一種禽源沙門氏菌多重pcr檢測(cè)試劑盒及其非診斷性檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種禽源沙門氏菌多重PCR檢測(cè)試劑 盒及其非診斷性檢測(cè)方法，特別涉及血清型為腸炎沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌和鼠傷寒沙 門氏菌。
【背景技術(shù)】
[0002] 沙門氏菌是一種重要的人畜共患病原菌，主要寄居于人和動(dòng)物的腸道中，研究表 明由沙門氏菌引起的食物中毒是所有細(xì)菌性食物中毒中比例最高、危害最廣的一種。世界 衛(wèi)生組織(WHO)的調(diào)查表明全球每年有1.3 X 108例人類胃腸炎是由沙門氏菌感染引起的， 其中死亡病例高達(dá)300萬(wàn)。
[0003] 家禽被認(rèn)為是沙門氏菌的主要儲(chǔ)庫(kù)，而人類感染通常歸因于受污染的家禽制品 (包括禽肉與禽蛋）。目前已報(bào)道的沙門氏菌血清型總數(shù)超過(guò)2600種，其中與家禽相關(guān)的血 清型只占10%，而引起家禽嚴(yán)重感染及食品安全的血清型主要包括腸炎沙門氏菌、雞傷寒沙 門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌三種。腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌主要通過(guò)糞口途徑感染家 禽，經(jīng)過(guò)消化道定植后再侵入包括生殖道在內(nèi)的多種臟器。因此，腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙 門氏菌可以感染雞蛋進(jìn)而傳播給人類，造成嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。與此相反的是，雞傷寒沙 門氏菌屬于宿主特異性血清型，可引起各種年齡段雞發(fā)生嚴(yán)重的系統(tǒng)性疾病，給家禽業(yè)造 成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。由于上述三種血清型沙門氏菌在公共衛(wèi)生和家禽生產(chǎn)領(lǐng)域的重大影 響，腸炎沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌已成為全球家禽領(lǐng)域最急需凈化的 血清型。鑒于上述血清型沙門氏菌對(duì)家禽生產(chǎn)與公共衛(wèi)生的重要性，迫切需要建立一種快 速、實(shí)用的方法進(jìn)行特異性檢測(cè)。
[0004] 由于傳統(tǒng)沙門氏菌檢測(cè)技術(shù)上存在諸多缺陷，如:操作步驟煩瑣耗時(shí)（需依次經(jīng)過(guò) 預(yù)增菌，選擇性增菌，生化與血清學(xué)鑒定），不能滿足及時(shí)有效的質(zhì)量監(jiān)測(cè)和疾病防控需求； 靈敏度較低，當(dāng)樣品中沙門氏菌含量較低時(shí)，易造成假陰性結(jié)果;準(zhǔn)確度不高，尤其是加工 后的食品受加熱、干燥、高鹽和冷凍等因素的作用，易導(dǎo)致沙門氏菌形成營(yíng)養(yǎng)缺陷型，用傳 統(tǒng)方法不易檢出。
[0005] 為了能夠快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的檢驗(yàn)上述三種禽源沙門氏菌，以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的 檢測(cè)鑒定方法在實(shí)踐檢驗(yàn)中不斷取得新進(jìn)展，成為取代傳統(tǒng)檢測(cè)方法最具潛力的檢測(cè)方法 之一。其中，多重PCR技術(shù)在保留了PCR方法敏感、特異、簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)，以其高效 性成為了多病原同時(shí)檢測(cè)的重要技術(shù)之一。但由于多重PCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)較單一 PCR更為復(fù)雜， 在建立多重PCR反應(yīng)體系時(shí)需考慮引物間的相互干擾，還需對(duì)其中的主要成分和反應(yīng)條件 進(jìn)行繁瑣的優(yōu)化，因而限制了該方法的廣泛運(yùn)用。
[0006] 本發(fā)明根據(jù)已知的沙門氏菌全基因組序列，通過(guò)分析篩選出腸炎沙門氏菌、雞傷 寒沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌三種血清型的特有基因序列，設(shè)計(jì)多重PCR引物，建立檢測(cè)方 法。該方法可用于禽源樣品中腸炎沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌的特異性 檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明針對(duì)傳統(tǒng)技術(shù)在檢測(cè)禽源沙門氏菌中存在的不足，提供了一種特異性檢測(cè) 三種重要禽源沙門氏菌血清型(腸炎沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌）的多重 PCR試劑盒及其非診斷性檢測(cè)方法。
