細(xì)胞顯微成像方法、圖像處理方法以及成像分析系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及細(xì)胞顯微成像方法、圖像處理方法以及成像分析系統(tǒng)，所述方法利用軟X射線來進(jìn)行，包括以下步驟：（1）標(biāo)本制作；（2）目標(biāo)細(xì)胞的初步查找和選擇，和（3）軟X射線成像。所述圖像處理方法能夠降低噪聲、消除偽影和提高對比度，所述成像分析系統(tǒng)包括：光學(xué)顯微鏡系統(tǒng)、同步輻射裝置、圖像處理系統(tǒng)和顯示裝置。所述方法和系統(tǒng)可有效探測細(xì)胞的存在及其所在的區(qū)域環(huán)境，研究細(xì)胞和亞細(xì)胞的空間尺度、結(jié)構(gòu)及其功能，從而為包括病理學(xué)、醫(yī)學(xué)、農(nóng)林、食品在內(nèi)的多個領(lǐng)域提供有效的中間信息。
【專利說明】細(xì)胞顯微成像方法、圖像處理方法以及成像分析系統(tǒng)
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及一種利用軟X射線進(jìn)行細(xì)胞顯微成像的方法、圖像處理方法以及成像分析系統(tǒng)。
[0003]
【背景技術(shù)】 [0004]Roentgen在1895年發(fā)現(xiàn)的X射線具有強(qiáng)烈穿透物質(zhì)的特性，適用于人體組織器官成像。其波長較短，為0.1-1.0nm。但X射線與物質(zhì)作用很復(fù)雜，加之難以制造出類似可見光應(yīng)用中的光學(xué)元件，所以很難實現(xiàn)X線顯微鏡。隨著電子對撞同步輻射光源的誕生，發(fā)射出專用軟X射線，其波長在Ι-lOnm，通過光學(xué)衍射聚光和光學(xué)元件把軟X射線會聚投射到樣品上，再成像到像平面上。
[0005]軟X射線顯微成像術(shù)的分辨率已達(dá)10nm，其原理是:
將樣品緊貼著放在軟X射線靈敏的探測器(光刻膠)上，經(jīng)過軟X射線曝光及“顯影”，顯示出光刻膠輻射的圖形，它與樣品原物形態(tài)有著相對應(yīng)的關(guān)系。然后用光學(xué)或電子顯微鏡觀察此圖形，就可讀出樣品的軟X射線顯微圖像。
[0006]軟X射線顯微術(shù)是一種主要利用“水窗口 ”波段(2.3-4.4nm)的軟X射線作為光源的顯微成像技術(shù)。相對于光學(xué)顯微鏡，它具有更高的成像分辨率；相對于電子顯微鏡，其樣品制備簡單，僅需超薄切片標(biāo)本，無須對樣品進(jìn)行冰凍、封蠟、脫水、染色等傳統(tǒng)的病理檢查工作程序。概括地說，軟X射線顯微成像技術(shù)可以不用傳統(tǒng)病理方法，就可實現(xiàn)觀察細(xì)胞組織的亞微結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)特征。
[0007]近幾年來，軟X射線顯微術(shù)的應(yīng)用研究取得了飛速的發(fā)展，尤其是在生命科學(xué)研究中。除有類似病理學(xué)診斷價值外，軟X射線顯微成像技術(shù)具有以下特點:①不用染色可清晰分辨，其分辨率(70.0nm)比光鏡高，并接近電鏡；②組織標(biāo)本可以在活體狀態(tài)下進(jìn)行病理學(xué)檢查分析；③可以對自然狀態(tài)下活體組織細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒別診斷及應(yīng)用于臨床診斷。軟X射線顯微鏡可以觀察自然狀態(tài)下的生物樣品，目前可以觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)和內(nèi)部動態(tài)變化，還可以在細(xì)胞水平的樣品上研究蛋白質(zhì)、DNA等生物大分子的分布。
