檢測人egfr基因29種突變的引物和探針體系、方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測人EGFR基因29種突變的引物 和探針體系、方法及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 大量研究表明，在非小細胞肺癌（NSCLC)人群中40%左右的患者攜帶表皮生長因 子受體（EGFR)基因的體細胞突變，這些突變與絡(luò)氨酸激酶抑制劑（TKIs)療效有明確的相 關(guān)性，如易瑞沙（Iressa)和特羅凱（Tarceva)等藥物。其中，不含T790M突變，但攜帶EGFR 基因其它位點突變的NSCLC患者在接受易瑞沙和特羅凱治療時療效顯著，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)EGFR 外顯子20上的T790M位點為耐藥位點，會抑制易瑞沙和特羅凱等藥物的療效。
[0003] EGFR基因位于7號染色體上，包含28個外顯子，其酪氨酸激酶功能區(qū)由18~24 外顯子編碼，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)NSCLC患者的EGFR基因突變主要發(fā)生在18~21外顯子，其中以 19外顯子上的缺失突變和21外顯子上的點突變居多；主要突變類型包括18外顯子上的點 突變（G719X)約占5%，19外顯子上的缺失突變(主要位于747~750位氨基酸)約占45%，20 外顯子上的插入突變約占1%，20外顯子上的耐藥點突變（T790M)約占5%，21外顯子上的點 突變（L858R和L861Q)約占40~45%。
[0004] 目前的基因突變檢測方法如突變擴增阻滯系統(tǒng)（amplification refractory mutation system，ARMS)、TaqMan技術(shù)等，雖然廣泛應(yīng)用在臨床檢測工作中，但是其聚合酶 鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR)引物存在以下缺點：（1)特異性不好，診斷基 因突變位點設(shè)計引物容易產(chǎn)生非特異性擴增，影響檢測效率和準確性；（2)選擇性不好，在 高濃度野生型背景下，檢測低拷貝能力較差；（3)敏感性和分辨率較差，受到引物設(shè)計的限 制，導致檢測的敏感性差，分辨率不高。
[0005] 隨著基因時代的開啟，分子診斷技術(shù)在臨床輔助診斷中扮演越來越重要的角 色，如SNP、基因突變等檢測逐步應(yīng)用于臨床的輔助診斷和個性化用藥。核酸檢測技術(shù) (nucleic acid amplification testing，NAT)包含兩種擴增方式：對革E核酸直接擴增和信 號擴增。對革E序列的擴增又可以分為等溫擴增（isothermal amplification，IA)和聚合 鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR)。等溫擴增技術(shù)包含：轉(zhuǎn)錄介導的擴增方法 TMA (transcription mediated amplification)、 NASBA (Nucleic acid sequence-based amplification)、SDA (strand displacement amplification)等。
[0006] 轉(zhuǎn)錄介導擴增（transcription mediated amplification，TMA)由 Dr. Larry Mimms發(fā)明，并且其公司Gen-Probe 2004年因此獲得美國國家技術(shù)獎（National Medal of Technology)。TMA反應(yīng)體系需要兩種酶的共同作用：鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶（Moloney murine leukemia virus，MMLV)和T7 RNA多聚酶；在42。C恒溫條件下來擴增DNA或RNA 的反應(yīng)系統(tǒng)。擴增原理為：在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下，目標序列以引物為引導來進行逆轉(zhuǎn)錄，在雜 合鏈上的RNA通過逆轉(zhuǎn)錄酶的RNA酶H活性降解以后，合成雙鏈的DNA ;且在T7 RNA多聚 酶的作用下，轉(zhuǎn)錄出數(shù)以萬計的目標RNA序列，所轉(zhuǎn)錄出的RNA可以作為模板來進行下一個 循環(huán)，整個反應(yīng)過程是一個自催化過程。
[0007] 依賴核酸序列的擴增技術(shù)（nucleic acid sequence-based amplification， NASBA)的擴增原理與TMA擴增原理相似，但在提取核酸和產(chǎn)物擴增檢測的方法上存在 不同，這兩種擴增方法的靈敏度較高、特異性強、反應(yīng)條件相對簡單、擴增效率高，均無 需專門的擴增儀器。TMA和NASBA，由于其高效的擴增能力，廣泛用于血液中乙型肝炎 病毒（hepatitis B virus，HBV)、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV)和艾滋病毒 (hepatitis I virus，HIV)的篩查，但是其擴增基因突變和SNP的能力尚未得到驗證。
