一種檢測大腸桿菌的電化學(xué)生物傳感器的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于電化學(xué)生物檢測領(lǐng)域，解決了大腸桿菌特異性檢測的電化學(xué)傳感器的制備問題。要點如下：首先該電化學(xué)傳感器以玻碳電極為基底電極，將制備的氧化石墨烯滴加在玻碳電極表面，在PBS緩沖液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，完成氧化石墨烯的電還原，之后將電極浸泡在氯金酸溶液中，通過電化學(xué)還原在玻碳電極的表面覆蓋一層金納米薄膜，然后，利用探針DNA的端氨基與金納米粒子之間的金氨共價鍵和靜電吸附作用，將探針DNA固定在電極表面，完成傳感器的制備。實驗表明，這兩種修飾材料極大的增加了電子在電極表面的傳輸速率，同時增大電極的電活化面積，保證了傳感器的靈敏度及檢測限，因此它在食品、醫(yī)藥、環(huán)境等領(lǐng)域?qū)⒂芯薮蟮膽?yīng)用潛力。
【專利說明】
一種檢測大腸桿菌的電化學(xué)生物傳感器的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于電化學(xué)生物檢測領(lǐng)域，特別涉及了一種新型高靈敏度與檢測限的大腸桿菌特異性檢測的電化學(xué)傳感器的制備問題?！颈尘凹夹g(shù)】[00〇2]石墨稀(graphene)是碳原子以sp2雜化方式連接成的二維晶體，由正六邊形的晶格組成，每個碳原子通過〇鍵與其他三個碳原子相連，這些較強(qiáng)的C-C鍵使得石墨烯具有優(yōu)良的剛性結(jié)構(gòu)。每個碳原子中未成鍵的31電子在與平面垂直的方向上形成大的31軌道且31電子可以在晶體中自由移動，這便使得石墨烯具有良好的導(dǎo)電性。因此常用作電化學(xué)電極的修飾材料。
[0003]電化學(xué)DNA傳感器在DNA檢測中具有重要的位置，隨著科技的進(jìn)步電化學(xué)DNA傳感器向著高精準(zhǔn)、高選擇性、低成本和小型化等方向發(fā)展。在電化學(xué)DNA傳感器的制作過程中， 基于DNA的直接氧化反應(yīng)的方法是最為經(jīng)濟(jì)簡便的。石墨烯和納米金修飾的電極可以對DNA 中的四種堿基(腺嘌呤A、胞嘧啶C、鳥嘌呤G和胸腺嘧啶T)進(jìn)行同時測定并且互不干擾。此外基于DNA與石墨烯或G0的3T-3T電子的相互作用、靜電作用以及疏水作用也可構(gòu)建電化學(xué)DNA 傳感器。因此，電化學(xué)法可以對大腸桿菌進(jìn)行快速、準(zhǔn)確診斷的分析檢測。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本實驗中設(shè)計了一種操作簡單，檢測快速、準(zhǔn)確的電化學(xué)DNA傳感器，并且實現(xiàn)了對大腸桿菌目標(biāo)DNA的檢測。本發(fā)明的主要內(nèi)容包括:
[0005](1)氧化石墨烯的制備及電化學(xué)還原
[0006]本實驗采用改進(jìn)的Hummers，成功合成了高質(zhì)量的氧化石墨稀.稱取制備完成的氧化石墨烯粉末2.0g溶解于lml超純水中，配制成2.0g/ml的溶液，然后于超聲清洗機(jī)中進(jìn)行超聲剝離60min，得到深棕色懸濁液。將制備完成的氧化石墨烯溶液滴加在經(jīng)過打磨并超聲清洗過的玻碳電極表面，并且在在PBS緩沖液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，完成氧化石墨烯的電還原。(2)AuNPs的電沉積
[0007]將ERGO修飾的玻碳電極用蒸餾水沖洗后放置氯金酸溶液中。采用電化學(xué)方法沉積 300s，可以在電極表面形成一層致密的金膜，電沉積完成后，立即將電極取出用蒸餾水沖洗，最后用氮氣吹干，即完成AuNPs的電沉積?！揪唧w實施方式】
[0008]實施例1
[0009](1)氧化石墨烯的制備及電化學(xué)還原在冰水浴條件下，取濃硫酸60mL加入到盛有 2.0g石墨粉和2.0g硝酸鈉的三口燒瓶中，保證燒瓶內(nèi)溫度維持在4°C左右。然后將研磨后的 12.0g高錳酸鉀加入其中，將體系加熱到35°C，保持90分鐘，以2滴每秒的速度加入80mL二次水。然后將混合物加熱到95°C冷凝回流，保持1.5小時。反應(yīng)結(jié)束后向其中加入超純水200mL，待溶液溫度自然降溫至50°C后加入10mL30%的過氧化氫，反應(yīng)完成得到亮黃色懸濁液。經(jīng)離心清洗、透析去除產(chǎn)物中未反應(yīng)完全的雜質(zhì)及金屬離子，并將產(chǎn)物pH值調(diào)至7左右。 真空干燥后研磨得到產(chǎn)物氧化石墨烯粉末。稱取制備完成的氧化石墨烯粉末2.0g溶解于 lml超純水中，配制成2.0g/ml的溶液，然后于超聲清洗機(jī)中進(jìn)行超聲剝離60min，得到深棕色懸濁液。用移液槍取15此滴加在預(yù)處理完成的玻碳電極表面，電極垂直倒置，室溫中自然晾干。之后用蒸餾水緩緩沖洗后放置在0.1M PBS緩沖液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描(掃描范_ 1.7V—0V，掃速50mV/s)，至峰形及峰電流值穩(wěn)定不變?yōu)橹?，完成氧化石墨稀的電還原。 [〇〇1〇] (2)AuNPs的電沉積將ERGO修飾的玻碳電極用蒸餾水沖洗后放置在5.0mM的氯金酸溶液中，氯金酸溶液以0.5M的硫酸溶液為溶劑配制。在-0.4V的電壓下電沉積300s，可以在電極表面形成一層致密的金膜，電沉積完成后，立即將電極取出用蒸餾水沖洗2min，以防止金納米粒子在電極表面的進(jìn)一步增長。最后用氮氣吹干，放置備用。