[0008] 本發(fā)明技術(shù)方案如下： 本發(fā)明提供了一種禽源沙門氏菌多重PCR檢測(cè)試劑盒及其非診斷性檢測(cè)方法，所述禽 源沙門氏菌多重PCR檢測(cè)試劑盒包括10XPCR緩沖液、2.5 U/μΙ Taq DNA聚合酶、10Mm dNTPs、多重PCR檢測(cè)引物組、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，所述陽(yáng)性對(duì)照物包括腸炎沙門氏菌 ATCC13076、鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028、雞傷寒沙門氏菌ATCC9184基因組DNA;所述陰性對(duì) 照為滅菌雙蒸水。
[0009] 進(jìn)一步的，所述多重PCR檢測(cè)體系的組分為:每25μ1反應(yīng)液中包括10XPCR緩沖液 2.5yl、dNTPs 2yl、Taq DNA聚合酶0.25μ1、檢測(cè)引物組3yl、DNA模板1~2μ1以及適量的滅菌 雙蒸水。
[0010] 進(jìn)一步的，所述多重PCR檢測(cè)方法程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min;94°C變性 30s;56°C退火30s;72°C延伸30s;共30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸8min。
[0011]進(jìn)一步的，所述 10XPCR緩沖液含有 100mM KCl、80mM (NH4)S〇4、pH為9.0的 100mM Tris-HCl、15mM MgCh和0.5% Tergitol-type NP-40〇
[0012]進(jìn)一步的，所述陽(yáng)性對(duì)照中腸炎沙門氏菌的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示，雞傷寒沙門氏菌的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示，鼠傷寒沙門 氏菌的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示。
[0013] 進(jìn)一步的，所述腸炎沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌的引物對(duì)濃度均 為10 μΜ，等體積混合后得到檢測(cè)引物組。
[0014] 進(jìn)一步的，所述dNTPs包括dGTP、dCTP、dATP、dTTP，各組分濃度均為2.5mM。
[0015] 更進(jìn)一步的，一種使用禽源沙門氏菌多重PCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行非診斷性檢測(cè)的方 法，包括以下步驟： S1:使用煮沸法或商品化試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA，得到檢測(cè)模板。
[0016] 32:多重?0財(cái)廣增，將10\?0?緩沖液、(1犯1^、了&9〇嫩聚合酶、檢測(cè)引物組以及0嫩 模板加入無(wú)菌PCR反應(yīng)管中，添加滅菌雙蒸水至總體積25μ1，同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性、陰性對(duì)照，使用 PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng);采用2%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)并分析結(jié)果。
[0017]相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為： 本發(fā)明根據(jù)三種禽源沙門氏菌(腸炎沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌)含 有的特異基因序列設(shè)計(jì)引物，具有靈敏度高，特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)，本發(fā)明通過(guò)一次反應(yīng)， 即可對(duì)三種家禽主要優(yōu)勢(shì)血清型沙門氏菌進(jìn)行快速檢測(cè)與分型，相比傳統(tǒng)的血清學(xué)分型與 普通PCR檢測(cè)，在檢測(cè)時(shí)間與檢測(cè)成本方面具有較大優(yōu)勢(shì)，適合于批量檢測(cè)。