[0008] 基于等溫擴增開發(fā)的SNP或基因突變的檢測雖然較少，如Invader和SMART amplification，但是Invader技術(shù)已經(jīng)推廣于臨床SNP和基因突變的檢測。Invader技術(shù) 可以認為是一種信號放大技術(shù)，該技術(shù)不以模板擴增為核心，主要通過信號系統(tǒng)本身的不 斷放大從而達到基因檢測的目的。Invader技術(shù)原理：Invader技術(shù)設(shè)計了一套非常特別的 invader和空間結(jié)構(gòu)識別內(nèi)切酶。當檢測有突變存在，酶切下primary probel的5'-端序 列，作為下一個反應(yīng)的invader，信號持續(xù)產(chǎn)生。SMRAT為模板擴增的等溫擴增技術(shù)，檢測基 因突變主要依賴于Mut蛋白，當無突變，檢測突變的引物與模板結(jié)合時3' -端有錯配，Mut 蛋白結(jié)合抑制Bst聚合酶的延伸。上述的兩種等溫突變檢測技術(shù)，需要一個95° C變性后 降溫然后加酶的過程，不易于臨床接受和開展。
[0009] 此外，Junction probes (JP)和 Three Way Junction (3WJ)突變檢測信號系統(tǒng)， 這兩項技術(shù)不能獨自檢測基因突變，需要PCR等過程擴增出數(shù)以萬計的單鏈DNA，再應(yīng)用該 技術(shù)雜交，臨床應(yīng)用價值很低，但該技術(shù)引出類似"短片段引物雜交"的雛形。JP和3WJ技 術(shù)原理，簡述如下：step 1，在特定的反應(yīng)條件和祀序列存在下，探針PB錨定祀序列；step 2,探針PA識別SNP并于PB和靶序列形成穩(wěn)定的Y型結(jié)構(gòu)；step3,限制性內(nèi)切酶-CviQ (1) 識別酶切位點并切割下淬滅基團產(chǎn)生熒光；step4,位于PB上的酶切位點堿基之間被硫 代，所以無法酶切而保留完整，PA切斷后，殘余片段無法與PB和靶序列形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)而脫 落；剩余PB和靶序列在進入下一步循環(huán)放大。
[0010] 聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR)發(fā)明之后，基于PCR開發(fā)的基因突變技術(shù)不斷衍生出新 的檢測手段和技術(shù)，如：PCR-RFLP，allele-s印ecific PCR，TaqMan probe，ARMS，PNA-LNA clamp 焚光 PCR、Cycleave probe PCR，Nanofluidic Digital PCR Arrays，MassArray 和 DNA芯片等等。
[0011] PCR-RFLP是在早期實驗中開發(fā)的檢測SNP分型技術(shù)，主要優(yōu)點在于可以巧妙地選 擇出限制性內(nèi)切酶來切出可用于分辨突變位點的短片段長度多態(tài)，不過PCR-RFLP需要電 泳分離酶消化后的產(chǎn)物，會嚴重制約反應(yīng)的通量和實驗操作的自動化。
[0012] ARMS技術(shù)與allele-s印ecific PCR大致相同，利用DNA聚合酶缺失3'~5'端的 外切活性，3'端錯配的引物低于正常引物的延伸速度，當錯配數(shù)目達到一定的嚴謹程度時， 3'端則無法延伸，如果PCR有條帶，說明有相應(yīng)的突變。ARMS技術(shù)敏感性和特異較高，已經(jīng) 成功應(yīng)用于臨床檢測SNP，但是ARMS技術(shù)引物和探針的設(shè)計受到突變鄰近堿基的局限，大 大的限制該技術(shù)的廣泛使用。
[0013] TaqMan探針是寡核酸探針，有熒光報告基團連接在探針的3'末端，有熒光淬滅基 團連接在探針的5'末端。在探針完整的情況下，淬滅基團可以吸收報告基團發(fā)射的熒光信 號，在PCR擴增時，結(jié)合到靶DNA鏈上的探針的淬滅基團將被Taq酶的5'外切酶活性切除 掉，將探針的熒光報告基團和淬滅基團分離，最終熒光信號將被熒光監(jiān)測系統(tǒng)接收到。通過 應(yīng)用不一樣的熒光報告基團，在同一個PCR反應(yīng)中可以同時檢測不一樣的酶切消化的等位 基因特異性探針。這樣的5'外切酶實驗在當今己經(jīng)可以成功用來區(qū)分一些只含有一個堿 基不同的等位基因。即管如此，TaqMan探針技術(shù)也遇到ARMS技術(shù)同樣的開發(fā)瓶頸。
[0014] Cycleave probe PCR，技術(shù)原理類似TaqMan探針，只是探針含有一個rNTP堿基于 SNP互補，當存在突變時，rNTP與突變配對，RNase H識別并切割rNTP，使探針的熒光報告基