）在0.003%~0.500%范圍內(nèi) (例如在〇? 003%~0? 400%范圍內(nèi)、例如在0? 003%~0? 300%范圍內(nèi)、例如在0? 003%~ 0. 250%范圍內(nèi)、例如在0. 003%~0. 200%范圍內(nèi)、例如在0. 003%~0. 150%范圍內(nèi)、例如 在0. 003%~0. 130%范圍內(nèi)）時(shí)，這些原料藥或藥物制劑在長(zhǎng)時(shí)間貯藏后雜質(zhì)Iz含量增 加速度得到顯著抑制，這是完全出人意料的。
[0046] 盡管本發(fā)明涉及的各種化學(xué)物質(zhì)，例如式I化合物及其對(duì)映體、雜質(zhì)lx、雜質(zhì)Iy、 雜質(zhì)Iz，它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)是已知的并且可以從市場(chǎng)上以商業(yè)途徑直接獲得，但是本領(lǐng)域技 術(shù)人員公知，這些雜質(zhì)還可以通過(guò)規(guī)定的高效液相色譜法來(lái)定性或表征，例如通過(guò)規(guī)定的 高效液相色譜法操作，通過(guò)測(cè)定雜質(zhì)在該規(guī)定高效液相色譜法中的保留行為（即相對(duì)保留 時(shí)間，RRT)來(lái)確定該雜質(zhì)。特別是，本發(fā)明已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在本發(fā)明所述【HPLC-A】系統(tǒng)中，相對(duì) 于式I化合物而言，雜質(zhì)Ix的相對(duì)保留時(shí)間在0. 86~0. 92范圍內(nèi)（通常RRT大約0. 89)， 從而本發(fā)明亦可將該雜質(zhì)Ix稱為RRT0. 89雜質(zhì)、雜質(zhì)RRT0. 89、或RRT0. 89。
[0047] 而在本發(fā)明所述【HPLC-B】系統(tǒng)中，相對(duì)于式I化合物而言，雜質(zhì)Iy的相對(duì)保留時(shí) 間在1. 10~1. 18范圍內(nèi)（通常RRT大約1. 14)，從而本發(fā)明亦可將該雜質(zhì)Iy稱為RRTL 14 雜質(zhì)、雜質(zhì) RRTl. 14、或 RRTL 14。
[0048] 另外，在本發(fā)明所述【HPLC-B】系統(tǒng)中，相對(duì)于式I化合物而言，雜質(zhì)Iz的相對(duì)保 留時(shí)間在2. 63~2. 73范圍內(nèi)（通常RRT大約2. 68)，從而本發(fā)明亦可將該雜質(zhì)Iz稱為 RRT2. 68 雜質(zhì)、雜質(zhì) RRT2. 68、或 RRT2. 68。
[0049] 因此，在本發(fā)明下文中，提及RRT0. 89雜質(zhì)時(shí)，均指在【HPLC-A】系統(tǒng)中，相對(duì)于式I 化合物的保留時(shí)間而言，相對(duì)保留時(shí)間在〇. 86~0. 92范圍內(nèi)出現(xiàn)雜質(zhì)，該雜質(zhì)為雜質(zhì)Ix ; 同樣地，在本發(fā)明中，提及RRTL 14雜質(zhì)時(shí)，均指在【HPLC-B】系統(tǒng)中，相對(duì)于式I化合物的 保留時(shí)間而言，相對(duì)保留時(shí)間在1. 10~1. 18范圍內(nèi)出現(xiàn)雜質(zhì)，該雜質(zhì)為雜質(zhì)Iy ;同樣地， 在本發(fā)明中，提及RRT2. 68雜質(zhì)時(shí)，均指在【HPLC-B】系統(tǒng)中，相對(duì)于式I化合物的保留時(shí)間 而言，相對(duì)保留時(shí)間在2. 63~2. 73范圍內(nèi)出現(xiàn)雜質(zhì)，該雜質(zhì)為雜質(zhì)Iz。
[0050] 相對(duì)保留時(shí)間的含義在本領(lǐng)域是公知的，例如，雜質(zhì)Ix的相對(duì)保留時(shí)間（縮寫為 RRT)是指在色譜圖中，雜質(zhì)Ix色譜峰的保留時(shí)間除以式I化合物色譜峰的保留時(shí)間所得的 值，即Ix的RRT =雜質(zhì)Ix保留時(shí)間+式I化合物保留時(shí)間，而格隆溴銨本身的相對(duì)保留 時(shí)間為1或者1. 〇〇,這種算法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
