檢測犬惡絲蟲病的elisa診斷試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及檢測犬惡絲蟲病的ELISA診斷試劑盒，屬于免疫學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 犬惡絲蟲（亦稱犬心絲蟲）是心肺心絲蟲病的病原體，主要寄生于溫帶、熱帶地區(qū) 的家養(yǎng)犬貓及野生哺乳動物體內(nèi)。作為一種以蚊媒形式傳播的人畜共患傳染病病原，該蟲 可導(dǎo)致人的犬惡絲蟲病。此外，一些血清制品也可能會導(dǎo)致人的犬惡絲蟲病。通常，狗作為 犬惡絲蟲的天然宿主，其成蟲大多寄生在狗的肺動脈和右心室，而其微絲蝴則分散與狗的 血液循環(huán)系統(tǒng)?；疾」烦Ｒ蚋腥旧倭肯x體而不表現(xiàn)出病狀，但是其血液中的微絲蝴或循環(huán) 性犬惡絲蟲抗原卻是目前診斷該病的主要依據(jù)；并且在一些沒有微絲蝴的隱性感染情況 下，抗原檢測被認(rèn)為是最敏感的檢測方法。因此鑒定和篩選一種犬惡絲蟲特異的、敏感的分 子診斷抗原將對該蟲病的防控奠定基礎(chǔ)。
[0003] 發(fā)明專利CN102798716公開了一種犬惡絲蟲ELISA檢測試劑盒及其制備方法，利用 從犬惡絲蟲成蟲cDNA表達(dá)文庫中篩選出的與編碼馬來絲蟲肌球蛋白尾家族蛋白同源為 88 %的MTFP基因，并在大腸桿菌質(zhì)粒中表達(dá)獲得的MTFP蛋白作為抗原，通過間接ELISA法檢 測犬的犬惡絲蟲感染。該方法可快速檢測犬惡絲蟲感染，但是，其靈敏度有待進(jìn)一步的提 高，特別是對單一的雌蟲或雄蟲感染，其檢測結(jié)果并不準(zhǔn)確。
[0004] 因此，亟需一種檢測靈敏度高的ELISA檢測試劑盒。
[0005] 自腫瘤蛋白（TCTP)從小鼠埃利希腹水瘤細(xì)胞和紅白血病細(xì)胞內(nèi)被最次描述以來， 該蛋白已在不同的生物，如哺乳動物、植物、較低的真核生物和原核生物內(nèi)被發(fā)現(xiàn)和報道。 此外，在寄生蟲中，tctp基因還被發(fā)現(xiàn)存在于惡性瘧原蟲、約氏瘧原蟲、布氏錐蟲、秀麗隱桿 線蟲、馬來絲蟲及班氏絲蟲體內(nèi)。重要的是，由于絲蟲腫瘤蛋白的鈣結(jié)合特性和組胺釋放功 能，該蛋白目前已被認(rèn)定與犬惡絲蟲的致病性以及其在宿主體內(nèi)的存活息息相關(guān)。當(dāng)前，相 關(guān)研究對于TCTP在寄生蟲中的生理角色已有了詳細(xì)了解，然而對于該蛋白質(zhì)在絲蟲寄生蟲 階段是否具有免疫原性仍知之甚少。有報道稱在馬來絲蟲的微絲蝴和成蟲體內(nèi)均可檢測到 高水平的TCTP蛋白質(zhì)表;并且作為一種分泌蛋白，馬來絲蟲腫瘤蛋白（Bm-TCTPs)在其微絲 蝴的分泌、排泄物中含量豐富，可引起宿主免疫反應(yīng)。鑒于上述研究結(jié)果，本發(fā)明的發(fā)明人 推測絲蟲的TCTP同系物在絲蟲病的檢測上應(yīng)該具有潛在免疫診斷價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明解決的技術(shù)問題是提供檢測犬惡絲蟲病的ELISA診斷試劑盒。
[0007] 本發(fā)明檢測犬惡絲蟲病的ELI SA診斷試劑盒，包括ELI SA板、洗滌液、封被液、酶標(biāo) 二抗、顯色物、終止液和Di-TCTP蛋白抗原，所述Di-TCTP蛋白抗原為Di-TCTP基因編碼得到 的蛋白，所述Di-TCTP蛋白抗原為Di-TCTP基因編碼得到的蛋白，所述Di-TCTP基因序列如 SEQ ID No.l所示；
[0008] 所述洗滌液為PBST，所述PBST為磷酸鹽吐溫緩沖液；
[0009]所述封被液為3wt%牛血清蛋白；
[0010]所述酶標(biāo)二抗為HRP標(biāo)記的羊抗狗IgG;
