸高處取5mm和10mm的生長核(increment core)樣品。纖維特性分析從10mm的生長核樣品確定云杉纖維特性。將來自每個森林生境的至少一個樣品依照年齡分類，來監(jiān)視纖維特性在時間上的變化，并確定每一個被研究物種/雜種的幼齡材(juvenile wood)/成熟材(naturewood)轉(zhuǎn)變點(transition point)。對于所有其他樣品，僅檢查60-80年年齡類別，因為這被確定處于各個森林生境的成熟材帶。使用過氧化氫/乙酸浸解技術(shù)(Burkart，L.F.(1966)For.Prod.J.1652)從樣品釋放纖維，并將所得木漿使用自動纖維質(zhì)量分析儀進行分析，依據(jù)先前描述的方案(Morrison，D.等，(1998)Paprican PPR1403)來確定長度加權(quán)纖維長度(LWFL)和纖維粗度。基因組DNA和Eco2.0探針的分離雜種和純種的北美云杉和interior云杉的基因組DNA使用FastPrep儀器(Bio 101 Inc.)根據(jù)制造商的標準程序獲得。依照Sambrook等(Sambrook，J.等，(1990)Molecular Cloning.ALaboratory Mannual，第2版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress)描述的方法分離、純化含Eco2.0 rDNA探針的質(zhì)粒(pEco2.0-由C.H.Newton，B.C.Research Inc.，Vancouver惠贈)并克隆進大腸桿菌中。限制酶消化云杉的基因組DNA樣品和pEco2.0都根據(jù)Hanish和McClelland的方法(Hani sh，J.等，(1988)Gene Anal.Tech.5105)分別用合適的限制酶消化(分別是HinD III和Eco R I)。約25ng DNA在KGB緩沖液(1M谷氨酸鉀，250mM的Tris-乙酸pH7.5，l00mM乙酸鎂，0.5mg/ml的BSA組分5，5mM的β-硫基乙醇)中與1單位限制酶在37℃溫育2小時，使用0.5M的EDTA終止反應(yīng)。根據(jù)Sanbrook等(1990)描述的方法在1％的瓊脂糖凝膠上分析消化物。聚合酶鏈式反應(yīng)根據(jù)標準的RAPD程序使用M13正向和反向引物進行PCR反應(yīng)。Southern雜交根據(jù)Sutton等(1991)使用ECL檢測系統(tǒng)(Amersham)進行Southern印跡和Eco2.0雜交。光密度分析使用AlphaInnotech AlphaImager 2000整理和分析系統(tǒng)進行放射自顯影后的條帶定量。使用“1-D multi”菜單，對每個條帶的全部區(qū)域獲取、測量和評價積分光密度(OD)和其占泳道中所有條帶的百分比值。DNA測序由大不列顛哥倫比亞大學的生物技術(shù)實驗室核酸和蛋白質(zhì)服務(wù)部根據(jù)標準的雙脫氧核苷酸終止法進行質(zhì)粒pEco2.0的末端測序。由于pEco2.0是基于pUC18載體構(gòu)建的，故使用標準的M13正向和反向引物作為測序引物。結(jié)果和討論pEco2.0的純化和分析圖3A顯示了基于pUC18的質(zhì)粒pEco2.0和探針在多克隆位點(MCS)插入的插入位點的圖解。在圖3的B部分，提供了純化的質(zhì)粒和其消化產(chǎn)物的1％瓊脂糖凝膠分析。泳道1為100bp分子量標準(Pharmacia-Amersham)；泳道2為純化的pEco2.0(上面的帶為超螺旋形式的質(zhì)粒)；泳道3為使用限制酶Eco R I對pEco2.0進行完全消化以釋放2kb酵母rDNA探針片段。分析結(jié)果表明質(zhì)粒達到了足夠用于制備探針和進行測序反應(yīng)的純度。圖3C表示使用質(zhì)粒pEco2.0作為模版和使用M13正向和反向引物進行PCR擴增的實驗。圖4表示來自GENBANK acc#Z73326的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)染色體XII粘粒閱讀框ORF YLR154c片段。Eco2.0探針的全序列以粗體突出顯示。圖5顯示使用M13正向和反向引物獲得的pEco2.0質(zhì)粒的序列分析結(jié)果。