[0051] 根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其所制得的包含格隆溴銨的本發(fā)明原料藥中，Ix雜 質(zhì)相對(duì)于格隆溴銨而言含量低于0.5% (例如低于0.4%，例如低于0.3%)。該含量可以 使用高效液相色譜法測(cè)定并計(jì)算，特別是使用【HPLC-A】測(cè)定并計(jì)算。
[0052] 在本發(fā)明中，【HPLC-A】的測(cè)定方法如下：
[0053] ⑴溶液：
[0054] 緩沖溶液：2. 8g/L的磷酸二氫鈉水溶液，用10 %氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至pH值 6. 50±0. 05 ;
[0055] 流動(dòng)相：甲醇：乙腈：緩沖溶液體積比50:10:40的混合液；
[0056] 系統(tǒng)適用性溶液：用流動(dòng)相配制的溶液，其中含赤型異構(gòu)體對(duì)照品和格隆溴銨對(duì) 照品的濃度分別為40 y g/mL ;
[0057] 標(biāo)準(zhǔn)溶液A :精密稱取格隆溴銨對(duì)照品約50mg，置于100mL量瓶中，用流動(dòng)相溶解 并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度約為500 y g/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液A ;
[0058][本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，上述稱取格隆溴銨對(duì)照品"約50mg"，在實(shí)際操作上是需 要用"約"來(lái)修飾的，原因在于精密稱量固體物料時(shí)，例如使用萬(wàn)分之一天平，通常難以直接 稱得50.0 Omg，而是常常會(huì)有所偏離，例如偏離此數(shù)值±2%，例如精密稱量到50. 40mg，則 偏離0. 8%，但這種偏離使得后面的濃度繼續(xù)偏離并延續(xù)到最終的數(shù)值計(jì)算中，而在最終的 數(shù)值計(jì)算中考慮此稱量偏離，因而最終該偏離理論上不會(huì)引起計(jì)算誤差，從而此處"約"的 表述是允許的，這也是各種版本的中國(guó)藥典中在進(jìn)行精密稱量時(shí)通常都是稱取"約"某量的 物料。另外，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及的用于修飾一個(gè)數(shù)值的"約"被定義為允許偏 離其修飾的數(shù)值的±2%，例如上述"精密稱取格隆溴銨對(duì)照品約50mg"亦可表示為"精密 稱取格隆溴銨對(duì)照品50mg±lmg"或者其它類似表述。本發(fā)明其它類似表述語(yǔ)境中亦有類 似含義]
[0059] 標(biāo)準(zhǔn)溶液B:精密量取Iml的以上標(biāo)準(zhǔn)溶液A，置于100mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至 刻度，搖勻，制成濃度約為5yg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液B;
[0060] 供試品溶液：精密稱取含格隆溴銨約為50mg的供試品，置于100mL量瓶中，用流 動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，必要時(shí)過(guò)濾，制成含格隆溴銨濃度約為500 y g/mL的供試品 溶液（其中所述供試品可以是包含格隆溴銨的各種樣品，例如可以是格隆溴銨粗品、原料 藥、精制品以及由它們制成的制劑，根據(jù)具體測(cè)定需要而定，當(dāng)測(cè)定的是制劑時(shí)，折算成該 制劑中包含的格隆溴銨適量以便配制成相應(yīng)濃度一一這些操作技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公 知的）；
