百合總蛋白的提取及雙向電泳差異蛋白質(zhì)圖譜的獲取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及百合總蛋白的提取及雙向電泳差異蛋白質(zhì)圖 譜的獲取方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 百合化ilium SPP.)被譽(yù)為"球根花弁之王"，是世界五大鮮切花之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)， 2009年全球種球生產(chǎn)面積為35,749公頃，其中荷蘭種植面積為23,561公頃，占66%，英國(guó)種 植面積為5，400公頃，占15 %，中國(guó)種植面積為4，680公頃，占13 %。全球百合種球的貿(mào)易額 已達(dá)20多億美元，年貿(mào)易量達(dá)25億粒W上。據(jù)農(nóng)業(yè)部的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，我國(guó)2013年百合鮮切花銷 售額達(dá)42.95億元，位居鮮切花銷售額的首位，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
[0003] 尖抱鑲刀菌百合?；?化sarium O巧sporum f .sp. Iilii)是引起百合枯萎病的 ±傳真菌，全世界百合種植區(qū)域均有被其感染和危害。云南作為我國(guó)重要的百合優(yōu)質(zhì)鮮切 花產(chǎn)區(qū)，枯萎病時(shí)有爆發(fā)，輕者導(dǎo)致產(chǎn)量損失20-30%，嚴(yán)重時(shí)可造成百合絕收，且污染種植 ±壤，極大影響云南百合花弁產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。鑲刀菌是一種在許多作物上引起嚴(yán)重病 害的±傳真菌，很難進(jìn)行有效控制。因此選育和利用抗病品種成為主要的防治措施，采用蛋 白質(zhì)雙向電泳技術(shù)來挖掘百合的抗病相關(guān)蛋白，可為百合抗病細(xì)胞工程育種提供理論依 據(jù)。
[0004] 植物在病原侵染脅迫下，除了會(huì)發(fā)生一些組織解剖學(xué)上的變化外，一些基因表達(dá) 也會(huì)發(fā)生改變，有些蛋白的合成會(huì)受到抑制，同時(shí)又會(huì)有新的蛋白合成。運(yùn)些病程相關(guān)基因 和蛋白（Pathogenesis-related gene/protein,PR)是植物表現(xiàn)抗性的遺傳基礎(chǔ)抗性中的 關(guān)鍵因子，也是抗病機(jī)制研究的基礎(chǔ)。研究百合的病程相關(guān)蛋白可為抗病細(xì)胞工程育種提 供理論依據(jù)。
[0005] 雙向電泳（Two-dimensional electro地oresis ,2-DE)技術(shù)是蛋白質(zhì)組研究的核 屯、技術(shù)之一，也是復(fù)雜蛋白質(zhì)分析分辨率最高的工具之一，其第一向?yàn)榈入娋劢?(IsoelectrofocusingJEF)，根據(jù)蛋白的等電點(diǎn)不同進(jìn)行分離；其第二向?yàn)槭榛蛩?鋼聚丙締酷胺凝膠(SDS-PAGE)，是根據(jù)蛋白質(zhì)亞基相對(duì)分子質(zhì)量的不同而將第一向分離后 的蛋白質(zhì)進(jìn)一步分離。經(jīng)過電荷和質(zhì)量的兩次分離后，可W得到蛋白質(zhì)分子的等電點(diǎn)和分 子量信息。