專利名稱：防止蛋白質葡糖酰化的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物化學工程領域。更具體地，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生多肽的發(fā)酵工藝。
背景技術：
大腸桿菌(“E.coli”)是常用的蛋白質表達宿主，用于研究、診斷、治療和 工業(yè)目的。現(xiàn)代表達系統(tǒng)能夠獲得高水平的多種蛋白質(Baneyx，CurrentOpinion in Biotechnology 10:411-421(1999))。然而，表達的蛋白質的質量常常是與數(shù) 量一樣重要或比數(shù)量更加重要。在大腸桿菌中表達的蛋白質可形成不可溶的聚集 體，或者它們可具有錯誤摻入的氨基酸(Bogosian，et al.，Journal ofBiological Chemistry 264:531-539(1989))或保持 N-末端甲硫氨酸(Chaudhuri，etal, Journal of Molecular Biology 285 1179-1194 (1999) ；Vassileva-Atanassova, etal., Journal of Biotechnology 69:63-67(1999) ；Yamashita, et al. , ProteinExpression & Purification 16:47-52(1999))。此外，會發(fā)生所不希望的翻譯后修飾，諸如氧化 (Berti,et al. ,Protein Expression & Purification 11 :111_118(1997) ；Konz,et al., Biotechnology Progress 14:393-409(1998))或 α-N-6-磷酸葡糖?；?Geoghegan, et al. , Anal.Biochem. 267 169-184 (1999) ；Kim et al. , ActaCrystalIographica Section D-Biological CrystalIography 57:759-762(2001) ；Yan,et al. Biochemical & Biophysical Research Communications 262:793-800(1999) "Yan et al.I ； "Yan, et al. , Biochemical &Biophysical Research Communications259 :271_282 (1999) "Yan et al.II”)等。這些修飾會不利于實現(xiàn)所表達的蛋白質的活性、穩(wěn)定性、結構或免疫原性，極 大地縮減了大腸桿菌作為多肽表達的宿主的效用。已經(jīng)描述了融合于六組氨酸親和標記(“hexa His-Tag”)的數(shù)種重組蛋白的 Alpha( α )-N-6-磷酸葡糖?；?phosphogluconoylation) (Geoghegan 等；Kim 等；Yan 等 I ；Yan等II)。在這些研究中，發(fā)現(xiàn)葡萄糖酸衍生物與重組蛋白的末端相連。所有這些蛋白 質在大腸桿菌的B菌株中應用基于pET的載體(Novagen)進行表達。其中的報道中采用了 LB培養(yǎng)基。該加合物作為與258道爾頓(“Da”)的多肽或者178Da的多肽相連接的附加 質量而被檢測到，其中前一種多肽代表加入6-磷酸葡糖酸內酯(6-PGL)，后一種多肽代表 存在葡糖酸內酯而無磷酸。公知磷酸葡糖?；ㄟ^與磷酸戊糖支路的中間體即內源6-PGL 反應，發(fā)生在α氨基N-末端。認為+178Da加合物是作用于+258Da加合物以除去磷酸 (phosphate)的酶活性的結果。加合物的形成顯示對于鄰近His-標記的N末端氨基酸序列 是特異性的。GXXHHHH的多肽序列，其中XX為SS、SA、AS或AA，最易于發(fā)生α -Ν-6-磷酸葡 糖?；?，然而SHHHHHH則較不容易，而ΡΗΗΗΗΗΗ和PFHHHHHH則完全不被修飾(Geoghegan，et al.)。在蛋白其它位置的其它氨基上的修飾未在應用高水平添加的葡糖酸內酯的體內 或體外實驗中檢測到(Geoghegan，et al.)。已經(jīng)顯示N-末端磷酸葡糖?；种频鞍踪|的結晶(Kim，et al.)，但關于其對蛋 白功能、穩(wěn)定性和免疫原性的影響的了解相對較少?？梢灶A期，6-PGL作為強的親電子試劑， 可參與體內的糖化反應(Rakitzis and Papandreou, Chemico-BiologicalInteractions 113:205-216(1998))。蛋白質的糖化已被廣泛地研究并已知在老化過程及與糖尿病并 發(fā)癥有關的疾病狀態(tài)中起主要的作用(B aynes and Monnier，The Maillard Reaction in Aging, Diabetes, and Nutrition. Alan R. Liss, New York(1989))。已經(jīng)顯示夕卜源添 加的delta-葡糖酸內酯引起血紅蛋白的糖化，其可為糖尿病的血管并發(fā)癥中的一個因素 (Lindsay, et al.，Clinica Chimica Acta 263 :239_247 (1997))。此外，丙氨酸氨基轉移 酶在Lys313印silon-氨基的糖化顯著地降低其催化活性(Beranek, et al.，Molecular &Cellular Biochemistry 218:35—39(2001))。已經(jīng)顯示6-磷酸葡糖酸內酯酶(“pgl”)為戊糖-磷酸途徑，具體在6-PGL到6_磷 酸葡糖酸的水解中的重要酶(Miclet, et al.，J. Biol. Chem. 276 =34840-34846 (2001)) 編碼此酶的基因已經(jīng)在人(Collard，et al.，F(xiàn)EBS Letters 459 :223_226 (1999))、銅綠 Iix Ifi lif (Pseudomonas aeruginosa) (Hager, et al.，Journal ofBacteriology 182 3934-3941(2000))和布氏錐蟲(Trypanosoma brucei)以及鐮狀瘧原蟲中(Plasmodium falciparum) (Miclet, et al.)中得到鑒定。雖然已經(jīng)長期地在大腸桿菌中觀察到pgl活 性(Kupor and Fraenkel，Journal of BacteriologylOO 1296-1301 (1969) "Kupor I"and Kupor and Fraenke1, Journal of BiologicalChemistry 247 1904-1910(1972) "Kupor II”)，但是沒有鑒定出負責編碼具有此活性的酶的基因序列(Cordwell，S. J. Arch. Microbiol. 172 :269_279 (1999))。