北美云杉/interior云杉rDNA多態(tài)性的表征為確證2kb酵母rDNA片段能夠用于區(qū)分北美云杉和interior云杉物種的觀點，按先前所述使用HinD III消化后的總DNA進行的Southern雜交。使用FastPrep儀器標準程序從樣品樹木的活組織獲得基因組DNA樣品。圖6表示使用純化的2.0kb rDNA探針和HinD III消化的基因組DNA樣品獲得的典型Southern雜交，所述基因組DNA樣品取自橫跨所述區(qū)帶采樣的樹。泳道(由左至右)森林生境1/樹木4，2/5*，3/4，4/9，5/2，6/1，7/3(*樹2/5不包括在分析中，因為重復(fù)的分離沒有產(chǎn)生活的DNA)清楚地，pEco2.0 rDNA探針檢測到在北美云杉和interior樹種上明顯不同的云杉DNA多態(tài)區(qū)域。Interior樣品在與探針進行雜交后產(chǎn)生強度不同的5個條帶，而北美云杉樣品則只產(chǎn)生3個條帶。可診斷北美云杉的條帶4和條帶5，可以被用于與線粒體和葉綠體特異的DNA標記一起來明確地區(qū)分物種。然而，條帶1、2和3是兩物種共有的，但以不同的相對強度存在(圖6)。然后條帶2的光密度分析被用于評價跨區(qū)帶采樣的雜種樹顯示的漸滲程度。
為比較雜種樹木的纖維特性，必須通過監(jiān)視纖維特性隨年齡的變化確定幼齡材成熟材的轉(zhuǎn)變點。這顯示在圖7中。毫不令人驚訝，幼齡材成熟材的轉(zhuǎn)變點在一定程度上取決于森林生境/雜交。然而，通過選擇60-80年的年齡(圖7中灰色區(qū)域)，可能直接比較這些樣品。觀察到的纖維長度的范圍為從西部的3.34mm到東部的2.33mm(N.B.—這些纖維長度值是從生長核樣品得到的，因此比實際的長木(wholelog)值小。在圖8中將本研究檢測的所有54株樹中獲得的這些長度加權(quán)纖維長度值(60-80年)對相應(yīng)的纖維粗度值作圖。纖維粗度，即重量與長度的比值，是細胞壁厚度的間接量度，因此是纖維可壓度(collaps ibility)的一個重要參數(shù)。在一個樹種中，可以預(yù)期，在長度和粗度之間應(yīng)當存在正線性相關(guān)，也就是，短纖維比較細，而長纖維應(yīng)當比較粗。圖8證明這對于漸滲帶群體是正確的，觀察到有很強的正相關(guān)(Pearson系數(shù)0.74，p＝0.000)。
用于通過DNA探針技術(shù)進行基因組雜交的特定樹木的纖維參數(shù)如表1。
表1所采集的云杉雜種的纖維特性、條帶強度和森林生境指數(shù)值

*因為樹太年幼(55年)而不適用于分析這些數(shù)據(jù)然后與從Southern雜交獲得的條帶的條帶強度相比較，所得圖全部顯示在圖9中(表2表示圖9的Pearson相關(guān)矩陣)。圖10顯示了一個這樣的纖維長度和條帶強度的相關(guān)性的圖?？梢钥闯觯谒星樾沃?，所選樹的(從DNA探測)估計的遺傳漸滲水平和測量的纖維特性之間存在線性關(guān)系(示例性的相關(guān)系數(shù)纖維長度與條帶2強度(不包括森林生境1異常值)為-0.876；纖維粗度與條帶3強度為0.843)。表2包括森林生境1異常值點(不包括森林生境1)的圖9的Pearson相關(guān)矩陣

從圖6顯示的第一個印跡獲得的數(shù)據(jù)被用于形成跨漸滲帶的相對條帶強度(積分的光密度占泳道中總信號的相對百分比)與長度加權(quán)纖維長度的相關(guān)性標準曲線，圖11。然后使用七個森林生境中六個的不同樣品進行第二個印跡實驗，獲得了相對百分比條帶強度(圖12)。選擇條帶2的強度——因為在第二個印跡上條帶2是最清楚的條帶并且在第一印跡上與纖維長度表現(xiàn)出很好的正相關(guān)——并將從每一個云杉樣品獲得的強度值內(nèi)插至標準曲線上以預(yù)測相應(yīng)樹的長度加權(quán)纖維長度值。然后將預(yù)測的纖維長度值與獲自對樣品樹木核(cores)的FQA分析的實際纖維長度值比較，比較結(jié)果在表3中給出。除一個異常，即森林生境4樹5外，可以清楚地看出，基于DNA的預(yù)測分析在這特定性狀上有可重復(fù)的準確性。表3使用DNA探針條帶強度預(yù)測雜種云杉纖維長度

使用印跡1的條帶2強度數(shù)據(jù)產(chǎn)生線性回歸。然后用該線性回歸內(nèi)插印跡2條帶2強度數(shù)據(jù)，得到注明的相應(yīng)預(yù)測纖維長度。實際纖維長度是如文中所述從浸解的核心測定的。
