奇蒿提取物4′,5,7-三羥基黃酮的制備與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體是指在奇葛中提取4'，5, 7-=徑基黃酬W及它在 制備抗菌藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 菊科艾屬植物奇葛Artemisia anomala S. Moore的地上干燥部分，多年生草本植 物，全草顯黃酬巧反應(yīng)。產(chǎn)于江蘇南部，生長于山坡、路邊及林緣。分布于華東、中南及西南 各省區(qū)。又名南劉寄奴、金寄奴、六月霜（浙江、江西）、野馬蘭頭（浙江）、九牛草（湖南）、 苦速婆/苦婆菜（福建）、六月雪/六月霜（安徽、江西、湖南）、大葉葛、鐵桿茵陳（江蘇）， 其性味辛、苦、平。始載于南北朝的《雷公炮制論》，W后歷代主要本草如《唐本草》、《證類本 草》、《本草綱目》和《中華本草》等均有收載。中醫(yī)認為奇葛具有清利濕熱、活血化疲、通經(jīng)止 痛，解毒消腫的功效。最新研究顯示奇葛還具有抗炎，抗氧化，抗硝化，抗血小板聚集， 促血管舒張，通過多祀點調(diào)節(jié)W抑制血管炎癥的功效.更有學者發(fā)現(xiàn)其對HSV (單純瘤疹 病毒）也有良好的治療效果狂heng !.Experimental s1:udy of 47化erbs with antiviral action against the herpes simplex virus. Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 1990Jan ； 10(1) :39-41, 6.化inese.).現(xiàn)代臨床實踐發(fā)現(xiàn)奇葛可治療急性細菌性頻疾，腹瀉，燒傷， 跌打損傷，蛇咬傷，早期乳癡等疾病，運些提示奇葛可能對多種致病菌具有抑制作用，可 W預(yù)防和治療感染。劉運徳等已研究發(fā)現(xiàn)奇葛具有很好的抗真菌效果.既往采用奇葛全草 入藥（水煎液或者濃縮片劑）進行臨床治療和抗菌實驗，難W分析奇葛的有效抗菌成分的 來源。
[0003] 既往研究或臨床實踐采用奇葛全草入藥（水煎液或者濃縮片劑等）進行臨床治 療和抗菌實驗，難W分析奇葛的有效抗菌成分的來源，因此，申請者近年來對奇葛進行系統(tǒng) 性分離提取，然后W 80 %乙醇提取物及各極性部位進行體外抗菌實驗，分析奇葛有效抗菌 成分的來源，為下一步提取純化物建立了一定的基礎(chǔ)。申請人的前期研究發(fā)現(xiàn)：奇葛不同 提取物對臨床多種致病菌表現(xiàn)出了良好的殺菌作用。例如：（1)乙酸乙醋提取物對福氏志 賀菌、頻疾志賀菌和無乳鏈球菌的最小殺菌濃度均為6. 25mg/mL，而對大腸正常菌群無抑 制作用。其中志賀菌屬是引起細菌性頻疾的最主要致病菌，細菌性頻疾也是野戰(zhàn)和搶險 救災(zāi)時，部隊最易廣泛發(fā)生的疾病之一。而無乳鏈球菌通常被稱為B群鏈球菌（group B streptococcus, GB巧，屬條件性致病菌。目前，治療GBS感染，可供選擇的藥物較多巧]。 然而，在特殊情況下，例如發(fā)生大規(guī)模自然災(zāi)害或者爆發(fā)戰(zhàn)爭，因缺少藥品仍可能出現(xiàn)GBS 感染的大量爆發(fā)，妊娠期婦女生殖泌尿系統(tǒng)感染GBS，可引發(fā)胎膜早破、早產(chǎn)、死胎、宮內(nèi)感 染等一系列妊娠并發(fā)癥，產(chǎn)婦感染GBS可導致產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎、盆腔炎乃至敗血癥；新生 兒感染GBS可導致肺炎、敗血癥和腦膜炎。（2)氯仿提取物對大腸埃希氏菌具有良好的殺 菌作用，最小殺菌濃度為6. 25mg/mU大腸埃希氏菌是人體腸道內(nèi)的正常寄殖菌，戰(zhàn)時腹部 受到外傷后，若腸道破裂或者穿孔可引起腸道大腸埃希菌移位，從而導致腹腔感染，乃至 全身性感染，也可因戰(zhàn)傷導致機體抵抗力嚴重下降而感染。第二軍醫(yī)大學第=附屬醫(yī)院資 料顯示：大腸埃希菌是院內(nèi)感染病原菌檢出率最高的菌種，約占院內(nèi)感染檢出細菌株總數(shù) 的28. 3-34. 6% ;而在膽道感染中所占的比例更高，檢出率在50% W上。近年來，抗生素濫 用，導致大腸埃希菌耐藥率居高不下，程訓民等[12]在124株大腸埃希菌中共檢出54株 (43. 5% )產(chǎn)超廣譜 0 -內(nèi)酷胺酶（extended-spectrum0 -lactamases,ESI3Ls)?，F(xiàn)有抗生 素常無效，因此亟需開發(fā)新型抗生素替代。（3)氯仿和乙酸乙醋提取物均對金黃色葡萄球菌 具有良好的殺菌作用，最小殺菌濃度均為12. 5mg/mL。金黃色葡萄球菌是開放性外傷最常見 的污染細菌，也是戰(zhàn)時開放性污染創(chuàng)面的最常見致病細菌。