已經(jīng)表明，除了能夠使代謝流通過磷酸戊糖支路外，細胞 內的Pgl活性防止6-PGL的積累以及隨之發(fā)生的與胞內親核試劑的破壞性反應(Miclet， et al.)。已報道的對蛋白質在N末端的磷酸葡糖酰化的觀察支持了在所述的途徑中產(chǎn)生 &6-PGL能夠修飾蛋白質的假說，但沒有報道調控pgl活性能夠影響修飾的蛋白水平的證 據(jù)。此外，大腸桿菌BL21(DE3)是常用的蛋白質表達宿主，其用于研究、診斷、治療和 工業(yè)目的(Studier，F(xiàn). W.，and Moffatt，B. A.，J. Mol. Biol. 1986 May 5 ；189(1) 113-130)。 此菌株在商業(yè)上是有吸引力的，因為它通過偶聯(lián)T7RNA聚合酶染色體拷貝的表達與目的重 組蛋白上基于質粒的T7RNA聚合酶啟動子的使用，實現(xiàn)非常高的重組蛋白表達水平。因此， 由于T7RNA聚合酶是極具選擇性和活性的RNA聚合酶，重組蛋白的轉錄積累到非常高的水 平，甚至常常達到宿主細胞轉錄物被減少的程度。不利地，菌株BL21 (DE3)釋放非常少但可檢出的感染性lambda噬菌體顆粒，所 述lambda噬菌體顆粒的量級為10-20個噬斑形成單位/ml (PFU)，Stewart Shuman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989;89:3489-3493。明顯地，通過用攜有被插入 lambda int 基因之 T7RNA聚合酶基因的缺陷型lambda噬菌體DE3進行轉導，將T7 RNA聚合酶基因導入BL21宿 主細胞染色體(Studier, F. W.，and Moffatt, B. Α.，J. Mol. Biol. 1986 ；189(1) 113-130)。 得到的缺陷型原噬菌體由于int基因中斷而不能正常復制。DE3原噬菌體的染色體切除， 是包裝及釋放感染性的噬菌體顆粒之前原噬菌體復制所需的，并且依賴于由int基因產(chǎn)物指導的同源切除重組。如本文所述，非常低水平的釋出的噬菌體顆粒是由于異常的、依賴于 int的、隨機的原噬菌體切除事件。盡管感染性噬菌體顆粒的低水平釋放在一些研究實驗室 中是可以接受的，但在生物藥劑的制造工廠設備中，任何感染性噬菌體的釋放則是完全不 能接受的，既因為為了患者安全考慮，還因為感染性試劑的釋放能使其它基于大腸桿菌的 生產(chǎn)工藝處于危險狀態(tài)中。在微生物諸如大腸桿菌中表達或過量表達多肽、同時使得發(fā)酵過程中的磷酸葡糖 酰化發(fā)生率降低的方法是非常需要的。此外，構造完全無噬菌體的BL21(DE3)宿主細胞，對 于在大腸桿菌形式中制備治療性重組蛋白質是非常需要的。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了通過使微生物在豐富培養(yǎng)基生長，從而防止由微生物表達的多肽發(fā) 生葡糖?；姆椒ā１景l(fā)明也提供了防止由微生物所表達多肽的葡糖?；姆椒ǎ浒▽⒕幋a顯示 Pgl活性的多肽的DNA導入(例如，轉化、感染或轉染)到微生物中。此多肽可為磷酸葡糖 酸內酯酶。在本發(fā)明的另一方面，該磷酸葡糖酸內酯酶與假單胞菌包括但不限于銅綠假單 胞菌所產(chǎn)生的磷酸葡糖酸內酯酶具有至少90%序列同一性的氨基酸序列。本發(fā)明也提供了能夠防止蛋白質的葡糖酰化的微生物。在一個實施方案中，微生 物可含有編碼顯示pgl活性的多肽的DNA。本發(fā)明也提供了分離的多核苷酸，其與SEQ ID NO :7中的多核苷酸具有至少90% 的同源性。本發(fā)明也提供了微生物，其沒有可檢出的感染性lambda噬菌體表達。更具體地，本發(fā)明涉及1.防止微生物中所表達的多肽的葡糖?；姆椒?，包括使所述的微生物在豐富培 養(yǎng)基中生長。2.項1的方法，其中所述的微生物在基本培養(yǎng)基中生長時，不顯示明顯的6-磷酸 葡糖酸內酯酶活性。3.項1的方法，其中所述的微生物是大腸桿菌。4.項3的方法，其中所述的大腸桿菌是B菌株。5.項1的方法，其中所述的豐富培養(yǎng)基包括復合氮源。6.項5的方法，其中所述的豐富培養(yǎng)基能夠保持細胞在復合氮源濃度與細胞密度 的比率為1 1的條件下生長。7.項5的方法，其中所述的復合氮源包含胰蛋白胨。8.項5的方法，其中所述的復合氮源包含蛋白胨。9.項5的方法，其中所述的復合氮源包含酵母提取物。10.項1的方法，其中所述的培養(yǎng)基是Superbroth。11.項10的方法，其中所述的Superbroth培養(yǎng)基是雙倍濃縮的。12.項1的方法，其中所述的微生物由編碼異源多肽的重組DNA分子轉染。13.防止在大腸桿菌中所表達的多肽的葡糖?；姆椒?，包括將大腸桿菌的K菌 株品種發(fā)酵以表達所述的多肽。
14.項13的方法，其中所述的K菌株顯示的磷酸葡糖酸內酯酶活性比在同樣條件 下生長的B菌株高100倍。15.項14的方法，其中所述的K菌株為K-12。16.防止在微生物中所表達的多肽的葡糖?；姆椒ǎ▽NA導入該微生物， 其中所述的DNA編碼顯示6-磷酸葡糖酸內酯酶活性的多肽。17.項16的方法，其中所述的微生物是大腸桿菌。18.項16的方法，其中所述的DNA包括編碼6_磷酸葡糖酸內酯酶的DNA。19.項18的方法，其中編碼6-磷酸葡糖酸內酯酶的DNA與來自假單胞菌的、編碼 6_磷酸葡糖酸內酯酶的DNA具有至少70%的序列同一性。20.項19的方法，其中所述的假單胞菌是銅綠假單胞菌。21.項18的方法，其中編碼6-磷酸葡糖酸內酯酶的DNA與SEQID NO 7具有至少 90%的序列同一性。22.項18的方法，其中編碼6-磷酸葡糖酸內酯酶的DNA與SEQID NO 7具有至少 95%的序列同一性。23.項18的方法，其中所述的6-磷酸葡糖酸內酯酶具有與SEQ ID NO 8具有至 少90%序列同一性的氨基酸序列。24.項18的方法，其中所述的6-磷酸葡糖酸內酯酶具有與SEQ ID NO 8具有至 少95%序列同一性的氨基酸序列。25.項18的方法，其中編碼6-磷酸葡糖酸內酯酶的DNA包括SEQ IDNO 7中列出 的序列。26.項16的方法，其中所述的DNA是重組DNA。27.項16的方法，其中所述的DNA被轉化入所述微生物的基因組DNA。28.微生物，其能夠防止多肽的葡糖酰化。29.項28的微生物，其中所述的微生物包括DNA，所述DNA編碼顯示6_磷酸葡糖 酸內酯酶活性的多肽。30.項28的微生物，其中所述的微生物包括DNA，所述DNA編碼6_磷酸葡糖酸內酯酶。31.項28的微生物，其中編碼6-磷酸葡糖酸內酯酶的DNA與來自假單胞菌的、編 碼6-磷酸葡糖酸內酯酶的DNA具有至少90 %的序列同一性，并且其中所述的微生物不是假 單胞菌。32.項28的微生物，其中編碼6_磷酸葡糖酸內酯酶的DNA與來自假單胞菌的、編 碼6-磷酸葡糖酸內酯酶的DNA具有至少95 %的序列同一性，并且其中所述的微生物不是假 單胞菌。33.項31的微生物，其中編碼6-磷酸葡糖酸內酯酶的DNA來自銅綠假單胞菌。34.項28的微生物，其中所述的微生物是大腸桿菌的菌株。35.項31的微生物，其中所述的微生物是大腸桿菌的菌株，并且其中編碼6-磷酸 葡糖酸內酯酶的DNA被摻入該微生物的基因組。36.分離的多核苷酸，包括與SEQ ID NO 7中列出的多核苷酸具有至少90%的序 列同一性的多核苷酸。