[0008]軟X射線顯微技術(shù)已為生物醫(yī)學(xué)的研究開拓了一條新途徑，受到各國科學(xué)家的關(guān)注。該技術(shù)最適合于自然狀態(tài)下生物樣品的高分辨率成像，在世界范圍內(nèi)得到迅速發(fā)展。當(dāng)今，許多國家重視積極開發(fā)研制各種形式的軟X射線顯微鏡并應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)樣品的研究，取得了顯著進(jìn)展。
[0009]美、俄、德、日、英、法等國掌握了此項技術(shù)，并對軟X射線生物醫(yī)學(xué)樣品進(jìn)行了研究。Kirz 和 Rarback 在 Brookhaven (1981)、GSttingen (1983)召開的會議上，發(fā)表了軟 X射線綜述的相關(guān)報道。1985年Feder等人使用軟X射線顯微成像方法已成功得到分辨率約IOnm的活體狀態(tài)下的血小板軟X射線顯微成像圖；1990年Shinohara等拍攝了 HeLa細(xì)胞核仁清晰的軟X射線顯微圖像，并對染色質(zhì)、酶原顆粒結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察分析。盡管如此，國外目前對軟X射顯微技術(shù)應(yīng)用于醫(yī)學(xué)分析還鮮見報道。
[0010]國內(nèi)對軟X射線顯微成像技術(shù)研究雖然起步稍晚，但起點較高，對軟X射線顯微成像圖技術(shù)的研究和應(yīng)用也給予了高度重視。1991年中國科技大學(xué)(合肥)國家同步輻射實驗站建成，1992年開始對國內(nèi)外開放。我國科研人員和學(xué)者可以在合肥同步輻射光源上開展軟X射線顯微術(shù)研究，在軟X射線顯微術(shù)的理論和實踐上做出了突出貢獻(xiàn)，也取得很多的成果，中國科技大學(xué)謝行恕教授在軟X射線顯微術(shù)的理論和實踐上做出了突出的貢獻(xiàn)；也有學(xué)者將軟X射線成像應(yīng)用于大腸桿菌、男性精子、昆蟲翅膀、植物種子、食品等方面的研究。
[0011]在近些年，關(guān)于對組織細(xì)胞的評估和分析，在方法和技術(shù)上的進(jìn)展已經(jīng)使數(shù)字圖像分析成為輔助病理學(xué)家更準(zhǔn)確解釋圖像的最有效工具之一。盡管這樣的圖像分析技術(shù)有助于給病理學(xué)家、細(xì)胞學(xué)家等提供準(zhǔn)確的、重復(fù)性和客觀的細(xì)胞分析，但是細(xì)胞組織的解釋仍傾向于依賴對樣品的主觀分析。這樣的組織學(xué)解釋技術(shù)還嚴(yán)重受制于觀察者自身以及觀察者之間一致性的變化，這進(jìn)一步導(dǎo)致產(chǎn)生較低準(zhǔn)確性、較低重復(fù)性和較少客觀性的結(jié)果。因此如何給病理學(xué)家、細(xì)胞學(xué)家等提供更準(zhǔn)確的、重復(fù)性更高和更客觀的細(xì)胞組織中間信息一直是所追求的。