[0011] 所述顯色物為3,3'，5,5'_四甲基聯(lián)苯胺;所述終止液為2.5N H2S〇4。
[0012] 其中，所述Di-TCTP蛋白抗原的制備方法包括如下步驟：
[0013] a、從犬惡絲蟲中提取得到RNA，并將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA;
[0014] b、以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中，PCR擴(kuò)增的引物包括上游引物和下游引物， 所述上游引物如SEQ ID No.2所示;所述下游引物如SEQ ID No.3所示；
[0015] c、將PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物連接到表達(dá)載體，得重組表達(dá)質(zhì)粒；
[0016] d、將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)表達(dá)，得融合蛋白，過柱純化后，即得 Di-TCTP蛋白抗原。
[0017] 進(jìn)一步的，所述PCR擴(kuò)增體系為:2XTaq PCR MasterMix 12.5yL，上游引物lyL，下 游引物lyL，模板DNA lyL，ddH20 9.5yL;反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性5min; 94°C變性35sec， 53.8°C 退火 35sec，72°C 延伸 35sec，35 個循環(huán)；最后 72°C 延伸 lOmin。
[0018] 所述表達(dá)載體為pET_28a( + )。
[0019] 本發(fā)明解決的第二個技術(shù)問題是提供檢測血清中是否存在犬惡絲蟲的方法，該方 法可以檢測血清以及血清制品中是否存在犬惡絲蟲。
[0020] 本發(fā)明檢測血清中是否存在犬惡絲蟲的方法，包括如下步驟：
[0021] a、用Di-TCTP蛋白抗原包被ELISA板，過夜，再使用PBST徹底清洗四次；
[0022] b、將已包被的ELISA板用100yL的3%牛血清蛋白封被lh，再使用PBST徹底清洗四 次；
[0023] c、加入待測血清100yL到孔內(nèi)，室溫處理lh，再加入HRP標(biāo)記的羊抗狗IgG二抗反應(yīng) 1 h后，使用PBST徹底清洗四次；
[0024] d、加入3,3'，5,5'_四甲基聯(lián)苯胺進(jìn)行顯色;顯色反應(yīng)由2.5N H2S〇4終止，在波長為 450nm的光波下讀取吸光度；
[0025] e、根據(jù)吸光度值判斷檢測結(jié)果。
[0026] 其中，a步驟所述的Di-TCTP蛋白抗原包被ELISA板的包被濃度為2.5yg/mL;c步驟 所述的HRP標(biāo)記的羊抗狗IgG二抗稀釋度為1:5000。
[0027] 其中，d步驟所述的顯色時間為5~30min，優(yōu)選顯色時間為10min。
[0028] e步驟所述的根據(jù)吸光度值判斷檢測結(jié)果，其判斷方法為:若吸光度值大于或等于 0.294，則血清中存在犬惡絲蟲，若吸光度值小于0.294，則血清中不存在犬惡絲蟲。
[0029] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0030] (1)新基因篩選方法先進(jìn):本發(fā)明是通過高通量測序技術(shù)從犬惡絲蟲的轉(zhuǎn)錄組數(shù) 據(jù)中篩選到的Di-TCTP基因。
[0031] (2)敏感性高：以Di-TCTP蛋白作為抗原，不僅能檢測單一的雌蟲感染，而且還能檢 測所有的雄蟲感染。因此優(yōu)于CN201110419523.6公開的以MTFP蛋白作為抗原建立的ELISA 檢測試劑盒。