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37.項36的分離的多核苷酸，包括與編碼多肽的多核苷酸具有至少90%同一性的 多核苷酸，所述的多肽包含與SEQ ID NO :8具有至少90%的序列同一性的氨基酸序列。38.項36的分離的多核苷酸，其中所述的DNA編碼顯示6-磷酸葡糖酸內酯酶活性 的蛋白。39.項36的分離的多核苷酸，其中所述的DNA序列在SEQ ID NO 7中列出。40.項36的分離的多核苷酸，其中所述的DNA序列與來自銅綠假單胞菌的、編碼 6-磷酸葡糖酸內酯酶的DNA具有至少90%的序列同一性。41.項35的分離的多核苷酸，進一步包括編碼人白細胞介素-18的多核苷酸。42.分離的多核苷酸，包括與SEQ ID NO 7中列出的多核苷酸具有至少95%的序 列同一性的多核苷酸。43.改善多肽晶體形成的方法，包括根據(jù)項1的方法表達所述的多肽。44.改善多肽晶體形成的方法，包括根據(jù)項16的方法表達所述的多肽。45.項1的方法，進一步包括提高生長效率，其中所述的多肽與葡糖酰化的多肽相 比，在發(fā)酵階段顯示出增加的效價收率。46.項16的方法，進一步包括提高生長效率，其中所述的多肽與葡糖酰化的多肽 相比，在發(fā)酵階段顯示出增加的效價收率。47.生產(chǎn)人白細胞介素的方法，包括使所述的人白細胞介素在微生物中與具有 6-磷酸葡糖酸內酯酶(“pgl”)活性的酶共表達。48.項47的方法，其中所述的人白細胞介素是IL-18。49.項47的方法，其中所述的微生物是大腸桿菌。50.項49的方法，其中所述的pgl是由被轉化入所述大腸桿菌基因組中的多核苷 酸編碼的。51.生產(chǎn)人白細胞介素的方法，包括在生長于豐富培養(yǎng)基中的微生物中表達所述 的人白細胞介素。52.項51的方法，其中所述的人白細胞介素是IL-18。53.項51的方法，其中所述的微生物是大腸桿菌。54.項51的方法，其中所述的豐富培養(yǎng)基包括植物蛋白胨。55.項51的方法，其中所述的豐富培養(yǎng)基包括細菌用酵母提取物。56.微生物，其完全不表達感染性lambda噬菌體。57.項56的微生物，其中l(wèi)ambda噬菌體的衣殼結構蛋白gpE被缺失或被破壞。58.項56的微生物，其中所述的微生物是大腸桿菌。59.項56的微生物，其含有T7RNA聚合酶基因。


圖1顯示載體pEC0-l-pgl-2-13的限制性酶圖譜。圖2顯示載體pEC0-l-pgl-2-13的多核苷酸序列(SEQ ID NO 9)。圖3顯示載體pET28ProIL18Casp5的限制性酶圖譜。圖 4 顯示載體 pET28ProIL18Casp5 的多核苷酸序列(SEQ ID NO 13)。圖5顯示載體pET28proIL18casp5+pgl的限制性酶圖譜。
圖 6 顯示載體 pET28proIL18casp5+pgl 的多核苷酸序列(SEQ ID NO 14)。圖7顯示多核苷酸序列SEQ ID NO :7。圖8顯示多肽序列SEQ ID NO :8。術語表“宿主細胞”是細胞，包括但不限于細菌細胞或微生物的細胞，其中已經(jīng)導入(例 如，轉化、感染或轉染)或者能夠導入(例如，轉化、感染或轉染)分離的多核苷酸序列?！稗D化的”如本領域已知，是通過外部DNA或RNA的導入對生物體的基因組或附加 體(印isome)的定向修飾，或者指外部DNA或RNA的任何其它穩(wěn)定導入。“轉染的”如本領域已知，是將外部DNA或RNA包括但不限于重組的DNA或RNA導 入微生物中?！巴恍浴比绫绢I域已知，是通過序列比較確定的兩個或兩個以上多肽序列或兩 個或兩個以上多核苷酸序列之間的具體關系。在本領域中，“同一性”也指通過所述序列 串之間的配對確定的多肽或多核苷酸序列之間的序列具體相關性程度。“同一性”能夠通 過已知的方法容易地計算，包括但不限于那些在(Computational Molecular Biology, Lesk, Α. Μ. , ed. , Oxford UniversityPress, New York,1988 ；Biocomputing Informatics and Genome Projects, Smith, D. W. , ed. , Academic Press, New York, 1993 ；Computer Analysis of SequenceData, Part I, Griffin, A.M. , and Griffin, H. G. , eds. , Humana Press, New Jersey, 1994 ；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press,1987 ；and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds. ,MStockton Press,New York,1991 ；and Carillo,H. ,and Lipman,D. , SIAM J. Applied Math. ,48:1073(1988))中描述的方法。確定同源性的方法被設計為在受試序列之間給 出最大匹配度。而且，確定同源性的方法匯集在可以公開得到的計算機程序中。確定兩 個序列之間同一性的計算機程序方法包括，但不限于GCG程序包(Devereux，J.，et al.， Nucleic Acids Research 12(1) :387 (1984))、BLASTP、BLASTN和 FASTA(Altschul，S. F. et al.，J. Molec. Biol.215 :403-410(1990)。公眾可以從 NCBI 及其它來源(BLAST Manual, Altschul, S.，etal.，NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894 ；Altschul, S.，et al.，J. Mol. Biol. 215 :403-410 (1990))獲得 BLAST X 程序。著名的 Smith Waterman 算法也可被用于 確定同一性。多肽序列比較的參數(shù)包括以下參數(shù)算法Needlemanand Wunsch, J. Mol Biol. 48 443-453 (1970)比較矩陣BL0SSUM62，來自 Hentikoff and Hentikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89 10915-10919(1992)缺口罰分12缺口長度罰分4利用這些參數(shù)的有用程序是可以公開獲得的，如來自Genetics Computer Group, Madison WI的“缺口(gap)”程序。前面提及的參數(shù)(連同末端缺口無罰分一起)是肽比 較的缺省參數(shù)。多核苷酸比較的參數(shù)包括以下參數(shù)算法Needlemanand Wunsch, J. Mol Biol. 48 443-453 (1970)
