79]barF:AGTCGACCGTGTACGTCTCC
[0080]barR:GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC
[0081]gus-plusF:CACGGTGCCGGCCTATCTGA
[0082]gus-plusR:GCTTGCGACCACTTTGCCTTCCT
[0083]0smiR156F:CACCACAGTTTAATTTATTTCTTGG
[0084]0smiR156R:CTAGGCAGAAAATTTAACAGGAG
[0085]PCR的擴增條件為:95°C，2min ;接著進行30個循環(huán)，每個循環(huán)的條件為。94°C，30s ；55°C, 30s ；72°C, 30s ;最后 72°C，1min0
[0086]所述的多基因遺傳轉化效率通過PCR檢測包含外源基因/序列(hph、nptll、COMT-RNA1、bar、gus-plus和0smiR156)的植株數(shù)目:農(nóng)桿菌侵染前的愈傷組織塊數(shù)目計算獲得。
[0087]使用實例I中篩選獲得的部分單一基因型高質量胚性愈傷系檢測的柳枝稷多基因遺傳轉化效率大于30%，其中實例I中農(nóng)桿菌侵染最高的愈傷系的多基因遺傳轉化效率為60%，能夠同時轉化至少6個外源基因至柳枝稷中，每人每年可轉化200個基因載體，產(chǎn)生大于3000棵含有多個不同外源目的基因的轉基因柳枝稷植株。
[0088]本發(fā)明技術方案不僅適用于柳枝稷，還適用于芒草等自交不親和的禾本科能源草和牧草的多基因遺傳轉化體系建立。
[0089]最后所應說明的是，以上實施例僅用于說明本發(fā)明的技術方案而非限制，盡管上述實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，因此任何對本發(fā)明方案的修改或者等同替換，均不脫離本發(fā)明技術方案的精神和范圍。
【主權項】
1.一種植物多基因遺傳轉化的方法，其特征在于它的內容包括: 單一基因型尚質量尚農(nóng)桿菌侵染率的胚性愈傷系的建立; 含有不同雙元載體的農(nóng)桿菌侵染上述愈傷系，并通過雙抗篩選獲得含有多個不同外源基因的轉基因植物陽性植株。2.根據(jù)權利要求1所述的一種植物多基因遺傳轉化的方法，其特征在于所述的單一基因型高質量胚性愈傷系的外部特征為淡黃色、結構疏松且具有溫潤的光澤，其建立的方法包括:植物成熟種子的單一基因型愈傷系建立，高質量胚性愈傷系通過目視法篩選和愈傷系再生率評價法獲得，最終獲得的所有單一基因型高質量胚性愈傷系的再生率均大于.90%。3.根據(jù)權利要求1所述的一種植物多基因遺傳轉化的方法，其特征在于所述的用于農(nóng)桿菌侵染效率評價的植物愈傷組織來自上述篩選所獲得多個單一基因型的高質量胚性愈傷系，其中，來自每個愈傷系中的所有細胞均具有相同的基因背景，農(nóng)桿菌侵染效率評價具體方法為將含有PANIC6A雙元載體農(nóng)桿菌菌液與單一基因型高質量胚性愈傷系進行共孵育，選擇侵染效率大于30%的愈傷系即為單一基因型高質量高農(nóng)桿菌侵染率的胚性愈傷系，然后進行繼代擴繁，并用于后續(xù)的多基因高效遺傳轉化方法的建立。4.根據(jù)權利要求1所述的一種植物多基因遺傳轉化的方法，其特征在于所述的農(nóng)桿菌菌株為EHA105或AGL1。5.根據(jù)權利要求1所述的一種植物多基因遺傳轉化的方法，其特征在于所述的雙元載體分別含有潮霉素和雙丙氨膦抗性基因，并且適合本發(fā)明使用的質粒含有一個或一個以上的不同目的基因。6.根據(jù)權利要求5所述的一種植物多基因遺傳轉化的方法，其特征在于目的基因是耐除草劑基因、細胞壁調控基因、分蘗數(shù)目決定基因、莖桿粗細控制基因、開花基因或逆境抗性基因。7.根據(jù)權利要求1所述的一種植物多基因遺傳轉化的方法，其特征在于所述的植物為單子葉禾本科自交不親和植物。8.根據(jù)權利要求1所述的一種植物多基因遺傳轉化的方法，其特征在于所述雙抗性篩選的試劑為潮霉素和雙丙胺磷。9.