保存30s，不褪色為滴定終點，記錄消耗氫氧化鈉標 準溶液的體積。
[0072] 脂肪酶的酶活力按下列公式計算：
[0074] 式中：
[0075] Xl 樣品的酶活力，u/mL;
[0076] Vl 滴定樣品時消耗氛氧化納標準溶液體積，mL ;
[0077] V2一一滴定空白時消耗氫氧化鈉標準溶液體積，mL ;
[0078] c--氫氧化鈉標準溶液的濃度，moL/L ;
[0079] 50--〇· 05moL/L氫氧化鈉溶液1.0 OmL相當于脂肪酸50 μ moL ;
[0080] η一一酶液稀釋倍數(shù)；
[0081] 0. 05-氫氧化鈉標準溶液濃度換算系數(shù)；
[0082] 1/15--反應時間 15min，以 Imin 計；
[0083] 所得實驗結果表示至整數(shù)。
[0084] 按照上述方法測得里氏木霉AFLip搖瓶發(fā)酵液中脂肪酶酶活為700U/mL。從而說 明，本發(fā)明構建的重組菌株里氏木霉AFLip能高效表達脂肪酶AFLip。
[0085] 4. 2酶學性質分析
[0086] (1)最適pH分析：
[0087] 分別用 pH 值為 2· 0、2· 5、3· 0、4· 0、5· 0、5· 5、6· 0、6· 5、7· 0、7· 5、8. 0 的緩沖液稀釋 里氏木霉AFLip發(fā)酵上清液，在40°C條件下測定其酶活，以最高酶活為100%，計算相對酶 活，做作用PH-相對酶活曲線。結果如圖1所示，本發(fā)明提供的脂肪酶AFLip的最適作用pH 為7. 0,且在pH3. 0-4. 0, pH6. 0-7. 0范圍內能保持50%以上的酶活。
[0088] (2)最適溫度分析：
[0089] 分別在 20°C、30°C、35°C、40°C、45°C、50°C、55°C，ρΗ7· 5 條件下測定里氏木霉 AFLip發(fā)酵上清液的酶活，以最高酶活為100%，計算相對酶活，做作用溫度-相對酶活 曲線。結果如圖2所示，本發(fā)明提供的脂肪酶AFLip的最適作用溫度為40-50°C，且能在 30-50°C范圍內保持85 %以上的酶活。
[0090] (3) pH耐受性分析：
[0091] 分別用pH值為2. 0、3. 0、4. 0、5. 0、6. 0、7. 0、8. 0的緩沖液稀釋里氏木霉AFLip發(fā) 酵上清液；40°C保溫30min后，分別測定其酶活力，以未處理的上清液酶活力為100%，計算 酶活殘留率，具體結果見表1。
[0092] 表1在不同pH條件下處理30min后脂肪酶AFLip的酶活殘留情況
[0094] 從表1的結果可以看出：本發(fā)明提供的脂肪酶AFLip在pH2. 0-7. 0的范圍內的酶 活殘留率均高于80%，從而說明脂肪酶AFLip具有寬泛的pH適用范圍，且在中性和酸性條 件下具有很強的耐受性。
[0095] 實施例5體外酶解的實驗
[0096] (1)胃液和胃蛋白酶耐受性
[0097] 先將里氏木霉AFLip發(fā)酵上清液以pH2. 0的人工胃酸稀釋至適當倍數(shù)；然后分別 以pH2. 0的人工胃酸和胃蛋白酶在40°C條件下處理2h后，在40°C，pH7. 5條件下測定其殘 留酶活，以未處理的上清液酶活為100%，計算酶活殘留率。具體結果見表2。
[0098] (2)ρΗ6·8、胰蛋白酶耐受性
[0099] 先將里氏木霉AFLip發(fā)酵上清液以ρΗ6. 8的緩沖液稀釋至適當倍數(shù)；然后分別以 ΡΗ6. 8的緩沖液和胰蛋白酶在40°C條件下處理6h后，在40°C，ρΗ7. 5條件下測定其殘余酶 活，以未處理的上清液酶活為100%，計算酶活殘留率，具體結果見表2。
[0100] 表2在體外模擬動物胃、腸環(huán)境下脂肪酶AFLip的酶活殘留情況
[0102] 從表2的數(shù)據(jù)可以看出，本發(fā)明提供的脂肪酶AFLip對胃液/胃蛋白酶和胰蛋白 酶均具有較好的耐受性，從而說明脂肪酶AFLip能有效適應動物的胃、腸道環(huán)境，并能保持 較高的酶活水平，為其在飼料中的應用奠定基礎。
[0103] 實施例6脂肪酶AFLip對肉雞生產(chǎn)性能的影響
[0104] 1.材料與方法
[0105] I. 1試驗動物與分組
[0106] 六和種雞場提供的羅斯肉雛雞300只，隨機分為3個處理，每個處理10個重復，每 個重復10只肉雞。具體分組設計見表3。
[0107] 表3試驗分組設計
[0109] 1.2試驗樣品