比較矩陣配對=+10，錯配=0缺口罰分50缺口長度罰分3可用的如來自Genetics Computer Group, Madison WI 的“缺口，，程序。這些是 核酸比較的缺省參數(shù)。多核苷酸和多肽的“同一性”的優(yōu)選含意，根據(jù)具體情況，在下面的(1)和(2)中提供。(1)多核苷酸實施方案進一步包括分離的多核苷酸，其包含與參比序列SEQ ID NO :7具有至少70、80、85、90、95、97或100%同源性的多核苷酸序列，其中所述的多核苷酸 序列可與參比序列SEQ ID NO :7相同或者與參比序列相比可包含達某一整數(shù)個的核苷酸改 變，其中所述的改變選自由至少一個核苷酸缺失、取代，包括轉換或顛換，或插入所組成的 組。而且其中所述的改變可發(fā)生在參比核酸序列的5’或3’末端位置或所述末端位置之間 的任何地方，單個地分散在參比序列的核苷酸中，或者在參比序列內的一或多個相鄰基團 中，而且其中所述核苷酸改變的數(shù)目通過以下方法確定用定義同一性百分比的整數(shù)除以 100所得的結果乘以SEQ ID NO :7中核苷酸的總數(shù)，然后從所述的SEQ ID NO :7中核苷酸 的總數(shù)中減去上述乘積，或xn_(xn · y)，其中~為核苷酸改變的數(shù)目，xn為SEQ ID NO 7中核苷酸的總數(shù)，y對于95%為 0. 95，對于97%為0. 97或對于100%為1.00，而·為乘法算符的記號，而在從Xn中減去Xn 與y的任何非整數(shù)乘積之前，將所述乘積向下舍入到最接近的整數(shù)。編碼多肽的多核苷酸 序列的改變會在該編碼序列中產(chǎn)生無義、錯義或移碼突變，并從而改變由發(fā)生這些改變的 多核苷酸編碼的多肽。(2)多肽實施方案進一步包括分離的多肽，其包含與多肽參比序列具有至少70、 80、85、90、95、97或100%同一性的多肽，其中所述的多肽序列可與參比序列相同或者與參 比序列相比可包含達某一整數(shù)個的氨基酸改變，其中所述的改變選自由至少一個氨基酸缺 失、取代(包含保守的和非保守的取代)，或插入所組成的組，而且其中所述的改變可發(fā)生 在參比多肽序列的氨基末端或羧基末端位置或所述的末端位置之間的任何地方，單獨地分 散在參比序列的氨基酸中，或者在參比序列內的一或多個相鄰基團中，而且其中所述的氨 基酸改變的數(shù)目可通過以下方法確定用定義同源性百分數(shù)的整數(shù)除以100的所得結果乘 以氨基酸的總數(shù)，然后從所述的氨基酸的總數(shù)中減去上述方法所得乘積，或na ^xa-(xa-y),其中na為氨基酸改變的數(shù)目，Xa為序列中氨基酸的總數(shù)，y對于95%為0. 95，對于 97%為0. 97或對于100%為1. 00，而·為乘法算符的記號，而在從Xa中減去Xa和y的任何 非整數(shù)的乘積之前，將所述乘積向下舍入到最接近的整數(shù)。“分離的”意思是從其自然狀態(tài)“通過人工”改變的，S卩，如果它存在于自然中，那么 它已被改變或從其原始環(huán)境中去除，或兩者都有。例如，天然存在于活生物體中的多核苷酸 或多肽不是“分離的”，而從其天然狀態(tài)的共存物質中分離的同樣的多核苷酸或多肽是“分 離的”，包括但不限于當所述的多核苷酸或多肽被導回進入細胞的情況。“多核苷酸”通常指任何聚核糖核苷酸或聚脫氧核糖核苷酸，其可為未經(jīng)修飾的
9RNA或DNA或者修飾的RNA或DNA?！岸嗪塑账帷狈窍拗菩缘匕?，單-和雙-鏈DNA，作為 單_和雙_鏈區(qū)域或單_、雙-和三_鏈區(qū)域的混合物的DNA，單-和雙-鏈RNA，及作為 單-和雙-鏈區(qū)域混合物的RNA，雜合分子，其含有作為單鏈或更通常地雙鏈或三鏈區(qū)域、 或作為單_和雙_鏈區(qū)域的混合物的DNA與RNA。此外，如本文應用的“多核苷酸”指含有 RNA或DNA或RNA和DNA的三-鏈區(qū)域。此區(qū)域中的鏈可來自同一分子或來自不同分子。 此區(qū)域可包括一個或多個分子的全部，但是更通常地只涉及這些分子中的區(qū)域。三-螺旋 區(qū)域的分子之一常常為寡核苷酸。如在這里應用的，術語“多核苷酸”也包括如上所述含有 一個或多個經(jīng)修飾的堿基的DNA或RNA。因此，具有為了穩(wěn)定性或為了其它原因而被修飾的 骨架的DNA和RNA為本文的“多核苷酸”。而且，含有不常見堿基如次黃嘌呤核苷，或經(jīng)修飾 的堿基如三苯甲基化的堿基的DNA或RNA，僅舉兩例，為如在這里應用的多核苷酸。認識到 已經(jīng)對DNA和RNA進行多種修飾，所述修飾可用于本領域已知的多種有用目的。術語“多核 苷酸”，如其在這里使用的，包含多核苷酸的所述化學性、酶性或代謝性修飾形式，以及病毒 和細胞的特征性DNA和RNA的化學形式，包括，例如，簡單和復雜細胞。“多核苷酸”也包括 常常作為寡核苷酸提及的短多核苷酸?！岸嚯?，，指包含兩個或兩個以上通過肽鍵或修飾的肽鍵互相連接的氨基酸的任何 多肽或蛋白?！岸嚯摹奔戎竿ǔ７Q為肽、寡肽和寡聚物的短鏈，又指通常稱為蛋白質的較長 的鏈。多肽可包含除20基因編碼的氨基酸之外的氨基酸?！岸嚯摹卑切┩ㄟ^天然方 法諸如加工和其它翻譯后修飾來修飾的多肽，也包括經(jīng)化學修飾技術來修飾的多肽。這些 修飾在基礎文本和更詳細的專論中，以及在大量的研究文獻中充分地描述，并且它們?yōu)楸?領域的技術人員所熟知。應理解同樣類型的修飾以同樣的或變化的程度存在于給定的多 肽中的數(shù)個位點。而且，給定的多肽可含有許多類型的修飾。修飾可發(fā)生在多肽中的任 何地方，包括多肽骨架、氨基酸側鏈以及氨基或羧基末端。修飾包括，例如，乙?；?、?；?、 ADP核糖基化、酰胺化、黃素的共價連接、血紅素部分的共價連接、核苷酸或核苷酸衍生物 的共價連接、脂質或脂質衍生物的共價連接、磷脂酰肌醇的共價連接、交聯(lián)、環(huán)化、形成二硫 鍵、脫甲基化、形成共價交聯(lián)、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸鹽、甲?；?、gamma-羧化、形成 GPI錨、羥基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化(myristoylation)、氧化、蛋白酶解加工、磷酸化、 異戊烯化(prenylation)、外消旋化、糖基化、脂質連接、硫酸化、谷氨酸殘基的gamma-羧 化、羥基化和ADP核糖基化、硒化、硫酸化、轉運RNA介導的向蛋白質添加氨基酸，如精氨 ?；?arginylation),以及泛素化(ubiquitination)。參見，例如，PROTEINS-STRUCTURE AND M0LECULARPR0PERTIES,2nd Ed. , Τ. Ε. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York(1993)and Wold, F. , Posttranslational Protein Modifications !Perspectives andProspects, pgs. 1-12 in P0STTRANSLATI0NAL C0VALENT MODIFICAT10N0F PROTEINS, B. C. Johnson,Ed. ,Academic Press,New York(1983) ；Seifter etal. ,Meth. Enzymo1. 182 626-646 (1990)and Rattan et al. , Protein Synthesis :Posttranslational Modifications and Aging,Ann. N. Y Acad. Sci. 663 :48_62(1992)。多肽可為分枝的或帶有 或不帶有分支的環(huán)。環(huán)狀的、支化的和支化環(huán)狀的多肽可由翻譯后的天然過程產(chǎn)生，并且也 可通過完全合成的方法制備?！爸亟M表達系統(tǒng)”指本發(fā)明的表達系統(tǒng)或其部分、或多核苷酸，其被導入或轉化進 入宿主細胞和宿主細胞裂解物，用于產(chǎn)生本發(fā)明的多核苷酸和多肽。