現(xiàn)在必須進行進一步研究檢驗這種現(xiàn)象是Nass-Skeena帶內(nèi)特定雜種特有的，還是可以普遍適用于任何雜種，而只要構(gòu)成該雜種的兩個純種之間感興趣的性狀存在顯著的差異。然而，值得注意的是，在第二個印跡上(圖12)，泳道2含有形態(tài)學上鑒定為從N ass-Skeena內(nèi)森林生境上獲得的黑云杉樣品的樹的基因組DNA。這個DNA在用Eco2.0探針檢測時得到的條帶圖與來自B.C.的interior云杉樣品的條帶圖一致，這表示該探針可能也能區(qū)分其他云杉種的雜種。
先前對interior B.C.物種如亞高山冷杉上的研究表明在65-85年的年齡類別中以森林生境指數(shù)測量的立地品質(zhì)和纖維特性之間存在統(tǒng)計學上顯著的正相關(guān)(Watson，P.A.，等，(Oct.1999)Paprican PPR1454)。在這個研究中，生物地理氣候亞區(qū)，因而也是立地品質(zhì)的變異是顯著的，顯示在表4中。
表4立地品質(zhì)數(shù)據(jù)

*根據(jù)野外指南的云杉物種纖維長度(60-80年)被作為森林生境指數(shù)的函數(shù)繪于圖13。顯然，橫跨生物地理氣候區(qū)森林生境生產(chǎn)能力和纖維長度之間不相關(guān)，這表明這些雜種間的遺傳差異掩蓋了任何顯著的大環(huán)境影響。
這個研究獲得的結(jié)果，證實了基于核DNA的探針作為標記系統(tǒng)來檢測一些有商業(yè)價值的森林物種間遺傳雜交程度的有用性。然而更重要的是，它們還提示，這樣的探針也可以以評價和預(yù)測的方式用作物種內(nèi)與工業(yè)相關(guān)的木材質(zhì)量參數(shù)的標記。如果發(fā)現(xiàn)在許多物種間可以普遍適用，DNA標記系統(tǒng)如這里描述的DNA標記可能成為快速評價自然種群和在種植計劃實施前篩選欲采伐樹木、體細胞胚等的木材質(zhì)量潛力的一個有很有價值的工具。
盡管本發(fā)明是聯(lián)系具體實施方案一起描述的，但應(yīng)該理解，本發(fā)明能被進一步修改，而且本申請旨在包括一般地遵循本發(fā)明原理的本發(fā)明任何變化、用途、或調(diào)整，并包括不同于本公開而屬于本發(fā)明所屬領(lǐng)域已知或常規(guī)實踐內(nèi)，可具有上文所述基本特征及落在以下權(quán)利要求書的范圍內(nèi)的那些內(nèi)容。
權(quán)利要求
1.鑒定能表達希望的生物學和/或生物化學表型的樹木譜系的方法，包含以下步驟a)從純種和/或其雜種的樹木中獲得核酸樣品；b)通過將步驟a)的所述核酸樣品用至少一種限制酶處理獲得限制性片段的限制圖譜，其中所述限制酶使純種和/或其雜種的所述限制圖譜之間的差異最大化；c)通過將步驟b)的處理過的核酸樣品與至少一個標記的探針作用，使所述探針和所述核酸樣品間互補雜交，來顯現(xiàn)步驟b)的所述限制圖譜，其中所述探針允許檢測雜交程度和/或純種和/或其雜種樹木間的所述限制性片段的不同強度；和d)將步驟c)的所述限制圖譜和/或限制性片段強度與所述樹木的至少一種選擇的生物學和生物化學表型相關(guān)聯(lián)，其中所述表型和與所述表型相關(guān)聯(lián)的遺傳座位相聯(lián)系。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟d)的所述相關(guān)聯(lián)進一步包括預(yù)測所述限制圖譜和/或限制性片段強度與所述表型之間關(guān)系的標準曲線。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述核酸樣品選自DNA和RNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述純種和/或其雜種的樹木是自然或人工產(chǎn)生的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟a)的所述核酸樣品獲自葉、形成層、根、芽、莖、木栓、韌皮部或木質(zhì)部。