[0110] 本試驗選用本發(fā)明實施實例4制備得到的脂肪酶AFLip。
[0111] 1.3測定指標
[0112] 分別在肉雞0d、7d、21d、35日齡時，對各欄試驗雞統(tǒng)一進行稱重并記錄采食量，計 算日增重（ADG)、日采食量、料肉比（FCR)和體重（BW)等指標。
[0113] 1. 4數(shù)據(jù)處理與分析
[0114] 試驗數(shù)據(jù)采用SPSS13. 0統(tǒng)計軟件中ANOVA方法進行分析，所有指標以每個重復為 試驗單位，用Duncan's多重比較進行檢驗。結果用均值及平均標準差表示，P〈0. 05為差異 顯著。
[0115] 2.結果與分析
[0116] 本發(fā)明提供的脂肪酶AFLip對0-35日齡肉雞生產(chǎn)性能影響
[0117] 表4脂肪酶AFLip對0-35日齡肉雞生產(chǎn)性能的影響
[0119] 注：表中數(shù)字右上角字母有相同字母或沒有標注者者表示差異不顯著（P > 〇· 05)，字母不同表示差異顯著（P < 0· 05)
[0120] 由表4肉雞0-35d試驗結果可知，全期來看試驗組肉雞日增重在正對照組基礎 上提高了 4. 73%，在負對照組基礎上提高了 6. 82%，料肉比在負對照組基礎上降低了 4. 65%。試驗組肉雞日增重、采食量均高于正對照組和負對照組。在此階段負對照組即降低 油脂組，在采食量、日增重和料肉比等方面均不及其它組?？傮w來看試驗組優(yōu)勢較為明顯。 試驗全期增重料肉比均較好，優(yōu)于其它各組。
[0121] 上述實驗結果表明，本發(fā)明提供的脂肪酶AFLip能顯著提高飼料中油脂類物質的 利用率。在日糧中降低油脂的添加量后添加脂肪酶AFLip，肉雞的生產(chǎn)性能不僅優(yōu)于負對 照，還明顯優(yōu)于正對照，因此，使用本發(fā)明提供的脂肪酶能夠顯著減少油脂的添加，從而降 低飼料成本，增加養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟效益。
【主權項】
1. 一種脂肪酶，其特征在于，所述的脂肪酶包含有： 1) 氨基酸序列為SEQIDNO:1的脂肪酶； 2) 在1)中的脂肪酶氨基酸序列上發(fā)生取代、缺少或添加一個或幾個氨基酸，且具有1) 中的脂肪酶酶學性質的酶。2. -種基因，其特征在于，所述的基因編碼權利要求1所述的脂肪酶。3. 如權利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列為SEQIDNO:2。4. 一種重組質粒，其特征在于，所述的重組質粒攜帶有權利要求2或3所述的基因。5. -種重組工程菌，其特征在于，所述的重組工程菌為攜帶有權利要求4所述的重組 質粒的宿主菌。6. 如權利要求5所述的重組工程菌，其特征在于，所述的宿主菌為里氏木霉 (Trichodermareesei)〇7. 權利要求1所述的脂肪酶在制備畜禽飼料中的應用。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種新型脂肪酶，其氨基酸序列為SEQ？ID？NO：1。本發(fā)明提供的新型脂肪酶AFLip在pH3.0-4.0，pH6.0-7.0范圍內能保持50％以上的酶活，具有寬泛的pH適用范圍，且在中性和酸性條件下具有很強的耐受性；最適作用溫度為40-50℃，且能在30-50℃范圍內保持85％以上的酶活。本發(fā)明提供的脂肪酶AFLip對胃液/胃蛋白酶和胰蛋白酶均具有較好的耐受性，能有效適應動物的胃、腸道環(huán)境，并能保持較高的酶活水平，因此更有利于其在飼料添加劑領域的應用。本發(fā)明所述脂肪酶AFLip能有效提高飼料中油脂類物質的利用率，從而顯著提高肉雞的采食量和日增重，降低料肉比，提高養(yǎng)殖動物的生產(chǎn)性能，增加經(jīng)濟效益，應用前景廣泛。
【IPC分類】C12N15/80, C12R1/885, C12N1/15, A23K1/165, C12N9/20, C12N15/55
【公開號】CN105176945
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】李賓, 張青, 王華明, 黃亦鈞
【申請人】青島蔚藍生物集團有限公司
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年10月21日