[0061] (ii)色譜系統(tǒng)：
[0062] 色譜操作照中國(guó)藥典2010年版二部附錄V D所載高效液相色譜法進(jìn)行，色譜條件 如下：
[0063] 檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)UV222nm;
[0064] 色譜柱：P環(huán)糊精鍵合硅膠柱，填料粒度5 y m，柱內(nèi)徑4. 0mm，柱長(zhǎng)25cm;[注：上 述P環(huán)糊精鍵合硅膠柱的填料是一種P環(huán)糊精鍵合多孔硅膠，此類色譜柱可容易地從市 場(chǎng)上購(gòu)得，例如可以是購(gòu)自Merck KGaA公司的Chiradex品牌產(chǎn)品，可以是購(gòu)自YMC公司的 YMC CHIRAL CD BRP品牌產(chǎn)品，等等。下文具體試驗(yàn)中使用該YMC公司產(chǎn)品]
[0065] 柱溫：30 cC;
[0066] 流速：lmL/min;
[0067] 進(jìn)樣量：IOyL;
[0068]系統(tǒng)適用性：系統(tǒng)適用性溶液色譜圖中赤型異構(gòu)體與格隆溴銨之間的分離度不低 于1. 2,標(biāo)準(zhǔn)溶液B色譜圖中托尾因子不超過(guò)2. 0,標(biāo)準(zhǔn)溶液B色譜圖中相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不超 過(guò)6. 0%，通過(guò)系統(tǒng)適用性溶液色譜圖和標(biāo)準(zhǔn)溶液B確定赤型異構(gòu)體與格隆溴銨的保留時(shí) 間以及二者的相對(duì)保留時(shí)間；
[0069] (iii)測(cè)定：
[0070] 分別將供試品溶液、標(biāo)準(zhǔn)溶液A、標(biāo)準(zhǔn)溶液B注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，讀取所得 三個(gè)色譜圖中格隆溴銨的峰面積，以及供試品溶液色譜圖中赤型異構(gòu)體的峰面積（當(dāng)該色 譜峰存在時(shí)），以及它們的保留時(shí)間；
[0071] 根據(jù)供試品溶液色譜圖和標(biāo)準(zhǔn)溶液A色譜圖按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算供試品溶液 中格隆溴銨的濃度，記為Ci (單位為y g/mL ;眾所周知的外標(biāo)法計(jì)算Ci的計(jì)算式為：Ci = (供試品溶液色譜圖中主峰面積+標(biāo)準(zhǔn)溶液A色譜圖中主峰面積）X標(biāo)準(zhǔn)溶液A中格隆溴 銨濃度；單位為yg/mL，此格隆溴銨濃度排除雜質(zhì)、輔料、水分等干擾，對(duì)于原料藥而言該 濃度可能與配液濃度接近，但是對(duì)于雜質(zhì)和/或水分等較多的粗品以及添加了輔料的藥物 組合物例如藥物制劑而言，該濃度可以準(zhǔn)確地反映溶液中格隆溴銨的濃度）；
[0072] 按下式計(jì)算供試品溶液中赤型異構(gòu)體（當(dāng)其存在時(shí)）的濃度，記為Cx(單位為 y g/mL)：
[0073]
[0074] 按下式計(jì)算樣品中相對(duì)于格隆溴銨而言赤型異構(gòu)體含量（為百分含量，％):
[0075] 赤型異構(gòu)體含量（％ ) = (Cx + Ci) X 100%。
[0076] 以上【HPLC-A】中，以格隆溴銨的相對(duì)保留時(shí)間為1或者為1. 00計(jì)，赤型異構(gòu)體 的相對(duì)保留時(shí)間在0.86~0.92范圍內(nèi)，下文具體測(cè)定結(jié)果中均在該范圍內(nèi)，特別是約為 0. 89 〇