本文術語“變體”，是分別與參比多核苷酸或多肽不同，但保持基本性質的多核苷 酸或多肽。通常的多核苷酸變體的核苷酸序列不同于另一種，參比多核苷酸。在變體的核 苷酸序列中的變化，可改變或不改變由參比多核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列。核苷酸變 化可導致由參比序列編碼的多肽中的氨基酸的取代、添加、缺失、融合蛋白和截短，如在下 面討論的。通常的多肽的變體在氨基酸序列上不同于另一個，參比多肽。一般地，差異是有 限的，以致參比多肽和變體的序列大體上十分相似并在很多區(qū)域相同。變體和參比多肽通 過一個或一個以上任意組合的取代、添加、缺失而在氨基酸序列上有所差異。取代的或插入 的氨基酸殘基是或不是由遺傳密碼所編碼的。本發(fā)明也包括本發(fā)明的每種多肽的變體，即 與參比物的差異在于保守的氨基酸取代的多肽，其中殘基被具有相似特性的另一殘基所取 代。通常這樣的取代在Ala、Val、Leu和Ile之間；在Ser和Thr之間；在酸性殘基Asp和Glu 之間；在Asn和Gln之間；也在堿性殘基Lys和Arg之間；或芳香族殘基Phe和Tyr。具體 優(yōu)選的是其中數(shù)個，如5-10、1-5、1-3、1-2或1個氨基酸以任意組合的方式被取代、缺失或 添加的變體。多核苷酸或多肽的變體可為天然存在的，諸如等位基因的變體，或者可為未知 其為天然存在的變體。多核苷酸和多肽的非_天然存在的變體可通過誘變(mutagenesis) 技術、通過直接合成和通過技術人員已知的其它重組方法來制備?！拔⑸铩敝涪旁松?，包括但不限于，以下屬的成員鏈球菌屬 (Str印tococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、博德特菌屬(Bordetella)、棒狀桿菌 屬(Corynebacterium)、分支桿菌屬(Mycobacterium)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)、嗜血 桿菌屬(Haemophilus)、放線菌屬(Actinomycetes)、鏈霉菌(Streptomycetes)、諾卡氏 菌屬(Nocardia)、腸桿菌屬(Enterobacter)、耳口爾森氏菌屬(Yersinia)、Fancisella、 Pasturella、摩拉克氏菌屬(Moraxella)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、毒絲菌屬 (Erysipelothrix)、布蘭漢氏球菌屬(Branhamella)、放線桿菌屬(Actinobacillus)、鏈 桿菌屬(Streptobacillus)、李斯特菌屬(Listeria)、莢膜菌屬(Calymmatobacterium) > 布氏桿菌屬(Brucella)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、梭菌屬(Clostridium)、密螺旋體 屬(Tr印onema)、埃希氏桿菌屬(Escherichia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、克氏桿菌 屬(Kleibsiella)、弧菌屬(Vibrio)、變形桿菌屬(Proteus)、文氏菌屬(Erwinia)、包 柔氏螺旋體屬(Borrelia)、鉤端螺旋體屬(L印tospira)、螺旋菌屬(Spirillum)、彎曲 桿菌屬(Campylobacter)、志賀氏菌屬(Shigella)、軍團桿菌屬(Legionella)、假單 胞菌屬(Pseudomonas)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、立克次氏體(Rickettsia)、衣原體 屬(Chlamydia)、包柔氏螺旋體屬(Borrelia)和支原體(Mycoplasma)，并且進一步包 括，但不限于，以下種或組的成員A組鏈球菌(Group A Streptococcus)、B組鏈球菌、 C組鏈球菌、D組鏈球菌、G組鏈球菌、肺炎鏈球菌(Str印tococcus pneumoniae)、化膿 性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)、無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)、獎 鏈球菌(Streptococcus faecal is)、屎鏈球菌(Streptococcus faecium)、堅忍鏈球 菌(Streptococcus durans)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrheae)、腦膜炎奈瑟氏菌 (Neisseria meningitidis)、金黃色葡萄球(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌 (Staphylococcus epidermidis)、白喉棒桿菌(Corynebacterium diptheriae)、陰道力口 德菌(Gardnerella vaginalis)、結核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、牛分支 桿菌(Mycobacterium bovis)、饋蕩分支桿菌(Mycobacterium ulcerans)、麻風分支桿菌(Mycobacterium 1印rae)、衣氏放線菌(Actinomyctes israelii)、單核細胞增多性李斯特 胃(Listeria monocytogenes)、15 日 専H牛寺 (Bordetellapertusis) H ^ff 胃(Bordatella parapertusis) >iWJ^ifil(Bordetella bronchiseptica) > 大腸桿菌(Escherichia coli)、痢疾志賀氏菌(Shigella dysenteriae)、流感嗜血桿 胃(Haemophilus