一種新型脂肪酶的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程技術領域，具體涉及一種新型脂肪酶及其應用。
【背景技術】
[0002] 脂肪酶是一類具有多種催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性 酯類的水解、醇解、酯化、轉(zhuǎn)酯化及酯類的逆向合成反應，除此之外還表現(xiàn)出其他一些酶的 活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、膽固醇酯酶、酰肽水解酶活性等。脂肪酶具有廣泛的應用價 值，已成為市場上的第三大工業(yè)用酶。脂肪酶可以催化解脂、酯交換、酯合成等反應，廣泛應 用于飼料添加劑、油脂加工、食品、醫(yī)藥、日化等工業(yè)。
[0003] 脂肪酶廣泛的存在于動植物和微生物中。植物中含脂肪酶較多的是油料作物的 種子，如蓖麻籽、油菜籽，當油料種子發(fā)芽時，脂肪酶能與其他的酶協(xié)同發(fā)揮作用催化分解 油脂類物質(zhì)生成糖類，提供種子生根發(fā)芽所必需的養(yǎng)料和能量；動物體內(nèi)含脂肪酶較多的 是高等動物的胰臟和脂肪組織，在腸液中含有少量的脂肪酶，用于補充胰脂肪酶對脂肪消 化的不足，在肉食動物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。在動物體內(nèi)，各類脂肪酶控制 著消化、吸收、脂肪重建和脂蛋白代謝等過程；細菌、真菌和酵母中的脂肪酶含量更為豐富 (Pandey 等）。
[0004] 脂肪酶在生物體內(nèi)具有相當重要的生理功能，外源脂肪需要經(jīng)過脂肪酶消化分解 后才能透過細胞膜，體內(nèi)脂肪的儲藏和動用也少不了脂肪酶，脂肪酶也參與細胞內(nèi)脂類代 謝。脂肪酶分解三酰甘油產(chǎn)生的單酰甘油、脂肪酸和甘油，除了作為生物體的能源外，還是 合成磷脂、鞘脂等具有重要生理功能的類脂的前體。
[0005] 作為主要的飼用酶制劑，脂肪酶已被普遍應用于畜禽養(yǎng)殖中。人們通過在飼料中 添加脂肪酶，可以有效補充養(yǎng)殖動物內(nèi)源消化酶的不足，降低營養(yǎng)性腹瀉的發(fā)生率，提高飼 料中脂肪的消化率和利用率，促進養(yǎng)殖動物對脂肪溶性維生素和其他微量元素的吸收利 用，進而能大幅度提高飼料報酬，降低飼料成本，增加養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟效益。因此，對高酶活、 性能優(yōu)良的脂肪酶的篩選和研究仍是目前飼用酶制劑領域的研究熱點之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種新型脂肪酶及其在飼料中的應用。本發(fā)明利用分子生物 學手段從煙曲霉（Aspergillus fumigatus)中克隆得到一種新型脂肪酶，其在中性和酸性 環(huán)境中能保持較高的酶活力，且對胃蛋白酶和胰蛋白酶均具有較好的耐受性，這些特性使 得該酶更適合應用于動物飼料中。
[0007] 本發(fā)明一方面提供了一種新型脂肪酶，其氨基酸序列為SEQ ID NO :1。
[0008] 所述脂肪酶的編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID NO :2。
[0009] 本發(fā)明還提供攜帶有上述脂肪酶基因的質(zhì)粒。
[0010] 本發(fā)明還包括攜帶有上述質(zhì)粒的里氏木霉（Trichoderma reesei)。
[0011] 本發(fā)明提供的新型脂肪酶AFLip在pH3. 0-4. 0, pH6. 0-7. 0范圍內(nèi)能保持50%以 上的酶活，具有寬泛的pH適用范圍，且在中性和酸性條件下具有很強的耐受性；最適作用 溫度為40-50°C，且能在30-50°C范圍內(nèi)保持85%以上的酶活。本發(fā)明提供的脂肪酶AFLip 對胃液/胃蛋白酶和胰蛋白酶均具有較好的耐受性，能有效適應動物的胃、腸道環(huán)境，并能 保持較高的酶活水平，因此更有利于其在飼料添加劑領域的應用。本發(fā)明所述脂肪酶AFLip 能有效提高飼料中油脂類物質(zhì)的利用率，從而顯著提高肉雞的采食量和日增重，降低料肉 比，提高養(yǎng)殖動物的生產(chǎn)性能，增加經(jīng)濟效益，應用前景廣泛。
【附圖說明】
[0012] 圖1為脂肪酶AFLip作用pH-相對酶活曲線；
[0013] 圖2為脂肪酶AFLip作用溫度-相對酶活曲線。
【具體實施方式】
[0014] 本發(fā)明用到了遺傳工程和分子生物學領域使用的常規(guī)技術和方法，例如