【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1為實(shí)施例1中多重PCR檢測(cè)方法的凝膠電泳展示圖。圖中:Μ為DL-500 marker， 泳道1-3分別為鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌和雞傷寒沙門氏菌，泳道4為陰性對(duì)照； 圖2為實(shí)施例2中多重PCR檢測(cè)方法特異性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)?zāi)z電泳結(jié)果圖。圖中:M為DL-500 marker;泳道1-39為沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株檢測(cè)結(jié)果，分別為紐波特沙門氏菌ATCC6962、蒙特維的 亞沙門氏菌ATCC8387、圣保羅沙門氏菌CICC21486、波茨坦沙門氏菌CICC21500、布洛克利沙 門氏菌CICC21489、雞傷寒沙門氏菌ATCC10398、海德?tīng)柋ど抽T氏菌CMCC50111、肯塔基沙門 氏菌CICC21488、嬰兒沙門氏菌CMCC50348、湯卜遜沙門氏菌CMCC50023、阿貢納沙門氏菌 CICC21586、雞傷寒沙門氏菌ATCC19945、山夫登堡沙門氏菌CMCC50050、亞利桑那沙門氏菌 CMCC50166、火雞沙門氏菌CMCC50329、科特布斯沙門氏菌CMCC50123、都柏林沙門氏菌 CMCC50042、雷丁沙門氏菌CMCC50103、雞傷寒沙門氏菌ATCC9184、德比沙門氏菌CMCC50112、 鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028、甲型副傷寒沙門氏菌CMCC50001、埃森沙門氏菌CMCC50720、吉 夫沙門氏菌CMCC50773、鴨沙門氏菌CMCC50774、弗雷斯諾沙門氏菌CMCC50908、斯特拉斯堡 沙門氏菌CMCC50872、腸炎沙門氏菌ATCC13076、豬霍亂沙門氏菌CICC21493、鼠傷寒沙門氏 菌CMCC50015、明尼蘇達(dá)沙門氏菌CMCC50061、巴森海德沙門氏菌CICC21587、巴雷利沙門氏 菌CMCC50740、圣地亞哥沙門氏菌CMCC50716、加明那拉沙門氏菌CMCC50141、雞傷寒沙門氏 菌CMCC50770、翁德斯太浦沙門氏菌CMCC50138、奧拉寧堡沙門氏菌CMCC50121和腸炎沙門氏 菌CMCC50041;泳道40-47為非沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株檢測(cè)結(jié)果（分別為禽多殺性巴氏桿菌 CVCC44801、奇異變形桿菌ATCC12453、大腸埃希氏菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌 ATCC25923、銅綠假單胞菌ATCC27853、宋內(nèi)氏志賀氏菌ATCC9290、空腸彎曲桿菌ATCC12022 和肺炎克雷伯氏菌ATCC700603;泳道48為滅菌雙蒸水。
[0019]圖3為實(shí)施例3中多重PCR檢測(cè)方法靈敏度評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)?zāi)z電泳結(jié)果圖。圖中:M為DL-500 marker， 泳道 1-5 為鼠傷寒沙門氏菌 ATCC14028 梯度稀釋樣品 ，泳道 6-10 為雞傷寒沙門 氏菌ATCC9184梯度稀釋樣品，泳道11-15為腸炎沙門氏菌ATCC13076梯度稀釋樣品。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明，以下所述，僅是對(duì)本發(fā)明的較 佳實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明做其他形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上 述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更為同等變化的等效實(shí)施例。凡是未脫離本發(fā)明方案內(nèi)容，依據(jù) 本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以下實(shí)施例所做的任何簡(jiǎn)單修改或等同變化，均落在本發(fā)明的保護(hù)范 圍內(nèi)。
[0021] 實(shí)施例1禽源沙門氏菌多重PCR檢測(cè)方法的建立 引物的設(shè)計(jì):根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的腸炎沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌和鼠傷寒沙 門氏菌的基因組DNA序列，分析比對(duì)后分別篩選出上述三種血清型沙門氏菌的特異性基因 片段（SEQIDN0.1、SEQIDN0.4、SEQIDN0.7)，再此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)、優(yōu)選得到三種血清型沙 門氏菌的特異性檢測(cè)引物，如下表所示。
[0022] 多重PCR檢測(cè)引物組中腸炎沙門氏菌的擴(kuò)增引物序列SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、 雞傷寒沙門氏菌的擴(kuò)增引物序列SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、鼠傷寒沙門氏菌的擴(kuò)增引物 序列SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9的完整SEQ序列如序列表中所示。