[0012]在國內(nèi)，目前用軟X射線顯微成像技術(shù)多半應(yīng)用于微生物學(xué)、植物和動物的生物樣品標(biāo)本，利用軟X射線進(jìn)行細(xì)胞顯微成像研究方面尚處于興起和起步階段，且研究的重點主要集中在軟X射線成像操作方面，過于依賴X射線成像本身，在樣品處理方面以及圖像處理方面研究較少，往往忽略了樣品處理和圖像處理對圖像信息產(chǎn)生的影響，同時還缺少對最佳適用于軟X射線成像的衍射光柵的研究。此外，在超薄切片制作過程中，由于受傳統(tǒng)X射線成像技術(shù)(例如硬X射線成像技術(shù))的影響，不太重視切片制作過程中可能產(chǎn)生的褶皺，然而這種褶皺對于利用軟X射線進(jìn)行細(xì)胞顯微成像卻能夠產(chǎn)生很大的影響；在成像過程中，也常常沿用傳統(tǒng)X射線成像技術(shù)，對最佳適用于軟X射線的光柵和光刻膠也缺乏研究，致使衍射光柵的性能受到限制。
[0013]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，本發(fā)明人經(jīng)過深入研究，提供了以下解決方案，以提供有效中間信息，例如提供給病理學(xué)家或農(nóng)林專家等，由其進(jìn)行細(xì)胞特征提取、分類、分析、比較和得出可靠結(jié)論。
[0015]在一方面，提供了一種利用軟X射線進(jìn)行細(xì)胞顯微成像的方法，其特征在于該方法利用軟X射線進(jìn)行細(xì)胞亞微結(jié)構(gòu)的成像，其包括以下步驟:(1)標(biāo)本制作；(2)目標(biāo)細(xì)胞的初步查找和選擇；和(3)軟X射線成像。
[0016]所述標(biāo)本制作步驟可包括:(1)將組織細(xì)胞標(biāo)本切成超薄切片標(biāo)本，超薄切片標(biāo)本厚度為1.5-5nm ；(2)將已切好的超薄切片標(biāo)本放置在38°C _40°C水槽的水面上，使標(biāo)本漂浮于水面迅速均勻展開呈平面狀,所述槽液中含有3ppm-10ppm重量的吐溫20或吐溫40，優(yōu)選吐溫20;和(3)使用電鏡銅網(wǎng)撈取已在水槽漂浮展平的超薄切片標(biāo)本，再將該電鏡銅網(wǎng)放在吸水紙上控盡水分并晾干，所述電鏡銅網(wǎng)為200-300目并且在撈取切片之前進(jìn)行如下處理:將干凈的銅網(wǎng)平鋪在培養(yǎng)皿內(nèi)濾紙上，然后緩慢倒入0.1-0.5%重量的Formvar溶液直到漫過銅網(wǎng)為止，再立即倒干培養(yǎng)皿內(nèi)液體，干燥備用。
[0017]吐溫20和40屬于非離子型表面活性劑，能降低槽液的表面張力和提高載網(wǎng)支持膜及樹脂切片的親水性。如果槽液的濃度太高，切片過程就會出現(xiàn)包埋塊沾水或切片浸濕而不能自由漂浮；如果濃度太低，則不易垂直拖起切片?？蓳?jù)此原則來調(diào)整和配制出適宜濃度的吐溫20或40槽液。槽液中吐溫20或吐溫40的濃度優(yōu)選為5ppm重量。通過上述方法，可有效減輕或消除切片褶皺的形成。
[0018]所述組織細(xì)胞標(biāo)本來自植物例如農(nóng)業(yè)作物和林業(yè)植物、微生物、食品、動物、人體等。對于植物、人體和動物體，尤其是人體和動物，根據(jù)該中間信息尚不能直接獲得診斷結(jié)果，必須將處理后的圖像數(shù)據(jù)進(jìn)行存儲，作為中間信息提供給病理學(xué)家，方便其進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)胞特征提取、分類、分析、比較，由其依賴其主觀分析得出可靠診斷結(jié)論。