influenzae) ,i^R^ikiffM (Haemophilus aegyptius) > gijM1 ^Bf ifil 桿菌(Haemophilus parainfluenzae)、杜克雷嗜血桿菌(Haemophilus ducreyi)、博德 特菌(Bordetella)、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)、弗羅因德(氏)枸櫞酸桿菌 (Citrobacter freundii)、奇異變形桿菌(Proteus mirabilis)、普通變形桿菌(Proteus vulgaris)、鼠疫耶爾森(氏)菌(Yersinia pestis)、肺炎克氏桿菌(Kleibsiella pneumoniae)、Serratia marcessens、Serratia liquefaciens、霍亂弧菌(Vibrio cholera)、痢疾志賀氏菌(Shigelladysenterii)、弗氏志賀氏菌(Shigella flexneri)、銅 綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、Franscisella tularensis、Brucella abortis、 炭疽芽孢桿菌(Bacillusanthracis)、蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)、產(chǎn)氣莢膜梭菌 (Clostridiumperfringens)、破傷風梭菌(Clostridium tetani)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、蒼白密螺旋體(TMponema pallidum)、立克次(氏)立克次(氏)體 (Rickettsiarickettsii)禾口 Chlamydia trachomitis, (ii)古細菌(archaeon),包括 但不限于ArchaebacterdP (iii)單細胞的或絲狀的真核生物，包括但不限于釀酒酵母 (Saccharomyces cereviseae)、乳酸克魯維酵母(Kluveromyces lactis)或白色念珠菌 (Candida albicans)“細菌(I) ”指(i)原核生物，包括但不限于以下屬的成員鏈球菌屬、葡萄球菌屬、 博德特菌屬、棒狀桿菌屬、分支桿菌屬、奈瑟氏菌屬、嗜血桿菌屬、放線菌、鏈霉菌屬、諾卡氏 菌屬、腸桿菌屬、耶爾森氏菌屬、Fancisella、Pasturella、摩拉克(氏)菌屬、不動桿菌屬、 毒絲菌屬、布蘭漢球菌屬、放線桿菌屬、鏈桿菌屬、李斯特菌屬、莢膜菌屬、布氏桿菌屬、芽孢 桿菌屬、梭菌屬、密螺旋體屬、埃希氏桿菌屬、沙門氏菌屬、克氏桿菌屬、弧菌屬、變形桿菌 屬、文氏菌屬、包柔氏螺旋體屬、鉤端螺旋體屬、螺旋菌屬、彎曲桿菌屬、志賀氏菌屬、軍團桿 菌屬、假單胞菌屬、氣單胞菌屬、立克次氏體屬、衣原體屬、包柔氏螺旋體屬和支原體，并進 一步包括，但不限于以下種或組的成員A組鏈球菌、B組鏈球菌、C組鏈球菌、D組鏈球菌、G 組鏈球菌、肺炎鏈球菌、化膿性鏈球菌、無乳鏈球菌、糞鏈球菌、鏈球菌素、堅忍鏈球菌、淋病 奈瑟菌、腦膜炎奈瑟菌、金黃色葡萄球、表皮葡萄球菌、白喉棒桿菌、陰道加德菌、結核分支 桿菌、牛分支桿菌、潰瘍分支桿菌、麻風分支桿菌、衣氏放線菌、單核細胞增多性李斯特菌、 百日咳博德特菌、副百日咳博德特菌、支氣管敗血性博德特菌、大腸桿菌、痢疾志賀氏菌、流 感嗜血桿菌、埃及嗜血桿菌、副流感嗜血桿菌、杜克雷嗜血桿菌、博德特菌、傷寒沙門氏菌、 弗羅因德(氏)枸櫞酸桿菌、奇異變形桿菌、普通變形桿菌、鼠疫耶爾森(氏)菌、肺炎克氏 If |if> Serratia marcessens、Serratia liquefaciens、·舌氏胃、·氏；ifelSI 氏菌、銅綠假單胞菌、Franscisella tularensis、Brucellaabortis、炭疽芽孢桿菌、賭樣芽 孢桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、破傷風梭菌、肉毒梭菌、蒼白密螺旋體、立克次(氏)立克次(氏) 體禾口 Chlamydia trachomitis, (ii)古細菌，包括但不限于 Archaebacter。如在這里應用的，“異源多肽”指不能通過經(jīng)轉化的目標宿主細胞或微生物天然地 合成、并通過重組DNA導入該宿主細胞或微生物的多肽。例如，大腸桿菌可作為白細胞介素表達的宿主微生物，而白介素表達在非-轉化的大腸桿菌中不會發(fā)生。異源多肽可包括已 經(jīng)過修飾以促進分離的多肽。如在這里應用的“親和標記”指任何與分子相連的部分，其可給予所述的分子對于 另一種物質或分子的選擇性親和力。例如，親和標記可用于通過給分子提供對于純化柱填 充材料的選擇性親和力而促進分子的純化。親和標記的非_限制性的實例為his-標記。如在這里應用的，“His-標記”指組氨酸的重復，并可包含通過改造技術而被編碼 進多肽的其它氨基酸。通常地，一個His-標記包含至少六個(“hexa”)組氨酸重復，且其 位于多肽的N-末端附近。His-標記能 夠用于促進異源多肽在Ni-柱上的純化。如在這里應用的，“基本培養(yǎng)基”指含有化學限定成分的細胞生長培養(yǎng)基，包括但 不限于，緩沖液，如磷酸鹽緩沖液；鹽，如硫酸鎂、氯化鈣、氯化鈉、或硫酸錳；礦物質，如鐵、 鋅、銅、鈷或鉬；碳源，如葡萄糖或甘油；和氮源，如硫酸銨或硝酸銨。一個實例為M9培養(yǎng)基 (Kim,YS, JH Seo and HYCha, Enzyme and Microbial Technology 33(2003) :460_465.)。如在這里應用的，“豐富培養(yǎng)基(rich culture medium) ”指含有非限定成分的細 胞生長培養(yǎng)基，包括但不限于，添加的成分，如緩沖液(例如磷酸鹽緩沖液)、鹽(例如硫酸 鎂、氯化鈣、氯化鈉或硫酸錳)、碳源，例如其可為葡萄糖或甘油。氮源可包含蛋白水解物，如 酵母提取物、肉類水解物或大豆水解物。氮源可以能夠支持細胞生長的濃度提供，其中復合 氮源(克每升)與最大細胞密度(0D單位)的比率為1 1或更高。豐富培養(yǎng)基的實例包括， 但不限于，Superbroth (Atlas RM, Handbook of Microbiological Mesdia ；Parks LC Ed.； CRCPress :Boca Raton FL, pp. 281, 523, 529,859) > Teriffic Broth (Alpha Biosciences, Baltimore, MD USA)、Turbo Broth (Athena Enzyme Systems, Baltimore, MDUSA)或 Hyper Broth(Athena Enzyme Systems, Baltimore, MD USA)。如在這里應用的，“葡糖酰化”指葡糖酸衍生物與蛋白的連接。葡糖?；砂?，但 不限于，6-磷酸葡糖酸內酯(6-PGL)加合物形成、乙?；?、甲?；?、去甲?；⑵咸撬醿弱セ?(gluconolactonation)或葡糖酸衍生化(derivatization)。