近年來，蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)在水稻、小麥、棉花、玉米、大豆等作物的研究中已 得到廣泛應(yīng)用，但對(duì)于百合蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)的研究國(guó)內(nèi)外還未見報(bào)道。因此本發(fā)明通 過優(yōu)化百合蛋白質(zhì)提取及雙向電泳的各項(xiàng)參數(shù)，發(fā)明了百合總蛋白的提取及雙向電泳差異 蛋白質(zhì)圖譜的獲取方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明目的是提供一種適宜百合的百合總蛋白的提取及雙向電泳差異蛋白質(zhì)圖 譜的獲取方法。
[0007] 本發(fā)明所提供的百合總蛋白的提取及雙向電泳差異蛋白質(zhì)圖譜的獲取方法，包括 W下步驟：
[000引（1)百合總蛋白質(zhì)的提?。?br>[0009] ①稱取1~2g新鮮百合葉片或鱗莖于-20°C預(yù)冷的研鉢中，加入10~20ml液氮，快 速研磨至粉狀；
[0010] ②量取20ml附加1 %苯甲基橫酷氣和0.1 %二硫蘇糖醇的10 % S氯乙酸-丙酬溶 液，分2~3次清洗研鉢，將研鉢內(nèi)粉狀物清洗至50ml離屯、管中，迅速置于-20°C冰箱中保存 過夜;取過夜的離屯、管于離屯、機(jī)上2000化pm，離屯、20min;棄上清；
[00川③加入20ml附加1%苯甲基橫酷氣和0.1%二硫蘇糖醇的80%的丙酬溶液，用槍頭 把離屯、管內(nèi)的沉淀弄碎，振蕩，于-20°C冰箱中放置化后，取出離屯、管于離屯、機(jī)上200(K)rpm， 離屯、15min，棄上清；
[0012] ④重復(fù)步驟(1)③2次；
[0013] ⑤在超凈工作臺(tái)上將得到的沉淀轉(zhuǎn)移到經(jīng)干燥滅菌的培養(yǎng)皿中，待沉淀吹干后， 即為提取的蛋白質(zhì)干粉，將蛋白質(zhì)干粉收集到離屯、管中，-80°C保存；
[0014] (2)百合總蛋白質(zhì)的純化和溶解
[0015] ①稱取步驟（1)⑤提取的蛋白質(zhì)干粉40~50mg于底部連接有離屯、管的過濾柱中， 按每Img蛋白質(zhì)干粉加7M水化液15iil的比例，加入7M水化液，加入7M水化液后室溫放置化；
[0016] ②將底部連接有離屯、管的過濾柱于離屯、機(jī)上120(H)巧m，離屯、15min，然后棄去過濾 柱，將過濾柱底部連接的離屯、管所收集到的濾液轉(zhuǎn)移至另一離屯、管中；
[0017] ③加入1600~2000iil附加0.1 %二硫蘇糖醇的無水丙酬，邊加邊搖勻，-20°C冰箱 中放置化后，取出離屯、管于離屯、機(jī)上1500化pm，4°C離屯、30min，棄上清；
[0018] ④加入1ml在4°C預(yù)冷的附加0.1 %二硫蘇糖醇的超純水，在離屯、機(jī)上1500化pm，4 °C離屯、25min，棄上清；
[0019] ⑤加入附加化Vml載體兩性電解質(zhì)和0.01 %二硫蘇糖醇的7M水化液150~20化1 即為百合總蛋白質(zhì)溶解液；
[0020] (3)百合總蛋白質(zhì)溶解液的質(zhì)量檢測(cè)