[0019]目標(biāo)細(xì)胞的初步查找和選擇步驟可包括:將電鏡銅網(wǎng)超薄切片標(biāo)本置于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行視覺檢查，初步查找目標(biāo)細(xì)胞后，選擇并固定好觀察視野，在光學(xué)顯微鏡下拍攝細(xì)胞放大至少100倍的光鏡照片，其中目標(biāo)細(xì)胞的初步查找和選擇是基于細(xì)胞顯微成像的直接目的進(jìn)行的，所述直接目的包括為生物學(xué)、病理學(xué)、食品學(xué)和農(nóng)林業(yè)提供可用的有效中間信息。
[0020]制備好組織切片后，在顯微鏡下視覺檢查組織樣品，如果要對切片進(jìn)行詳細(xì)圖像分析，必須使用更大倍數(shù)的顯微鏡。
[0021]軟X射線成像步驟可包括:將電鏡銅網(wǎng)超薄切片標(biāo)本送至同步輻射裝置，應(yīng)用同步輻射軟X射線顯微光束線掃描，顯影在光刻膠上，再用顯微透射進(jìn)行觀察并拍攝出軟X射線顯微成像的圖像，軟X射線顯微光束波長范圍為1.0-10.0nm,軟X射線顯微對生物樣品曝光的水窗材料為氮化娃，最小厚度為20nm,所述氮化娃的配比為Si3N4,窗口尺寸為
0.1-0.5mm X 0.1-0.5mm,優(yōu)選 0.2mm X 0.2mm。
[0022]在另一方面，提供了一種圖像處理方法，該方法可用于處理前述方法獲得的圖像以降低噪聲、消除偽影和提高對比度，處理步驟包括:在同步輻射軟X射線細(xì)胞顯微成像后，首先進(jìn)行圖像信號調(diào)理，然后進(jìn)入圖像信號采集進(jìn)行數(shù)字采樣，最終將數(shù)字信號以串口或并口的形式送入計算機(jī)系統(tǒng)進(jìn)行處理，其中，同步輻射軟X射線顯微圖像信號是模擬信號，在變換為數(shù)字信號之前進(jìn)行調(diào)理，即放大、緩沖或定標(biāo)模擬信號，以適合于后續(xù)信號采集單元輸入；圖像信號采集包括圖像預(yù)處理、圖像分割分析和重疊細(xì)胞重構(gòu)。
[0023]所述圖像預(yù)處理包括灰度變換、直方圖調(diào)整、細(xì)胞前置處理、細(xì)胞核前置處理以及去除干擾物質(zhì)；所述灰度變換為將細(xì)胞影像轉(zhuǎn)為灰度格式，以便于后續(xù)的處理工作，利用彩色影像與灰度影像之間的轉(zhuǎn)換公式進(jìn)行轉(zhuǎn)換；所述直方圖調(diào)整為采用直方圖拉伸或直方圖均衡化方法間接增強(qiáng)對比度；所述細(xì)胞前置處理包括對比調(diào)整、二值化、邊緣檢測中的一種或其任意組合；所述去除干擾物質(zhì)包括侵蝕、擴(kuò)張及邏輯處理中的一種或其任意組合，目的是取得去除干擾物質(zhì)后的細(xì)胞影像。
[0024]通常，定量評價數(shù)字化圖像的重要步驟是圖像分割，其有時包括額外的預(yù)處理中間步驟。在分割期間，使細(xì)胞相互之間分離以及從圖像背景中分開。在一些情況中，算法的進(jìn)步已經(jīng)使得有可能向下分割細(xì)胞至亞細(xì)胞組分水平(即，核、細(xì)胞質(zhì)和膜)。然而，分割在圖像分析中經(jīng)常是困難、復(fù)雜且易出錯的步驟。對于以在數(shù)字化圖像中顯示良好的方式而使細(xì)胞被精細(xì)地分開和染色的切片來說，通常可以有效地完成分割。然而一旦上述條件之一未得到滿足，就必須應(yīng)用極復(fù)雜的和費時的分割算法，其中要應(yīng)用另外的關(guān)于細(xì)胞及其相互關(guān)系或者關(guān)于標(biāo)志物和復(fù)染亞細(xì)胞定位的已有知識，使整個過程變得非常復(fù)雜。例如，對于浸潤腫瘤的組織切片正是如此，此時切片中大部分細(xì)胞不能清楚地被分開，而是趨向于相互接觸和重疊。