如在這里應用的，“效價收率(titer yield) ”指產(chǎn)物(例如，異源表達的多肽)在 溶液(例如，培養(yǎng)液或細胞-裂解混合物或緩沖液)中的濃度，而其通常表示為mg/L或g/ L。效價收率的增加可指在兩個限定的條件組下產(chǎn)生的產(chǎn)物濃度的絕對的或相對的增加。如在這里應用的，“pgl活性”指任何6-磷酸葡糖酸內酯酶(“pgl”)的活性。此 活性可包括將6-PGL水解為6-磷酸葡糖酸。顯著的pgl活性可以定義為至少0. 2IU/min/ g的水解活性。如在這里應用的，術語“嚴謹條件”和“嚴謹雜交條件”指只有當序列之間的同 一性為至少70%且優(yōu)選至少80%，而具體優(yōu)選至少95%時，雜交才會發(fā)生。嚴謹雜交 條件的實例為，在含有50%甲酰胺、5XSSC(150mM NaCl，15mM枸櫞酸三鈉(trisodium citrate) )、50mM 磷酸鹽(pH7. 6)、5 XDenhardt ‘ s 溶液、10 %硫酸葡聚糖和 20 μ g/ml 變 性的、經(jīng)剪切的鮭精DNA的溶液中、于42°C過夜溫育，然后是在0. 1 X SSC中、大約65 V洗 滌濾紙。雜交和洗滌條件是已被熟知的，并在Sambrook，et al.，Molecular Cloning =A LaboratoryManual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N. Y, (1989)，特別是其中第 11 章中舉例說明，其公開在此全部并入以供參考。發(fā)明詳述
由于在基本培養(yǎng)基中的生長、高細胞密度和高水平的異源多肽的表達引起的細胞應激(Cellular stresses)，可有助于于異源多肽的葡糖?；?。減輕一種或一種以上這些 應激物，可由此影響在微生物中表達的蛋白的葡糖?；乃?，從而影響到所需多肽的純 度和效價收率。盡管造成此活性的基因還沒有在大腸桿菌中鑒定出來，大腸桿菌的一些 菌株可比其它菌株具有更高水平的Pgl活性(Cordwel 1, S. J. 1999. Arch. Microbiol. 172 269-279)。此外，多肽的葡糖酰化可影響這些多肽的結晶和結構測定。本發(fā)明提供了防止在微生物中表達的多肽的葡糖?；姆椒ǎㄊ顾龅奈⑸?物在豐富培養(yǎng)基中生長。在本發(fā)明的又一方面，當微生物在基本培養(yǎng)基中生長時，不顯示顯 著的6-磷酸葡糖酸內酯酶活性。該微生物可為大腸桿菌的菌株。在本發(fā)明的又一方面，大 腸桿菌為B菌株。在本發(fā)明的又一方面，豐富培養(yǎng)基包含復合氮源。豐富培養(yǎng)基能夠在復合 氮源濃度與細胞密度的比率為1 1的條件下保持細胞生長。復合氮源可包含胰蛋白胨、 蛋白胨或酵母提取物。在本發(fā)明的又一方面，培養(yǎng)基為Superbroth。Superbroth培養(yǎng)基可 為雙倍濃縮的。在本發(fā)明的又一方面，微生物以編碼異源多肽的重組DNA分子轉染。在本發(fā)明的另一實施方案中，提供防止在大腸桿菌中表達的多肽的葡糖酰化的方 法，包括將大腸桿菌的K菌株變體發(fā)酵用于表達多肽。在本發(fā)明的又一方面，與在基本相同 的條件下生長的B菌株相比，K菌株顯示的磷酸葡糖?；富钚灾辽俑叽蠹s100倍。在本 發(fā)明的又一方面，K菌株為K-12。在本發(fā)明的另一實施方案中，提供防止在微生物中所表達多肽的葡糖酰化的方 法，包括將DNA導入微生物，其中所述的DNA編碼顯示6-磷酸葡糖酸內酯酶活性的多肽。在 本發(fā)明的又一方面，微生物是大腸桿菌。DNA包括編碼6-磷酸葡糖酸內酯酶的DNA。在本 發(fā)明的又一方面，編碼6-磷酸葡糖酸內酯酶的DNA與來自假單胞菌的、編碼6-磷酸葡糖酸 內酯酶的DNA具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%或100%的序列同一性，所述的假 單胞菌可為銅綠假單胞菌。在本發(fā)明的又一方面，編碼6-磷酸葡糖酸內酯酶的DNA與SEQ ID NO :7具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%或100%的序列同一性。在本發(fā)明的又 一方面，6-磷酸葡糖酸內酯酶與SEQ ID而8具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97% 或100%的序列同一性的氨基酸序列。編碼6-磷酸葡糖酸內酯酶的DNA包括SEQ ID NO: 7的序列。DNA可為重組的DNA，和/或其可被轉化入微生物的基因組DNA。在本發(fā)明的另一實施方案中，提供能夠防止多肽的葡糖?；奈⑸铩Ｎ⑸锇?括編碼顯示6-磷酸葡糖酸內酯酶活性的多肽的DNA。微生物包括編碼6-磷酸葡糖酸內酯 酶的DNA。在本發(fā)明的又一方面，編碼6-磷酸葡糖酸內酯酶的DNA與來自假單胞菌的、編碼 6_磷酸葡糖酸內酯酶的DNA具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%或100%的序列同 一性，并且其中所述的微生物不是假單胞菌。在本發(fā)明的又一方面，編碼6-磷酸葡糖酸內 酯酶的DNA來自銅綠假單胞菌。在本發(fā)明的又一方面，微生物是大腸桿菌的菌株。在本發(fā) 明的又一方面，微生物是大腸桿菌的菌株，并且其中編碼6-磷酸葡糖酸內酯酶的DNA被摻 入微生物的基因組。在本發(fā)明的另一實施方案中，提供分離的多核苷酸，其包括與SEQ IDNO 7的多核 苷酸具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%或100%的序列同一性的多核苷酸。在本 發(fā)明的又一方面，分離的多核苷酸包括與編碼下述多肽的多核苷酸具有至少70%、80%、 85%、90%、95%、97%或100%的序列同一性的多核苷酸，所述的多肽包含與SEQ ID NO 8具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%或100%序列同一性的氨基酸序列。在本發(fā)明 的又一方面，DNA編碼顯示6-磷酸葡糖酸內酯酶活性的蛋白。在本發(fā)明的又一方面，DNA 序列在SEQ ID NO:7中列出。在本發(fā)明的又一方面，DNA序列與來自銅綠假單胞菌的編碼 6_磷酸葡糖酸內酯酶的DNA同源。在本發(fā)明的又一方面，分離的多核苷酸進一步包括編碼 人白細胞介素-18的多核苷酸，或其變體。