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述樹木屬于云杉屬(Picea)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述樹木屬于楊屬(Populus)、樺木屬(Betula)、冷杉屬(Abies)、落葉松屬(Larix)、紅豆杉屬(Taxus)、榆屬(Ulmus)、李屬(Prunus)、櫟屬(Quercus)、蘋果屬(Malus)、草莓樹屬(Arbutus)、柳屬(Salix)、懸鈴木屬(Platanus)、槭屬(Acer)、鐵杉屬(Tsuga)、黃杉屬(Pseudotsuga)、松屬(Pinus)、梣屬(Fraxinus)、桉屬(Eucalyptus)、金合歡屬(Acacia)、相思子屬(Abrus)、柏木屬(Cupressus)、水青岡屬(Fagus)、刺柏屬(Jun iperus)、崖柏屬(Thuja)或Canya。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述步驟c)進一步包括對所述限制性片段強度的測量。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述生物的或生物化學的表型選自纖維長度、木材密度、纖維崩散性、纖維粗度、細胞壁厚度、生長速率、木質(zhì)素含量、愈創(chuàng)木基木質(zhì)素含量、丁香基木質(zhì)素含量、碳水化合物含量、牛皮紙漿產(chǎn)率、機械紙漿能量需要、化學制漿的化學藥品攝取、提取物含量和提取化合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的探針是Eco2.0。
11.通過將來自純種和/或其雜種的樹木的核酸樣品用至少一種限制酶處理獲得的限制性片段圖譜在鑒定能表達期望的生物學或者生物化學表型的樹木譜系中的用途，其中所述限制酶使純種和/或其雜種的所述限制片段圖譜之間的差異最大化。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的用途，其中所述核酸樣品選自DNA和RNA。
13.根據(jù)權(quán)利要求11的用途，其中所述純種和/或其雜種的樹木是自然或人工產(chǎn)生的。
14.根據(jù)權(quán)利要求11的用途，其中步驟a)的所述核酸樣品獲自葉、形成層、根、芽、莖、木栓、韌皮部或木質(zhì)部。
15.根據(jù)權(quán)利要求11的用途，其中所述樹木屬于云杉屬(Picea)。
16.根據(jù)權(quán)利要求11的用途，其中所述樹木屬于楊屬(Populus)、樺木屬(Betula)、冷杉屬(Abies)、落葉松屬(Larix)、紅豆杉屬(Taxus)、榆屬(Ulmus)、李屬(Prunus)、櫟屬(Quercus)、蘋果屬(Malus)、草莓樹屬(Arbutus)、柳屬(Salix)、懸鈴木屬(Platanus)、槭屬(Acer)、鐵杉屬(Tsuga)、黃杉屬(Pseudotsuga)、松屬(Pinus)、梣屬(Fraxinus)、桉屬(Eucalyptus)、金合歡屬(Acacia)、相思子屬(Abrus)、柏木屬(Cupressus)、水青岡屬(Fagus)、刺柏屬(Juniperus)、崖柏屬(Thuja)或Canya。
17.根據(jù)權(quán)利要求11的用途，其中所述生物的或生物化學的表型選自纖維長度、木材密度、纖維崩散性、纖維粗度、細胞壁厚度、生長速率、木質(zhì)素含量、愈創(chuàng)木基木質(zhì)素含量、丁香基木質(zhì)素含量、碳水化合物含量、牛皮紙漿產(chǎn)率、機械紙漿能量需要、化學制漿的化學藥品攝取、提取物含量和提取化合物。
18.Eco2.0探針作為標記來預(yù)測純種和/或其雜種的樹木樣品的木材或纖維質(zhì)量的用途。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的用途，其中所述的純種和/或其雜種樹木是自然或人工產(chǎn)生的。
20.根據(jù)權(quán)利要求18的用途，其中所述樹木屬于云杉屬(Picea)。
21.根據(jù)權(quán)利要求18的用途，其中所述樹木屬于楊屬(Populus)、樺木屬(Betula)、冷杉屬(Abies)、落葉松屬(Larix)、紅豆杉屬(Taxus)、榆屬(Ulmus)、李屬(Prunus)、櫟屬(Quercus)、蘋果屬(Malus)、草莓樹屬(Arbutus)、柳屬(Salix)、懸鈴木屬(Platanus)、槭屬(Acer)、鐵杉屬(Tsuga)、黃杉屬(Pseudotsuga)、松屬(Pinus)、梣屬(Fraxinus)、桉屬(Eucalyptus)、金合歡屬(Acacia)、相思子屬(Abrus)、柏木屬(Cupressus)、水青岡屬(Fagus)、刺柏屬(Juniperus)、崖柏屬(Thuja)或Canya。