根據(jù)權利要求1所述的一種植物多基因遺傳轉化的方法，其特征在于它的具體步驟包括植物成熟種子愈傷組織誘導、單一基因型高質量高農(nóng)桿菌侵染率的胚性愈傷組織系的獲得以及農(nóng)桿菌介導的多基因遺傳轉化步驟； 所述的植物成熟種子愈傷組織誘導，把植物的成熟種子消毒清洗后接種于愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，培養(yǎng)箱溫度25 ± 2°C，暗培養(yǎng)6-7周，獲得愈傷組織； 所述的種子愈傷組織誘導培養(yǎng)基MSD5為MS基本培養(yǎng)基添加30g/L蔗糖、5mg/L2，4_D和7.5g/L瓊脂，高壓滅菌15min，pH = 5.8 ； 所述的單一基因型高質量高農(nóng)桿菌侵染率的胚性愈傷組織系的獲得:把所獲得的愈傷組織采用目視法進行篩選，選擇其中淡黃色、結構疏松且具有溫潤的光澤的胚性愈傷組織為高質量胚性愈傷組織，將獲得的高質量胚性愈傷組織分出一半愈傷組織接種到MSK2培養(yǎng)基上，組培室溫度25±2°C，光照時間每天16h光/8h暗，培養(yǎng)4-5周，獲得再生芽，并進行再生效率的評估，然后選擇再生率大于90 %的愈傷系進行繼代，培養(yǎng)箱溫度25 ± 2°C，暗培養(yǎng)3-4個周，然后用于農(nóng)桿菌侵染效率的評估，最后選擇農(nóng)桿菌侵染效率大于30%的愈傷系即為單一基因型高質量高農(nóng)桿菌侵染率的胚性愈傷組織系，然后進行擴繁，培養(yǎng)箱溫度.25±2°C，暗培養(yǎng)，每3-4周繼代一次； 所述的農(nóng)桿菌介導的多基因遺傳轉化，把所述的擴繁的單一基因型高質量高農(nóng)桿菌侵染率的胚性愈傷組織系中的愈傷組織分成小塊，然后置于三通干燥皿中抽真空，使用含有不同雙元載體的農(nóng)桿菌菌液對所述的單一基因型高質量高農(nóng)桿菌侵染率的胚性愈傷組織進行共孵育，然后去除殘留的農(nóng)桿菌菌液，25±2°C，黑暗中共培養(yǎng)3天，將共培養(yǎng)后的愈傷組織轉接于抗性愈傷組織篩選培養(yǎng)基MSD3HB進行篩選，培養(yǎng)箱溫度25±2°C，暗培養(yǎng)，每3個周轉接一次，直到抗性愈傷組織長出，將獲得的抗性愈傷組織轉接到抗性愈傷組織篩選培養(yǎng)基MSK2HB上，組培室溫度25±2°C，光照時間每天16h光/8h暗，每4個周轉接一次，直到抗性芽長出；獲得的抗性再生芽轉接至生根培養(yǎng)基MSRHB上，組培室溫度25±2°C，光照時間每天16h光/Sh暗；獲得的再生苗按照常規(guī)方法移栽到土中，2周后再生苗成活； 所述的抗性愈傷組織篩選培養(yǎng)基MSD3HB為MS基本培養(yǎng)基添加30g/L蔗糖、3mg/L2, 4-D、30mg/L潮霉素、2.4mg/L雙丙胺磷、400mg/L頭孢塞肟鈉和7.5g/L瓊脂，高壓滅菌.15min，pH = 5.8 ； 所述的抗性芽再生培養(yǎng)基MSK2HB為MS基本培養(yǎng)基添加30g/L蔗糖、2mg/L激動素、.10mg/L潮霉素、1.2mg/L雙丙胺磷、400mg/L頭孢塞肟鈉和7.5g/L瓊脂，高壓滅菌15min，pH=5.8 ； 所述的抗性芽生根培養(yǎng)基MSRHB為1/2MS基本培養(yǎng)基添加15g/L蔗糖、10mg/L潮霉素、.1.2mg/L雙丙胺磷、400mg/L頭孢塞H虧鈉和7.5g/L瓊脂，高壓滅菌15min，pH = 5.8。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種植物多基因遺傳轉化的方法，屬于植物生物工程技術領域。它的內容包括單一基因型高質量高農(nóng)桿菌侵染率的胚性愈傷系的建立；含有不同雙元載體的農(nóng)桿菌侵染上述愈傷系，并通過雙抗篩選獲得含有多個不同外源基因的轉基因陽性植株。主要用于解決植物難于遺傳轉化和多性狀綜合改良的難題。實驗數(shù)據(jù)表明，采用本發(fā)明的方法能夠在4-5個月內成功獲得具有單一基因型背景的陽性轉基因植物，遺傳轉化效率最高可達60％,能夠實現(xiàn)每人每年轉化200個基因載體，產(chǎn)生大于3000棵獨立的含有多個不同外源目的基因的陽性轉基因植株的工作效率。
【IPC分類】A01H5/00, C12N15/84
【公開號】CN105177042
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】付春祥, 吳風燕, 曹英萍, 王增裕, 周功克
【申請人】中國科學院青島生物能源與過程研究所
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年8月25日