在本發(fā)明的另一實施方案中，提供改善多肽晶體形成的方法，包括通過本發(fā)明的 方法表達所述的多肽以降低多肽的葡糖?；Ｔ诒景l(fā)明的另一實施方案中，提供提高生長效率及在微生物中表達多肽的方法。 在一個方面，與葡糖?；亩嚯南啾龋嚯脑诎l(fā)酵階段顯示出增加的效價收率。在本發(fā)明的另一實施方案中，提供產(chǎn)生人白細胞介素的方法，包括將所述的人白 細胞介素在微生物中與具有6-磷酸葡糖酸內酯酶(“pgl”)活性的酶共表達。在一個方面， 人白細胞介素是IL-18或其變體。在一個方面，微生物是大腸桿菌。在一個方面，pgl是由 被轉化或轉染入大腸桿菌中，包括但不限于被轉化入基因組或附加體的多核苷酸編碼的。在本發(fā)明的另一實施方案中，提供產(chǎn)生人白細胞介素的方法，包括在生長于豐富 培養(yǎng)基中的微生物中表達所述的人白細胞介素。在一個方面，人白細胞介素是IL-18蛋 白或其變體。在一個方面，微生物是大腸桿菌。在一個方面，豐富培養(yǎng)基包括植物蛋白 胨(phytone peptone) 0在一個方面，豐富培養(yǎng)基包括細菌用酵母提取物(bacto yeast extract)0在本發(fā)明的另一實施方案中，提供沒有可檢測的感染性lambda噬菌體表達的微 生物。在一個方面，lambda噬菌體的衣殼結構蛋白gpE在微生物內被缺失或被破壞。蛋白 的缺失或破壞能通過數(shù)種非_限制性的方法實現(xiàn)。編碼蛋白的基因可被或者部分地或者全 部地從微生物中去除。編碼蛋白的基因可通過如點突變或隨機突變這樣的非-限制性技術 在基因上修飾?？捎没瘜W方法或酶法切斷或修飾蛋白以破壞其結構或功能?？蓪⒄{控基因 表達的啟動子破壞或缺失以消除或降低基因的表達?？梢哉{控溶液條件或溫度以影響蛋白 結構或功能。在一個方面，微生物是大腸桿菌。在又一個方面，微生物包括T7RNA聚合酶基 因。下面的實施例說明了本發(fā)明的各個方面。這些實施例不限制由附加權利要求所限 定的本發(fā)明的范圍。
實施例實施例1創(chuàng)建大腸桿菌BL21 (DE3)菌株的改進菌株，其通過敲除主要的lambda噬菌體的衣 殼結構蛋白gpE，沒有可檢測的感染性lambda噬菌體表達。此菌株用于在這里顯示的實施 例中。對gpE編碼區(qū)的413個堿基對內部片段進行PCR擴增，應用以下引物5' AGCTGGCCATTGCTCAGGTCGAAG 3‘ (SEQIDN0:1)5' GTACTGTCCGGAATACACGACGATG 3‘ (SEQ ID NO 2)并以BL21(DE3)染色體DNA作為模板。得到的片段為AGCTGGCCAT TGCTCAGGTC GAAGAGATGC AGGCAGTTTC TGCCGTGCTT
AAGGGCAAAT ACACCATGAC CGGTGAAGCC TTCGATCCGG TTGAGGTGGATATGGGCCGC AGTGAGGAGA ATAACATCAC GCAGTCCGGC GGCACGGAGTGGAGCAAGCG TGACAAGTCC ACGTATGACC CGACCGACGA TATCGAAGCCTACGCGCTGA ACGCCAGCGG TGTGGTGAAT ATCATCGTGT TCGATCCGAAAGGCTGGGCG CTGTTCCGTT CCTTCAAAGC CGTCAAGGAG AAGCTGGATACCCGTCGTGG CTCTAATTCC GAGCTGGAGA CAGCGGTGAA AGACCTGGGCAAAGCGGTGT CCTATAAGGG GATGTATGGC GATGTGGCCA TCGTCGTGTATTCCGGACAG TAC(SEQ ID NO 3)應用標準的方法對PCR擴增產(chǎn)物進行TA克隆，并驗證其序列。然后，將氯霉素抗性 基因的功能拷貝導入EcoRV位點，該位點位于克隆的gPE序列中間并以粗體顯示。然后插入 了氯霉素的gpE片段構建體被用作線性同源重組敲除載體，所述載體用于位于大腸桿菌宿 主菌株BL21(DE3)中的lambda (DE3)gpE基因的基因敲除。除了應用本文所述的載體之外， 如 Kirill A. Datsenko andBarry Wanner, Proc. Natl. Acad. Sci USA 2000 ；97 6640-6645 所述將此敲除載體導入宿主細胞，通過在存在6 μ g/ml的氯霉素的條件下生長的能力，初 步鑒別出推定的gpE敲除體，并隨后通過PCR分析進行確認。保存一個這種BL21 (DE3)的 gpE敲除體，并給出GSK定名ECC-023。在非常敏感的噬菌斑測定中檢測ECC-023中感染性噬菌體顆粒的存在。如表1中 所示，在不誘導親代BL21(DE3)表達噬菌體時，其表達勉強可檢出量的噬菌體，大約20pfu， 但是通過對遺傳損傷(紫外照射)的SOS應答來誘導時，所述表達大約高三個數(shù)量級。然 而，即使被處理以誘導SOS應答時，gpE敲除衍生物ECC-023也不產(chǎn)生感染性噬菌體的任何 證據(jù)。數(shù)據(jù)顯示，BL21(DE3)衍生物ECC-023不產(chǎn)生任何可檢測的感染性噬菌體顆粒，并因 此它對于生物制藥來說是適合的宿主細胞菌株。表1 從大腸桿菌產(chǎn)生感染性噬菌體顆粒。
權利要求
分離的多核苷酸，包括與SEQ ID NO7中列出的多核苷酸具有至少90％的序列同一性的多核苷酸。
2.權利要求1的分離的多核苷酸，包括與編碼多肽的多核苷酸具有至少90%同一性的 多核苷酸，所述的多肽包含與SEQ ID NO :8具有至少90%的序列同一性的氨基酸序列。
3.權利要求1的分離的多核苷酸，其中所述的DNA編碼顯示6-磷酸葡糖酸內酯酶活性 的蛋白。
4.權利要求1的分離的多核苷酸，其中所述的DNA序列在SEQID NO 7中列出。
5.權利要求1的分離的多核苷酸，其中所述的DNA序列與來自銅綠假單胞菌的、編碼 6-磷酸葡糖酸內酯酶的DNA具有至少90%的序列同一性。
6.權利要求1的分離的多核苷酸，進一步包括編碼人白細胞介素-18的多核苷酸。
7.分離的多核苷酸，包括與SEQID NO :7中列出的多核苷酸具有至少95%的序列同一 性的多核苷酸。
8.生產(chǎn)人白細胞介素的方法，包括使所述的人白細胞介素在微生物中與具有6-磷酸 葡糖酸內酯酶(“pgl”)活性的酶共表達。
9.權利要求8的方法，其中所述的人白細胞介素是IL-18。
10.權利要求8的方法，其中所述的微生物是大腸桿菌。
11.權利要求10的方法，其中所述的pgl是由被轉化入所述大腸桿菌基因組中的多核 苷酸編碼的。
12.生產(chǎn)人白細胞介素的方法，包括在生長于豐富培養(yǎng)基中的微生物中表達所述的人 白細胞介素。
13.權利要求12的方法，其中所述的人白細胞介素是IL-18。
14.權利要求12的方法，其中所述的微生物是大腸桿菌。
15.權利要求12的方法，其中所述的豐富培養(yǎng)基包括植物蛋白胨。
16.權利要求12的方法，其中所述的豐富培養(yǎng)基包括細菌用酵母提取物。
17.微生物，其完全不表達感染性lambda噬菌體。
18.權利要求17的微生物，其中l(wèi)ambda噬菌體的衣殼結構蛋白gpE被缺失或被破壞。
19.權利要求17的微生物，其中所述的微生物是大腸桿菌。
20.權利要求17的微生物，其含有T7RNA聚合酶基因。
全文摘要
本發(fā)明涉及防止在微生物中所產(chǎn)生多肽的葡糖?；姆椒?。
文檔編號H01L27/148GK101942470SQ20091020734
公開日2011年1月12日 申請日期2004年3月4日 優(yōu)先權日2003年3月4日
發(fā)明者亞歷山大·H·泰勒, 托馬斯·D·斯韋策, 普拉馬西什·S·帕特爾, 艾倫·R·加德納 申請人:史密絲克萊恩比徹姆公司