[0015] MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook，2001)和 CURRENTPR0T0C0LS IN MOLECULAR BIOLOGY (AusubeL, 2003)中所記載的方法。這些一般性 參考文獻提供了本領域技術人員已知的定義和方法。但是，這并不意味著將本發(fā)明限定于 所述的任何具體方法、實驗方案和試劑，因為它們可以改變。
[0016] 除非在本文中另作限定，本文所用的全部技術術語和科學術語具有本發(fā)明 所屬領域的普通計數(shù)人員通常所理解的相同含義。DICTIONARY 0FMICR0BI0L0GY AND M0LECULARBI0L0GY, 3nd Ed. (SingLeton et aL.，2006)和 COLLINS DICTIONARY BIOLOGY(HaLe etaL.，2003)為技術人員提供了本發(fā)明中所使用的許多術語的一般性解釋。
[0017] 除非另作說明，核酸是按5'至3'方向從左至右書寫；氨基酸是按氨基至羧基的 方向從左至右書寫。
[0018] 如本文所用，術語"脂肪酶"即三?；视王；饷福呋烊坏孜镉椭?， 生成脂肪酸、甘油和甘油單酯或二酯。其基本組成單位僅為氨基酸，通常只有一條多肽鏈。 它的催化活性決定于它的蛋白質(zhì)結(jié)構。
[0019] 如本文所用，術語"重組"當被用于指代細胞、核酸、蛋白或載體時，表示該細胞、核 酸、蛋白或載體已通過導入異源核酸或蛋白或者通過改變天然核酸或蛋白而被修飾。因此， 例如，重組細胞是表達在天然（非重組）形式的該細胞中不曾發(fā)現(xiàn)的基因，或者表達天然基 因。
[0020] 術語"蛋白質(zhì)"和"多肽"在本文中可以互換使用。本文使用氨基酸殘基的傳統(tǒng)的 單字母或三字母代碼。
[0021] 如本文所用，術語"基因"指參與生產(chǎn)多肽的DNA片段，包括編碼區(qū)之前和之后的 區(qū)域，以及各編碼片段（外顯子）之間的插入序列（內(nèi)含子）。
[0022] 術語"核酸"包括DNA、RNA，單鏈或雙鏈的，以及它們的化學修飾物。
[0023] 術語"核酸"和"多核苷酸"在本文中可以互換使用。
[0024] 術語"載體"指被設計用來將核酸導入一種或多種細胞類型的多核苷酸序列。載 體包括克隆載體、表達載體、穿梭載體、質(zhì)粒、噬菌粒、序列盒以及類似物。
[0025] 術語"表達載體"表示包含DNA序列的DNA構建物，所述DNA序列被可操縱的連接 于能夠影響該DNA在合適宿主中表達的合適的控制序列。此類控制序列可以包括完成轉(zhuǎn)錄 的啟動子、可選的控制轉(zhuǎn)錄的操縱子序列、編碼mRNA上合適的核糖體結(jié)合位點的序列、增 強子以及控制轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止的序列。
[0026] 術語"啟動子"表示參與結(jié)合RNA聚合酶以啟動基因轉(zhuǎn)錄的的調(diào)控序列。啟動子 可以是誘導型啟動子或組成型啟動子。
[0027] 與另一序列具有某一百分比的序列同一性的多核苷酸或多肽是指，在比較這兩個 序列時所述百分比的堿基或氨基酸殘基是相同的。
[0028] 由于遺傳密碼是簡并的，所以可以使用一種以上的密碼子來編碼特定的氨基酸， 本發(fā)明包括編碼特定的氨基酸序列的多核苷酸。
[0029] 術語"宿主菌株"或"宿主細胞"是指表達載體或DNA構建物的合適宿主，所述表 達載體或DNA構建物包含本發(fā)明的編碼脂肪酶的多核苷酸。
[0030] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進行詳細的描述。
[0031] 實施例1脂肪酶基因的克隆
[0032] 1)提取煙曲霉總基因組DNA
[0033] 將煙曲霉（Aspergillus fumigatus)接種至搖瓶培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，取適量菌體置 于離心管中，13000rpm離心5min，棄上清；加入400 yL抽提緩沖液（IOOmM Tris-HCL，IOOmM EDTA，250mM NaCL，1% SDS);然后加入IOOmg石英砂或玻璃珠，在珠打儀中劇烈振蕩2min左 右；65°(：水浴20111丨11后，加入20(^1^101順，(：，冰浴10111丨11;13000鄺111離心10111丨11，取上清 ；然后加入2倍體積的無水乙醇，-20°C放置30min ;13000rpm離心10min，棄上清，用70%乙 醇洗滌2次；晾干，加入適量水溶解，于-20°C保存。
[0034] (2)基因克隆
[0035] 以提取的基因組總DNA為模板，進行PCR擴增。所用引物序列為：
[0036] AFLip-F ：AAATCTAGAATGTTCTCTGGACGGTTTGG