[0021] ①將雙層玻璃板豎直夾在灌膠架上，且雙層玻璃板的上方朝上并使雙層玻璃板上 方頂端面為水平，在雙層玻璃板之間灌入10%的分離膠，灌入的所述分離膠的上方頂面距 離雙層玻璃板中的短玻璃板的上方頂端面2cm，在所述分離膠上方頂面用無水乙醇封面，待 所述分離膠聚合且所述分離膠與無水乙醇分層后，倒去無水乙醇，然后在所述分離膠上方 頂面灌入5%的濃縮膠，灌入的所述5%的濃縮膠的上方頂面距離雙層玻璃板中的短玻璃板 的上方頂端面1cm，插入點(diǎn)樣梳，待所述濃縮膠聚合凝固后，將此雙層玻璃板轉(zhuǎn)入蛋白質(zhì)電 泳槽中，并在蛋白質(zhì)電泳槽中加入IX電泳緩沖液，拔去點(diǎn)樣梳，形成加樣孔，用注射器針尖 將加樣孔內(nèi)壁凸起的濃縮膠去掉使加樣孔內(nèi)壁平滑;取步驟步（2)⑤獲得的百合總蛋白質(zhì) 溶解液化1，加入化1的漠酪藍(lán)指示劑混勻后加入加樣孔中，加樣完畢后，接通電源，起始時(shí)， 用低電流5mA電泳或用低電壓50V電泳，待漠酪藍(lán)指示劑成一條線后，再加大電流為IOmA電 泳或加大電壓為150V電泳，待漠酪藍(lán)指示劑達(dá)到該雙層玻璃板底部邊緣時(shí)停止電泳;所述 雙層玻璃板為寬度相等長(zhǎng)度不等的兩塊玻璃板重疊放在一起且長(zhǎng)玻璃板和短玻璃板一端 對(duì)齊，長(zhǎng)玻璃板和短玻璃板沒有對(duì)齊的一邊為雙層玻璃板的上方，其長(zhǎng)玻璃板和短玻璃板 的寬度均為IOcm,長(zhǎng)玻璃板的長(zhǎng)度為8cm，短玻璃板的長(zhǎng)度為7cm;
[0022] ②停止電泳后，擦開雙層玻璃板，從雙層玻璃板中取出凝膠置于附加20%甲醇的 考馬斯亮藍(lán)G250染液中染色，再用脫色液脫色后，置于校準(zhǔn)型光密度儀上拍照并保存文件， 如果膠圖條帶清晰且無拖尾，表明所提取出來的蛋白質(zhì)質(zhì)量好，繼續(xù)進(jìn)行下一步百合總蛋 白質(zhì)的濃度測(cè)定；
[0023] (4)百合總蛋白質(zhì)的濃度測(cè)定
[0024] 取步驟(2)⑤獲得的百合總蛋白質(zhì)溶解液采用化a壯ord法測(cè)定其百合總蛋白質(zhì)的 濃度，測(cè)定的百合總蛋白質(zhì)濃度在化g/山W上，將步驟步(2)⑤獲得的百合總蛋白質(zhì)溶解液 置于-80°C保存；
[0025] (5)第一向等電聚焦 [00%]①上樣水化
[0027]用與步驟(2)⑤中相同的附加化Vml載體兩性電解質(zhì)和0.01%二硫蘇糖醇的7M水 化液將步驟(4)中于-80°C保存的百合總蛋白質(zhì)溶解液稀釋至化g/iil，取所稀釋的濃度為化 g/山的百合總蛋白質(zhì)溶解液30化1放入聚焦盤的槽內(nèi)，做好標(biāo)記，把預(yù)先解凍的固定化pH梯 度膠條的保護(hù)膜去掉，然后將固定化抑梯度膠條沿聚焦盤的一端放入聚焦盤的槽內(nèi)與聚焦 盤槽內(nèi)的百合總蛋白質(zhì)溶解液結(jié)合，讓聚焦盤槽內(nèi)的百合總蛋白質(zhì)溶解液被固定化抑梯度 膠條吸收2-3min，再在固定化pH梯度膠條上加入2~3ml礦物油水化14~16h;
[002引②聚焦
[0029] 將鹽橋用dd此0潤(rùn)濕后置于聚焦盤兩端;對(duì)好正、負(fù)極，蓋上蓋子，設(shè)置等電聚焦程 序進(jìn)行聚焦，所述的等電聚焦程序如下： 步驟 電壓 梯度 時(shí)間 Sl除鹽 250V 快逮 2,知 S2除鹽 1000 V 快速 2 5h
[0030] S3升壓 養(yǎng)OOV 線性 4細(xì) S4 聚焦 9()00￥ 快壤 65Q00v/h S5保持 500V 快速 5h 1:
[0031] ③第一次平衡；
[0032] ④第二次平衡；
[0033] (6)第二向 SDS-PAGE 電泳；
[0034] (7)染色、脫色；
[0035] (8)圖像采集，獲得百合總蛋白雙向電泳差異蛋白質(zhì)圖譜。
[0036] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的主