團和熒光淬滅基團分離，熒光產(chǎn)生，此項技術(shù)缺點是背景較高，探針容易降解，引物探針設(shè) 計受限制。
[0015] PNA-LNA-clamp 技術(shù)，米用 NestPCR 技術(shù)和 PNA-LNA-clamp 探針，PNA-LNA-clamp 探針特異性的封閉野生型SNP，阻止野生型模板擴增從而達到擴增突變的目的。雖然這項技 術(shù)很靈敏，但經(jīng)歷兩次PCR容易污染，探針設(shè)計也受到限制。
[0016] 高通量SNP檢測技術(shù)也有一些自身的優(yōu)勢，但是同時也存在著各自的缺陷。拿核 酸雜交反應的芯片技術(shù)來說，分辨率不高是由非特異性雜交導致的，容易出現(xiàn)假陽性的結(jié) 果；而等位基因特異性引物延伸反應和單堿基延伸反應的芯片技術(shù)都需要多色熒光系統(tǒng)和 對靶標進行的擴增、制備以及純化等步驟，最終使突變檢測工作操作起來費時耗力。
[0017] 因此開發(fā)出一種實用經(jīng)濟型的新型SNP檢測方法具有十分重要的意義。目前SNP 突變檢測技術(shù)，金標準還是"DNA測序"，但是DNA測序敏感性比較低，小于20%的核酸突變 比較難分辨，并且周期比較長；而ARMS技術(shù)，無論是敏感性、特異性還是可操作性均勝于測 序，已成功的推向臨床，用于SNP突變檢測，但是該技術(shù)的開發(fā)受到了 SNP鄰近核酸序列限 制，極大的限制了 ARMS的廣泛應用，很難滿足臨床上日益增多的SNP和基因突變的檢測需 求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0018] 針對上述問題，本發(fā)明提供了檢測人EGFR基因29種突變的引物和探針體系、方法 及試劑盒，該引物和探針體系具有很高的靈敏度，可以滿足低突變豐度樣本的檢測，即在野 生基因組DNA的背景下，可以完成較低突變基因含量的檢測，以高度的敏感性和特異性準 確區(qū)分樣本類型，發(fā)揮技術(shù)的最大優(yōu)勢：準確判斷患者對該類治療的預測療效，以供臨床醫(yī) 師參考，也盡最大努力篩選出有效人群，避免錯過治療。
[0019] 為解決上述問題，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)： 根據(jù)EGFR基因18、19、20和21外顯子的野生型和突變序列，經(jīng)過長期大量的試驗研 究，設(shè)計、篩選出一種檢測人EGFR基因29種突變的引物和探針體系，包括如SEQ ID No :1~ 26所示的核苷酸序列。
[0020] 設(shè)計一種檢測人EGFR基因29種突變的方法，包括以下步驟： (1) 合成出上述引物和探針； (2) 檢測特異性引物，在引物3' -末端起第2或第3位置引入脫氧次黃嘌呤核苷。
[0021] (3)配置熒光PCR反應體系，以FFPE組織或外周血游離DNA為模板，利用所述引物 和探針體系擴增人EGFR基因29種突變序列，收集熒光信號FAM和HEX ; (4)結(jié)果判定：檢測體系中，HEX通道15〈(^〈22，表明上樣在可控范圍內(nèi)，結(jié)果有效；以 FAM信號通道為陽性判斷標準，當曲線呈"S"曲線，且Ct〈29時為陽性，即存在檢測引物所對 應突變；Ct為O則為陰性，即不存在檢測引物所對應突變。
[0022] 優(yōu)選的，所述熒光PCR反應體系為：Buffer 5 μ L，Mg2+終濃度I. 0~5mmol/L， dNTP終濃度100~1000nmol/L，單條引物終濃度100~500nmol/L，單條探針終濃度100~ 1000nmol/L，Taq DNA聚合酶1~3U，DNA模板5~10ng，補充蒸饋水至50 μ L ; 優(yōu)選的，所述熒光PCR擴增條件為：酶激活，95°C IOmin;突變富集，95°C 30s，64°C 50s，72°C 25s，如此 16 個循環(huán)；擴增檢測，95°C 30s，58°C 32s，72°C 18s，如此 30 個循環(huán)。
[0023] 更優(yōu)選的，于"58°C 32s"步驟收集熒光信號FAM和HEX。
[0024] 優(yōu)選的，所述 Buffer 為 lOXBuffer。
[0025] 本發(fā)明還設(shè)計一種基于熒光PCR平臺檢測人EGFR基因突變的試劑盒，包括上述引 物和/或探針中的至少一種，對FFPE組織及外周血游離DNA的檢測同樣有效。