[0032] (3)特異性強(qiáng)：本發(fā)明檢測犬惡絲蟲病的ELISA診斷試劑盒分別評估感染有犬鉤 蟲，犬弓蛔蟲和豆?fàn)顜Ы{蟲3種不同寄生蟲的6份犬血清，均為陰性，表明該試劑盒特異性 強(qiáng)。
【附圖說明】
[0033] 圖1為Di-TCTP基因二級結(jié)構(gòu)。
[0034]圖2為預(yù)測的Di-TCTP蛋白三級結(jié)構(gòu)，其中，深色粗線為α-螺旋，淺色粗線為延伸 鏈，其余細(xì)線為無規(guī)卷曲。
[0035] 圖3a為Di-TCTP蛋白SDS-PAGE電泳圖；圖3b為Di-TCTP蛋白免疫印跡圖；圖中，箭頭 表明Di-TCTP蛋白位置。
【具體實(shí)施方式】
[0036]本發(fā)明借助第二代測序技術(shù)所產(chǎn)生的犬惡絲蟲成蟲轉(zhuǎn)錄組中20810個獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄 表達(dá)基因（unigenes)和15698個編碼序列(CDS)數(shù)據(jù)集，鑒定和篩選出來一個犬惡絲蟲腫瘤 蛋白基因（以下簡稱Di-TCTP)，基因序列如SEQ ID No. 1所示。
[0037] Di-TCTP是在篩選組裝的犬惡絲蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中鑒定的。根據(jù)Nr注釋信息，該基因 (Unigene ID 881)表現(xiàn)出與羅阿絲蟲的TCTP高的同源性。0RF分析表明，Di-TCTP含有一個 可編碼181個氨基酸的01^(546&?)，其假定的分子質(zhì)量為20.73961^) &，？1為4.62。相似性分 析表明，Di-TCTP和羅阿絲蟲的受翻譯調(diào)節(jié)腫瘤蛋白（TCTP)(基因庫:EF028099.1)在蛋白水 平享有最高的相似點(diǎn)（97%)，其次是和班氏絲蟲的TCTP(GenBank:AAK71499.1)(96%)和馬 來絲蟲的TCTP(GenBank: EDP33421.1) (95% )。信號PV4.0分析表明，在Di-TCTP中不存在信 號肽。Di-TCTP編碼的蛋白有顯著的親水性（圖1)。用不同方法預(yù)測的Di-TCTP蛋白的二級結(jié) 構(gòu)表現(xiàn)出明顯的不同。例如，用Garnier-Robson方法預(yù)測，有兩個α螺旋和兩個無規(guī)則卷曲， 而用Chou-Fasman的方法，Di-TCTP推斷的氨基酸序列預(yù)測則有10個阿爾法螺旋，8個片層和 11個無規(guī)則卷曲。用Karplus Schulz方法預(yù)測，Di-TCTP有13個可變區(qū)。圖2為預(yù)測的Di-TCTP蛋白三級結(jié)構(gòu)。該預(yù)測是利用在線分析工具(http: //swissmodel. expasy · org/)預(yù)測 的三級結(jié)構(gòu)。
[0038] 利用Di-TCTP編碼的蛋白具有良好的免疫原性，可用于制備檢測犬惡絲蟲病的 ELISA診斷試劑盒。
[0039]本發(fā)明檢測犬惡絲蟲病的ELI SA診斷試劑盒，包括ELI SA板、洗滌液、封被液、酶標(biāo) 二抗、顯色物、終止液和Di-TCTP蛋白抗原，所述Di-TCTP蛋白抗原為利用Di-TCTP基因編碼 得到的蛋白；所述洗滌液為磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)，即在PBS溶液中加入Twen-20配制而 成，優(yōu)選為含〇 . 〇5wt %吐溫-20的pH7.4的磷酸鹽緩沖液;所述封被液為3wt %牛血清蛋白； 所述酶標(biāo)二抗為HRP標(biāo)記的羊抗狗IgG;所述顯色物為3,3'，5,5'_四甲