[0025]在本發(fā)明中，圖像分割分析可包括；將第一快速行進(jìn)算法應(yīng)用于經(jīng)預(yù)處理的圖像以獲得第一快速行進(jìn)圖，所述第一快速行進(jìn)算法起始于圖像的背景，并且第一快速行進(jìn)算法的速度函數(shù)是基于圖像的第一邊緣強(qiáng)度圖；將第一快速行進(jìn)圖分割成多個同質(zhì)區(qū)域；將所述同質(zhì)區(qū)域中的每一個區(qū)域分別映射到所述圖像的一個結(jié)點使得相鄰?fù)|(zhì)區(qū)域的結(jié)點彼此相連，以及使得圖像包含與位于細(xì)胞中心的同質(zhì)區(qū)域相對應(yīng)的根結(jié)點；基于所述圖像，將每個同質(zhì)區(qū)域按前景或背景進(jìn)行劃分；在所述按前景劃分的同質(zhì)區(qū)域內(nèi)將第二快速行進(jìn)算法應(yīng)用于第二邊緣強(qiáng)度圖，使得將前景分割成單個的細(xì)胞，其中該第二快速行進(jìn)算法起始于與所述圖像的根結(jié)點相對應(yīng)的同質(zhì)區(qū)域。通過采用本發(fā)明的圖像分割方法，即使對于細(xì)胞相互接觸和重疊嚴(yán)重的情形，有效地使細(xì)胞相互之間分離并且從圖形背景中分開。
[0026]本發(fā)明的上述圖像分割方法還具有諸多顯著優(yōu)點:圖像中存在的生物細(xì)胞可通過第一快速行進(jìn)算法得到放大以獲得第一快速行進(jìn)圖，與不應(yīng)用第一快速行進(jìn)算法的圖像相比，這使得能夠更容易地將第一快速行進(jìn)圖分割成多個同質(zhì)區(qū)域；此外，通過將通知區(qū)域映射到圖的結(jié)點，可以形成簡單明了的判定標(biāo)準(zhǔn)；該判定標(biāo)準(zhǔn)可以按簡單方式應(yīng)用于同質(zhì)區(qū)域按前景或背景劃分的步驟中；另外，將同質(zhì)區(qū)域按前景或背景劃分使得第二快速行進(jìn)算法僅僅只需應(yīng)用于作為前景劃分的同質(zhì)區(qū)域內(nèi)，從而使第二快速行進(jìn)算法的運算時間和成本得到很大減少。
[0027]所述重疊細(xì)胞重構(gòu)可以包括:基于所述經(jīng)圖像分割后的映射數(shù)據(jù)來執(zhí)行三維反映射處理，該三維反映射處理包括將所述映射數(shù)據(jù)用濾波器沿行方向進(jìn)行卷積，該濾波器的濾波器系數(shù)在多行X射線檢測器的一條通道和另一條通道彼此之間不同；以及對由所述三維反映射處理獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行重構(gòu)函數(shù)卷積，從而有效消除由于細(xì)胞間的相互連接、相鄰邊界緊密重疊而使分割造成的偽邊界和偽輪廓，避免細(xì)胞發(fā)生信息提取產(chǎn)生誤差，通過該重疊細(xì)胞重構(gòu)使得將這些因素消除。
[0028]在又一方面，提供了一種細(xì)胞顯微成像分析系統(tǒng)，其包括:光學(xué)顯微鏡系統(tǒng)、同步輻射裝置、圖像處理系統(tǒng)和顯示裝置，其中:所述同步輻射裝置包含單色器，該單色器包括在入口狹縫和出口狹縫之間的兩個鏡和一個衍射光柵，所述兩個鏡為柱面鏡而且設(shè)置成使得它們的弧矢面與所述光柵的切面或色散面重合，并且所述入口狹縫和出口狹縫相對于光柵的中心對稱分布；所述同步輻射裝置還包含光傳感器、評估單元和控制單元，其中所述光傳感器部件用于實時接收來自X射線源的軟X射線所發(fā)出的光，所述評估單元用于評估軟X光的量，所述控制單元用于基于該評估結(jié)果來控制X光源；所述圖像處理系統(tǒng)能夠?qū)嵤┥衔乃龅膱D像處理方法；以及所述顯示裝置能夠?qū)⒔?jīng)處理的數(shù)字信號轉(zhuǎn)換為可視圖像。