[0026] 本發(fā)明的積極有益效果在于： 本發(fā)明改良現(xiàn)有擴增受阻檢測體系，其創(chuàng)新點在于擯棄ARMS引物設(shè)計中，引入錯配的 原則；本發(fā)明在特異性檢測引物3' -末端起第2或第3個堿基，采用脫氧次黃嘌呤核苷代 替；脫氧次黃嘌呤核苷（dl)是天然存在的堿基，也稱肌苷，與A、G、C、T結(jié)合力弱，研究發(fā)現(xiàn) 當它與其它的堿基結(jié)合時，會比其它堿基錯配相對更穩(wěn)定；研究表明，脫氧次黃嘌呤與其它 堿基的結(jié)合能力為：dl :dC> dl :dA> dl :dG> dl :dT，因此在DNA聚合酶的催化下，脫氧次黃 嘌呤優(yōu)先與dC結(jié)合。
[0027] 基于上述技術(shù)構(gòu)思的本發(fā)明具有顯著的優(yōu)點： (1) 可同時檢測EGFR基因29種突變； (2) 最多可以檢測1~10拷貝的基因突變； (3) 特異性強，在10~30ng野生型DNA背景下不受干擾； (4) 檢測性能突出，在IOng DNA背景下，可以檢測出1~10拷貝的基因突變。
【具體實施方式】
[0028] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合具體實施例，對本 發(fā)明進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于 限定本發(fā)明。以下各實施例中所涉及試驗試劑，如無特別說明，均為市售，所涉及的方法步 驟，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
[0029] 以下實施例中檢測人EGFR基因29種突變的引物和探針體系如下表1所示。
[0030] 表1檢測人EGFR基因29種突變的引物和探針 CN 105177118 A 說明書 5/10 頁
[0031] 標準品是評價不同引物體系的核心，構(gòu)建出序列正確、濃度準確的標準品才能公 正和公平的評價不同突變檢測體系。本發(fā)明以EGFR基因突變?yōu)檠芯繉ο?，通過構(gòu)建EGFR 基因外顯子18、19、20和21基因突變，具體突變類型見表2,來評價本發(fā)明的檢測基因突變 的能力。
[0032] 表2人EGFR基因29種突變類型 CN 105177118 A 說明書 6/10 頁
[0033] 實施例1 一種檢測人EGFR基因29種突變的方法，包括以下步驟： (I)FFPE組織DNA提取 ① 將切片置于I. 5mL的EP管中，加入ImL二甲苯溶液，充分混勾，脫錯5min后離心去 除二甲苯，重復3次； ② 加入ImL無水乙醇充分混勻，離心去除液體，重復三次后，95%乙醇漂洗2 min，離心 去上清，90%乙醇I min，80%乙醇I min，70%乙醇I min;置于37°C烘干5~lOmin，讓乙醇 盡量揮發(fā)； ③ 使用Qiagen QIAamp FFPE DNA mini kit提取DNA，詳細操作流程參照試劑盒手冊； ④ 消化：加入180 μ L ATL Buffer和20 μ L蛋白酶K，56°C過夜直到組織完全被消化為 止； ⑤ 轉(zhuǎn)歸：消化結(jié)束后，90 ° C孵化1小時，其目的是ATL buffer在90°C可以逆轉(zhuǎn)部分 甲醛修飾的核酸； ⑥ 待溫度降至室溫，快速離心（14000rpm離心lmin)，收取上清； ⑦ 加入200 μ L AL混勻，再加入200 μ L無水乙醇混勻（可能產(chǎn)生白色絮狀物)，快速離 心收取上清（HOOOrpm離心Imin); ⑧ 將上清轉(zhuǎn)移到吸附株上，8000rpm離心Imin ; ⑨ 將吸附柱重新置于一個新的2mL收集管中，小心打開吸附柱蓋子，加入500 μ L AWl Buffer，8000rpm 離心 Imin ; ⑩ 棄廢液，小心加入 500 μLAW2Buffer，8000rpm離心lmin;離心柱置于新的l·5mL EP 管中，HOOOrpm 離心 2min ; Θ將吸附柱置于I. 5EP管中，加入100 μ L ATE buffer與吸附柱中央，65° C孵浴 5min，或常溫 IOmin ;14000rpm 離心 3min，備用； DNA濃度檢測：于260/280nm吸光度檢測DNA濃度和純度，一般Qiagen試劑盒的純 度 1. 7 ~1. 9〇
[0034] (2) PCR擴增轉(zhuǎn)染獲得質(zhì)粒，克隆到pGEM-T載體中，構(gòu)建成重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸 桿菌DH5a中，提取重組質(zhì)粒，測序鑒定，稀釋備用。
[0035] (3)制定標準品 ① 靈敏度標準品： 將構(gòu)建好的EGFR基因突變質(zhì)粒分別稀釋為1、3、101、102、103、IO 4和10 5Copies備用，該 標準品用于評價各個方法檢測的敏感性； ② 特異性標準品I : 采用Qiagen DNA Blood kit于健康人全血提取人基因組DNA，DNA濃