[0077] 根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其所制得的包含格隆溴銨的本發(fā)明原料藥中，Iy雜 質(zhì)相對(duì)于格隆溴銨而言含量低于〇. 50% (例如低于0. 30%、低于0. 25%、低于0. 20%、低 于0. 15 %、低于0. 13% )，例如Iy雜質(zhì)含量（相對(duì)于格隆溴銨計(jì)）在0.003 %~0.500% 范圍內(nèi)（例如在〇. 003 %~0. 400 %范圍內(nèi)、例如在0. 003 %~0. 300 %范圍內(nèi)、例如在 0. 003%~0. 250%范圍內(nèi)、例如在0. 003%~0. 200%范圍內(nèi)、例如在0. 003%~0. 150%范 圍內(nèi)、例如在〇. 003%~0. 130%范圍內(nèi)）。該含量可以使用高效液相色譜法測(cè)定并計(jì)算，特 別是使用【HPLC-B】測(cè)定并計(jì)算。
[0078] 根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其所制得的包含格隆溴銨的本發(fā)明原料藥中，Iz雜 質(zhì)相對(duì)于格隆溴銨而言含量低于〇. 50% (例如低于0. 30%、低于0. 25%、低于0. 20%、低 于0. 15 %、低于0. 13% )，例如Iz雜質(zhì)含量（相對(duì)于格隆溴銨計(jì)）在0.002 %~0.500% 范圍內(nèi)（例如在〇. 002 %~0. 400 %范圍內(nèi)、例如在0. 002 %~0. 300 %范圍內(nèi)、例如在 0. 002%~0. 250%范圍內(nèi)、例如在0. 002%~0. 200%范圍內(nèi)、例如在0. 002%~0. 150%范 圍內(nèi)、例如在〇. 002%~0. 130%范圍內(nèi)）。該含量可以使用高效液相色譜法測(cè)定并計(jì)算，特 別是使用【HPLC-B】測(cè)定并計(jì)算。
[0079] 在本發(fā)明中，【HPLC-B】的測(cè)定方法如下：
[0080] ⑴溶液：
[0081] 緩沖溶液：將1.0 g的無(wú)水硫酸鈉和200mg的1-己燒磺酸鈉一水合物溶于650mL 水中，向此溶液中加入3. OmL的IN硫酸，混合，即得；
[0082] 稀釋溶液：將1.0 g的無(wú)水硫酸鈉、6. 8g磷酸二氫鉀和200mg的1-己烷磺酸鈉一 水合物溶于650mL水中，向此溶液中加入3. OmL的IN硫酸、150mL的甲醇和200mL的乙腈， 混合，用磷酸調(diào)節(jié)PH值為2. 8,即得；
[0083] 溶液A :乙腈：甲醇：緩沖溶液體積比20:15:65的混合液；
[0084] 溶液B :乙腈：甲醇：緩沖溶液體積比50:15:35的混合液；
[0085] 標(biāo)準(zhǔn)溶液A :精密稱取格隆溴銨對(duì)照品約100mg，置于100mL量瓶中，用稀釋溶液溶 解并稀釋至刻度，必要時(shí)經(jīng)超聲處理以促使溶解，搖勻，制成濃度約為1000yg/mL的溶液， 為標(biāo)準(zhǔn)溶液A ;
[0086] 標(biāo)準(zhǔn)溶液B :分別精密稱取雜質(zhì)Iy對(duì)照品和雜質(zhì)Iz對(duì)照品各約15mg，置于100mL 量瓶中，另精密量取15ml的以上標(biāo)準(zhǔn)溶液A置于同一量瓶中，加稀釋溶液稀釋至刻度， 必要時(shí)經(jīng)超聲處理以促使溶解，搖勻，得到含格隆溴銨、雜質(zhì)Iy、雜質(zhì)Iz三者濃度均約為 150 y g/mL的溶液，為標(biāo)準(zhǔn)溶液B ;
[0087] 標(biāo)準(zhǔn)溶液C :精密量取Iml的以上標(biāo)準(zhǔn)溶液B置于100mL量瓶中，加稀釋溶液稀釋 至刻度，搖勻，制成含格隆溴銨、雜質(zhì)Iy、雜質(zhì)Iz三者濃度均約為I. 5 y g/mL的溶液，為標(biāo)準(zhǔn) 溶液C ;
[0088] 標(biāo)準(zhǔn)溶液D:精密稱取雜質(zhì)Iy對(duì)照品約15mg，置于100mL量瓶中，加稀釋溶液稀釋 至刻度，必要時(shí)經(jīng)超聲處理以促使溶解，搖勻，得到含雜質(zhì)Iy濃度約為150 y g/mL的溶液， 為標(biāo)準(zhǔn)溶液Dy;另精密稱取雜質(zhì)Iz對(duì)照品約15mg，置于100mL量瓶中，加稀釋溶液稀釋至 刻度，必要時(shí)經(jīng)超聲處理以促使溶解，搖勻，得到含雜質(zhì)Iz濃度約為150 yg/mL的溶液，為 標(biāo)準(zhǔn)溶液Dz ;