上述單色器器件的設(shè)置能夠更有效地使狹縫開口與距離相匹配，極大地提高接受強(qiáng)度和分辨率，減少環(huán)境本底的干擾。由于成像機(jī)時有限，必須要快速、靈活地進(jìn)行能量切換和光束調(diào)節(jié)，達(dá)到光源的最佳化，以節(jié)省用戶有限的機(jī)時，上述通過軟X光的量的動態(tài)控制，可獲得最佳的成像效果，克服了現(xiàn)有技術(shù)中存在的軟X光的量固定所帶來的適應(yīng)性差的問題，并且大大節(jié)省了用戶的機(jī)時。經(jīng)處理的數(shù)字信號轉(zhuǎn)換的可視圖像能夠恰當(dāng)、準(zhǔn)確地表現(xiàn)出原始光學(xué)圖像的重要信息。
[0029]利用軟X射線顯微方法對生物樣品曝光所采用的含氮化硅薄膜的衍射光柵可以通過如下方法制得:在潔凈的石英玻璃襯底上，用電子束蒸發(fā)方法制得Cr/Au層，從而形成基片，其中Cr層的厚度為2-10nm，Au層的厚度為5_20nm，在該基片上旋涂厚度為100-800nm的電子束光刻膠，并在烘箱中干燥，然后利用電子束在涂有電子束光刻膠的基片上轟擊出所需的波帶片圖形；對形成的波帶片圖形進(jìn)行曝光，然后使用顯影液進(jìn)行顯影，在基片上形成衍射光柵的光刻膠圖形，然后采用等離子體氣相沉積技術(shù)，在形成衍射光柵的光刻膠圖形的基片上沉積一層氮化硅層，該氮化硅層的厚度是波長的奇數(shù)倍，所述氮化硅層的沉積在100-150°C的溫度下進(jìn)行；用去膠液去除光刻膠，然后采用ICP刻蝕基片底層的鉻層和金層，從而形成含氮化娃薄膜的衍射光柵。
[0030]光刻劑優(yōu)選是由下面通式I表示的單元構(gòu)成:
【權(quán)利要求】
1.一種細(xì)胞顯微成像方法，其特征在于該方法利用軟X射線進(jìn)行細(xì)胞亞微結(jié)構(gòu)的成像，其包括以下步驟:(I)標(biāo)本制作；(2)目標(biāo)細(xì)胞的初步查找和選擇；和(3)軟X射線成像。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述標(biāo)本制作步驟包括:(I)將組織細(xì)胞標(biāo)本切成超薄切片標(biāo)本，超薄切片標(biāo)本厚度為1.5-5nm ；(2)將已切好的超薄切片標(biāo)本放置在38°C -40°C水槽的水面上，使標(biāo)本漂浮于水面迅速均勻展開呈平面狀，所述槽液中含有3ppm-10ppm重量的吐溫20或吐溫40，優(yōu)選吐溫20 ;和(3)使用電鏡銅網(wǎng)撈取已在水槽漂浮展平的超薄切片標(biāo)本，再將該電鏡銅網(wǎng)放在吸水紙上控盡水分并晾干，所述電鏡銅網(wǎng)為200-300目并且在撈取切片之前進(jìn)行如下處理:將干凈的銅網(wǎng)平鋪在培養(yǎng)皿內(nèi)濾紙上，然后緩慢倒入0.1-0.5%重量的Formvar溶液直到漫過銅網(wǎng)為止,再立即倒干培養(yǎng)皿內(nèi)液體，干燥備用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述目標(biāo)細(xì)胞的初步查找和選擇步驟包括:將電鏡銅網(wǎng)超薄切片標(biāo)本置于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行視覺檢查，初步查找目標(biāo)細(xì)胞后，選擇并固定好觀察視野，在光學(xué)顯微鏡下拍攝細(xì)胞放大至少100倍的光鏡照片，其中目標(biāo)細(xì)胞的初步查找和選擇是基于細(xì)胞顯微成像的直接目的進(jìn)行的，所述直接目的包括為生物學(xué)、病理學(xué)、醫(yī)學(xué)、食品和農(nóng)林業(yè)提供有效中間信息。