22.根據(jù)權(quán)利要求18的用途，其中所述生物的或生物化學的表型選自纖維長度、木材密度、纖維崩散性、纖維粗度、細胞壁厚度、生長速率、木質(zhì)素含量、愈創(chuàng)木基木質(zhì)素含量、丁香基木質(zhì)素含量、碳水化合物含量、牛皮紙漿產(chǎn)率、機械紙漿能量需要、化學制漿的化學藥品攝取、提取物含量和提取化合物。
23.篩選各種表型的大量樹木的方法，包括以下步驟a)表征具有不同雜交程度的至少兩株樹的木材質(zhì)量；b)從所述樹建立用于預(yù)測限制圖譜和表型之間關(guān)系的標準曲線；c)評價大量自然種間雜種的大量雜交標記的限制圖譜；d)將所述雜種的所述限制圖譜和所述標準曲線比較，來推斷所述雜種的表型；和e)根據(jù)預(yù)測的表型收獲所述雜種。
24.生產(chǎn)大量具有可預(yù)測的、一致的和/或增強的木材或者纖維質(zhì)量特性的克隆樹木的方法，包括以下步驟a)表征具有不同雜交程度的至少兩株樹的木材質(zhì)量；b)從所述樹建立用于預(yù)測限制圖譜和表型之間關(guān)系的標準曲線；c)評價大量自然種間雜種的大量雜交標記的限制圖譜；d)將所述雜種的所述限制圖譜和所述標準曲線比較，來推斷所述雜種的表型；e)通過實施異花傳粉或者體細胞胚胎發(fā)生從所述親代樹木獲得大量后代樹木；和f)繁殖在步驟e)獲得的所述后代樹木的體細胞胚來產(chǎn)生大量克隆的樹木，基本上所有所述的克隆樹木都有可預(yù)測的、一致的和/或增強的木材或者纖維質(zhì)量特性。
25.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所述親代樹木是自然或人工產(chǎn)生的。
26.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所述親代樹木屬于云杉屬(Picea)。
27.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所述樹木屬于楊屬(Populus)、樺木屬(Betula)、冷杉屬(Abies)、落葉松屬(Larix)、紅豆杉屬(Taxus)、榆屬(Ulmus)、李屬(Prunus)、櫟屬(Quercus)、蘋果屬(Malus)、草莓樹屬(Arbutus)、柳屬(Salix)、懸鈴木屬(Platanus)、槭屬(Acer)、鐵杉屬(Tsuga)、黃杉屬(Pseudotsuga)、松屬(Pinus)、梣屬(Fraxinus)、桉屬(Eucalyptus)、金合歡屬(Acacia)、相思子屬(Abrus)、柏木屬(Cupressus)、水青岡屬(Fagus)、刺柏屬(Juniperus)、崖柏屬(Thuja)或Canya。
28.通過權(quán)利要求23、24、25、26或27的方法產(chǎn)生的具有增強的木材或纖維特性的克隆樹木的植物群叢，所述樹木的基因組包含限制圖譜，所述限制圖譜是與所述增強的木材或纖維特性相關(guān)的相同限制圖譜。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用DNA探針為已知紙漿和紙生產(chǎn)線預(yù)測纖維長度和快速篩選優(yōu)質(zhì)樹木的方法。該方法包括從雜種云杉活組織來源分離基因組DNA，云杉DNA探針與該基因組DNA雜交和光密度分析評價所得宗教圖譜的強度。這可確定雜交群體中兩個親本物種的遺傳混合(或漸滲)的確切程度。由于(在該方法中發(fā)現(xiàn)的)在所測雜種云杉群體中遺傳漸滲程度和纖維長度的線性相關(guān)，所以DNA探針雜交圖譜的強度可用于直接、準確和可重復(fù)地預(yù)測該群體中單個雜種云杉內(nèi)(對于給定樹齡)存在的纖維長度。
文檔編號A01H7/00GK1451049SQ01811588
公開日2003年10月22日 申請日期2001年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月23日
發(fā)明者S·泊特, P·A·沃特森 申請人:加拿大紙漿和紙張研究所