[0089] 供試品溶液：精密稱取含格隆溴銨約為IOOmg的供試品，置于100mL量瓶中，用稀 釋溶液溶解并稀釋至刻度，必要時(shí)經(jīng)超聲處理以促使溶解，搖勻，必要時(shí)過(guò)濾，制成含格隆 溴銨濃度約為1000yg/mL的供試品溶液（其中所述供試品可以是包含格隆溴銨的各種樣 品，例如可以是格隆溴銨粗品、原料藥、精制品以及由它們制成的制劑，根據(jù)具體測(cè)定需要 而定，當(dāng)測(cè)定的是制劑時(shí)，折算成該制劑中包含的格隆溴銨適量以便配制成相應(yīng)濃度-- 這些操作技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的）；
[0090] (ii)色譜系統(tǒng)：
[0091] 色譜操作照中國(guó)藥典2010年版二部附錄V D所載高效液相色譜法進(jìn)行，色譜條件 如下：
[0092] 檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)UV222nm ;
[0093] 色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠柱，填料粒度5 ym，柱內(nèi)徑4. 6mm，柱長(zhǎng)15cm ; [注：這是一種本領(lǐng)域極為常用的色譜柱]
[0094]梯度洗脫程序：
[0095]

[0096] 柱溫：4(TC ;
[0097] 流速：lmL/min;
[0098] 進(jìn)樣量：50yL;
[0099] 系統(tǒng)適用性：標(biāo)準(zhǔn)溶液C色譜圖中雜質(zhì)Iy與格隆溴銨之間的分離度不低于2. 0， 格隆溴銨峰的托尾因子不超過(guò)2. 0,各色譜峰的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不超過(guò)6. 0% ;通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)溶液 Dy和標(biāo)準(zhǔn)溶液Dz的色譜圖主峰保留時(shí)間確定在此色譜條件下雜質(zhì)Iy和雜質(zhì)Iz的保留時(shí) 間，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)溶液B色譜圖確定雜質(zhì)Iy、雜質(zhì)Iz、格隆溴銨的保留時(shí)間以及三者的相對(duì)保 留時(shí)間；
[0100] (iii)測(cè)定：
[0101] 分別將供試品溶液、標(biāo)準(zhǔn)溶液A、標(biāo)準(zhǔn)溶液C注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，讀取所得 三個(gè)色譜圖中格隆溴銨的峰面積，供試品溶液色譜圖中雜質(zhì)Iy和雜質(zhì)Iz以及其它任選存 在的雜質(zhì)的峰面積（當(dāng)這些色譜峰存在時(shí)），標(biāo)準(zhǔn)溶液C色譜圖中雜質(zhì)Iy和雜質(zhì)Iz的峰面 積，以及它們的保留時(shí)間；
[0102] 根據(jù)供試品溶液色譜圖和標(biāo)準(zhǔn)溶液A色譜圖按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算供試品溶液 中格隆溴銨的濃度，記為Ci (單位為y g/mL ;眾所周知的外標(biāo)法計(jì)算Ci的計(jì)算式為：Ci = (供試品溶液色譜圖中主峰面積+標(biāo)準(zhǔn)溶液A色譜圖中主峰面積）X標(biāo)準(zhǔn)溶液A中格隆溴 銨濃度；此格隆溴銨濃度排除雜質(zhì)、輔料、水分等干擾，對(duì)于原料藥而言該濃度可能與配液 濃度接近，但是對(duì)于雜質(zhì)和/或水分等較多的粗品以及添加了輔料的藥物組合物例如藥物 制劑而言，該濃度可以準(zhǔn)確地反映溶液中格隆溴銨的濃度）；
[0103] 按下式計(jì)算供試品溶液中雜質(zhì)Iy或雜質(zhì)Iz的濃度，分別記為Cy或Cz (單位為 y g/mL，當(dāng)其存在時(shí)）：
[0106] 按下