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述軟X射線成像步驟包括: 將電鏡銅網(wǎng)超薄切片標(biāo)本送至同步輻射裝置，應(yīng)用同步輻射軟X射線顯微光束線掃描，顯影在光刻膠上，再用顯微透射進(jìn)行觀察并拍攝出軟X射線顯微成像的圖像，軟X射線顯微光束波長范圍為1.0-10.0nm,軟X射線顯微對生物樣品曝光的水窗材料為氮化硅，最小厚度為20nm，所述氮 化硅的配比為Si3N4，窗口尺寸為0.1-0.5mm X 0.1-0.5mm。
5.一種圖像處理方法，該方法可用于處理根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的方法獲得的圖像以降低噪聲、消除偽影和提高對比度，處理步驟包括:在同步輻射軟X射線細(xì)胞顯微成像后，首先進(jìn)行圖像信號調(diào)理，然后進(jìn)入圖像信號采集進(jìn)行數(shù)字采樣，最終將數(shù)字信號以串口或并口的形式送入計算機(jī)系統(tǒng)進(jìn)行處理，其中，同步輻射軟X射線顯微圖像信號是模擬信號，在變換為數(shù)字信號之前進(jìn)行調(diào)理，即放大、緩沖或定標(biāo)模擬信號，以適合于后續(xù)信號采集單元輸入；圖像信號采集包括圖像預(yù)處理、圖像分割分析和重疊細(xì)胞重構(gòu)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的圖像處理方法，其中所述圖像預(yù)處理包括灰度變換、直方圖調(diào)整、細(xì)胞前置處理、細(xì)胞核前置處理以及去除干擾物質(zhì)；所述灰度變換為將細(xì)胞影像轉(zhuǎn)為灰度格式，以便于后續(xù)的處理工作，利用彩色影像與灰度影像之間的轉(zhuǎn)換公式進(jìn)行轉(zhuǎn)換；所述直方圖調(diào)整為采用直方圖拉伸或直方圖均衡化方法間接增強(qiáng)對比度；所述細(xì)胞前置處理包括對比調(diào)整、二值化、邊緣檢測中的一種或其任意組合；所述去除干擾物質(zhì)包括侵蝕、擴(kuò)張及邏輯處理中的一種或其任意組合，目的是取得去除干擾物質(zhì)后的細(xì)胞影像。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的圖像處理方法，其中所述圖像分割包括；將第一快速行進(jìn)算法應(yīng)用于經(jīng)預(yù)處理的圖像以獲得第一快速行進(jìn)圖，所述第一快速行進(jìn)算法起始于圖像的背景，并且第一快速行進(jìn)算法的速度函數(shù)是基于圖像的第一邊緣強(qiáng)度圖；將第一快速行進(jìn)圖分割成多個同質(zhì)區(qū)域；將所述同質(zhì)區(qū)域中的每一個區(qū)域分別映射到所述圖像的一個結(jié)點使得相鄰?fù)|(zhì)區(qū)域的結(jié)點彼此相連，以及使得圖像包含與位于細(xì)胞中心的同質(zhì)區(qū)域相對應(yīng)的根結(jié)點；基于所述圖像，將每個同質(zhì)區(qū)域按前景或背景進(jìn)行劃分；在所述按前景劃分的同質(zhì)區(qū)域內(nèi)將第二快速行進(jìn)算法應(yīng)用于第二邊緣強(qiáng)度圖，使得將前景分割成單個的細(xì)胞，其中該第二快速行進(jìn)算法起始于與所述圖像的根結(jié)點相對應(yīng)的同質(zhì)區(qū)域，所述第一邊緣強(qiáng)度圖與第二邊緣強(qiáng)度圖不同，所述第一快速行進(jìn)算法和第二快速行進(jìn)算法相同或不同。