[0004] 奇葛廣泛生長于華東、中南和西南地區(qū)，原料分布區(qū)域廣大，取材方便。華東、中南 和西南地區(qū)分別為南京軍區(qū)，廣州軍區(qū)和成都軍區(qū)的轄區(qū)。在軍事上W上=個地區(qū)均面對 著極為錯綜復(fù)雜的國際或者國內(nèi)形勢，例如南京和廣州軍區(qū)一方面需要做好對臺軍事斗爭 的準備，另一方面需要面對來自日本和東南亞諸國對我國東海及南海的島蝸及海底資源的 爭奪。而成都軍區(qū)方面需要面對和藏獨勢力的長期斗爭，同時也要對印度采取防范。因此 W上=個軍區(qū)都存在應(yīng)對局部戰(zhàn)爭的可能。在和平時期，W上=個地區(qū)均為自然災(zāi)害的高 發(fā)區(qū)域，例如：華東及中南地區(qū)為洪潰災(zāi)害的高發(fā)區(qū)域，西南地區(qū)為地震，泥石流等地質(zhì)災(zāi) 害的高發(fā)區(qū)域，需要應(yīng)對可能發(fā)生的大范圍的自然災(zāi)害。因此，深入研究奇葛的抗菌活性成 分，開發(fā)價廉質(zhì)優(yōu)的高效抗生素，既有利于戰(zhàn)爭和大規(guī)模自然災(zāi)害發(fā)生時，利用其原料分布 區(qū)域廣泛的特點，保障軍隊和人民群眾短期內(nèi)集中使用抗生素治療相應(yīng)細菌感染的需要， 也能有效滿足平時人民群眾一般抗菌治療的需求。 陽0化]申請?zhí)枮?01110187502. 6,公開號為CN102309533A的中國專利申請一種奇葛總 黃酬的制備方法，該方法主要采用超臨界二氧化碳流體萃取法萃取奇葛粉末，乙醇作為攜 帶劑，萃取物采用大孔吸附樹脂吸附，乙醇洗脫，減壓濃縮，冷凍干燥得到奇葛總黃酬。其制 備方法簡單，快捷，無毒。但是該方法是針對奇葛總黃酬的制備方法，不便于奇葛單體活性 成分的提取制備，因此發(fā)明對奇葛中單體活性成分的制備方法具有重要意義。
[0006] 本發(fā)明人一直致力于對奇葛進行系統(tǒng)性分離提取，并完成了不同提取物及各極 性部位進行的體外抗菌實驗，通過體外抗菌實驗篩選出奇葛有效抗菌成分的來源，并完成 了抗菌有效單體的分離與鑒定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的另一目的在于提供=種奇葛提取物4'，5, 7-=徑基黃酬的制備方法。
[0008] 本發(fā)明的目的在于提供=種奇葛提取物4'，5, 7-=徑基黃酬在制備抗菌藥物中 的應(yīng)用。
[0009] 奇葛提取物4'，5, 7-=徑基黃酬（芹菜素）的制備方法，按照下述步驟進行：
[0010] 將干燥奇葛原藥材粉碎后浸泡在80%乙醇中，65°C滲漉提取，提取結(jié)束后薄膜蒸 發(fā)，干燥后待用，得80%乙醇提取物干燥粉末；其中奇葛原藥材與80%乙醇的用量比例為 1:5k邑/Lo
[0011] 取80 %乙醇提取物干燥粉末化g，用化石油酸浸泡2地過濾，濾渣干燥后用化乙 酸乙醋浸泡24h過濾，濾液濃縮得乙酸乙醋提取物約6.化g。乙酸乙醋粗提物用甲醇溶解 后上硅膠柱，W石油酸-乙酸乙醋系統(tǒng)W :10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5、1:10各配置4001111 W 2d/s (滴/秒）梯度洗脫，每隔30min收集一次樣品，洗脫時間在3.化-4h內(nèi)收集的第8 號樣品為4'，5, 7- =?基黃酬（芹菜素）。
[0012] 在洗脫收集的96個樣品中，通過薄層色譜點樣法將樣品中含同種物質(zhì)的樣品混 合，混合后的樣品通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成提取液再通過真空離屯、蒸發(fā)濃縮器制成干粉狀物 (部分為膠狀物），所有樣品保存在1. 5mL的EP管中，C〇60滅菌待用。
[0013] 薄層色譜點樣法，參照：孫銃慶，胡育柱.分析化學.北京：科學出版 社，2007. 467 ~470。
[0014] 其中4'，5, 7- S徑基黃酬（芹菜素）的結(jié)構(gòu)式為：
[0015]
[0016] 奇葛提取物4'，5, 7-=徑基黃酬在制備抗菌藥物中的應(yīng)用。
[0017] 其中所述菌株為金黃色葡萄球菌（staphyIococ州S aureus, SA)標準型ATCC 25923、金黃色葡萄球菌（staphylococ州S aureus, SA)標準型 ATCC 29213。
[0018] 金黃色葡萄球菌（staphylococ州S aureus, SA)標準型ATCC 25923、金黃色葡萄 球菌（staphylococ州S aureus, SA)標準型ATCC 29213,均購自于溫州市康泰