8.根據(jù)權(quán)利要求5-7中任一項所述的圖像處理方法，其中所述重疊細(xì)胞重構(gòu)包括:基于所述經(jīng)圖像分割后的映射數(shù)據(jù)來執(zhí)行三維反映射處理，該三維反映射處理包括將所述映射數(shù)據(jù)用濾波器沿行方向進(jìn)行卷積，該濾波器的濾波器系數(shù)在多行X射線檢測器的一條通道和另一條通道彼此之間不同；以及對由所述三維反映射處理獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行重構(gòu)函數(shù)卷積，從而有效消除由于細(xì)胞間的相互連接、相鄰邊界緊密重疊而使分割造成的偽邊界和偽輪廓，避免細(xì)胞發(fā)生信息提取產(chǎn)生誤差，通過該重疊細(xì)胞重構(gòu)使得將這些因素消除。
9.一種細(xì)胞顯微成像分析系統(tǒng)，其包括:光學(xué)顯微鏡系統(tǒng)、同步輻射裝置、圖像處理系統(tǒng)和顯示裝置，其中 所述同步輻射裝置包含單色器，該單色器包括在入口狹縫和出口狹縫之間的兩個鏡和一個衍射光柵，所述兩個鏡為柱面鏡而且設(shè)置成使得它們的弧矢面與所述光柵的切面或色散面重合，并且所述入口狹縫和出口狹縫相對于光柵的中心對稱分布； 所述同步輻射裝置還包含光傳感器、評估單元和控制單元，其中所述光傳感器部件用于實時接收來自X射線源的軟X射線所發(fā)出的光，所述評估單元用于評估軟X光的量，所述控制單元用于基于該評估結(jié)果來控制X光源； 所述圖像處理系統(tǒng)能夠?qū)嵤?quán)利要求5-8中任一項的圖像處理方法；以及 所述顯示裝置能夠?qū)⒔?jīng)處理的數(shù)字信號轉(zhuǎn)換為可視圖像。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的細(xì)胞顯微成像分析系統(tǒng)，其中利用軟X射線顯微方法對生物樣品曝光所采用的含氮化硅薄膜的衍射光柵通過如下方法制得:在潔凈的石英玻璃襯底上，用電子束蒸發(fā)方法制得Cr/Au層，從而形成基片，其中Cr層的厚度為2_10nm，Au層的厚度為5-20nm，在該基片上旋涂厚度為100_800nm的電子束光刻膠，并在烘箱中干燥，然后利用電子束在涂有電子束光刻膠的基片上轟擊出所需的波帶片圖形；對形成的波帶片圖形進(jìn)行曝光，然后使用顯影液進(jìn)行顯影，在基片上形成衍射光柵的光刻膠圖形，然后采用等離子體氣相沉積技術(shù)，在形成衍射光柵的光刻膠圖形的基片上沉積一層氮化娃層，該氮化娃層的厚度是波長的奇數(shù)倍，所述氮化硅層的沉積在100-150°C的溫度下進(jìn)行；用去膠液去除光刻膠，然后采用ICP刻蝕基片底層的鉻層和金層，從而形成含氮化硅薄膜的衍射光柵。
【文檔編號】G06T5/40GK103760179SQ201410027316
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月22日
【發(fā)明者】郝建, 張帆, 董茂生, 羅毅, 吳升, 趙永飛, 王波 申請人:杭州一二八醫(yī)院