[0011](3)電化學(xué)傳感器的構(gòu)建
[0012]①本實驗采用改進(jìn)的Hmiimers，成功合成了高質(zhì)量的氧化石墨稀.稱取制備完成的氧化石墨烯粉末2.0g溶解于lml超純水中，配制成2.0g/ml的溶液，然后于超聲清洗機(jī)中進(jìn)行超聲剝離60min，得到深棕色懸濁液。
[0013]②將經(jīng)步驟①制備完成的氧化石墨烯溶液滴加在經(jīng)過打磨并超聲清洗過的玻碳電極表面，并且在在PBS緩沖液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，完成氧化石墨烯的電還原。
[0014]③將步驟②所制備的被ERGO修飾的玻碳電極用蒸餾水沖洗后放置在5.0mM的氯金酸溶液，在-〇.4V電勢下電沉積300s，會在電極表面形成一層光亮的金膜。[〇〇15]④將經(jīng)步驟③氧化還原后的電極用蒸餾水沖洗2min，以防止金納米粒子在電極表面的進(jìn)一步增長，并用氮氣吹干，放置備用。[〇〇16] ⑤在經(jīng)步驟④處理的電極表面滴加5yL端氨基修飾的探針DNA(lOyM)和10yL Tris-HCl緩沖完成電極的修飾。然后用Tris-HCl緩沖液(含20mM的NaCl溶液)和超純水緩緩清洗，去除未結(jié)合的探針DNA和雜質(zhì)，最后用氮氣吹干備用，完成傳感器的制備。
【主權(quán)項】
1.一種基于石墨烯和金納米粒子修飾的玻碳電極，其特征在于顯著增強(qiáng)了玻碳電極的 電化學(xué)性能。2.—種檢測大腸桿菌的電化學(xué)傳感器，其特征在于實現(xiàn)了大腸桿菌的快速、靈敏的檢 測。3.權(quán)利要求1所述的基于石墨稀和金納米粒子修飾的玻碳電極，其制備方法為:(1)ERGO修飾玻碳電極稱取制備完成的氧化石墨烯粉末2.0g溶解于lml超純水中，配制成2.0g/ml的溶液，然 后于超聲清洗機(jī)中進(jìn)行超聲剝離60min，得到深棕色懸濁液，用移液槍取15此滴加在預(yù)處理 完成的玻碳電極表面，電極垂直倒置，室溫中自然晾干，之后用蒸餾水緩緩沖洗后放置在 0.1MPBS緩沖液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描(掃描范圍-1.7V—0V，掃速50mV/s)，至峰形及峰電流 值穩(wěn)定不變?yōu)橹?，完成氧化石墨稀的電還原，至此，得到ERGO修飾的玻碳電極。(2)AuNPs的電沉積將ERGO修飾的玻碳電極用蒸餾水沖洗后放置在5.0mM的氯金酸溶液中，氯金酸溶液以 0.5M的硫酸溶液為溶劑配制，在-0.4V的電壓下電沉積300s，可以在電極表面形成一層致密 的金膜，電沉積完成后，立即將電極取出用蒸餾水沖洗2min，以防止金納米粒子在電極表面 的進(jìn)一步增長，最后用氮氣吹干，放置備用。4.權(quán)利要求2所述的一種檢測大腸桿菌的電化學(xué)傳感器，其制備方法為:(1)本實驗采用改進(jìn)的Hummers，成功合成了高質(zhì)量的氧化石墨稀，稱取制備完成的氧 化石墨烯粉末2.0g溶解于lml超純水中，配制成2.0g/ml的溶液，然后于超聲清洗機(jī)中進(jìn)行 超聲剝離60min，得到深棕色懸濁液。(2)將經(jīng)步驟(1)制備完成的氧化石墨烯溶液滴加在經(jīng)過打磨并超聲清洗過的玻碳電 極表面，并且在在PBS緩沖液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，完成氧化石墨烯的電還原。(3)將步驟(2)所制備的被ERGO修飾的玻碳電極用蒸餾水沖洗后放置在5.0mM的氯金酸 溶液，在-0.4V電勢下電沉積300s，會在電極表面形成一層光亮的金膜。(4)將經(jīng)步驟(3)氧化還原后的電極用蒸餾水沖洗2min，以防止金納米粒子在電極表面 的進(jìn)一步增長，并用氮氣吹干，放置備用。(5)在經(jīng)步驟(4)處理的電極表面滴加5yL端氨基修飾的探針DNA(lOyM)和10yL Tris-HC1緩沖完成電極的修飾，然后用Tr i s-HCl緩沖液(含20mM的NaCl溶液)和超純水緩緩清洗， 去除未結(jié)合的探針DNA和雜質(zhì)，最后用氮氣吹干備用，完成傳感器的制備。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種檢測大腸桿菌的電化學(xué)傳感器，其特征在于利用氧化的 石墨烯和金納米粒子的協(xié)同作用對電信號進(jìn)行增強(qiáng)，提高大腸桿菌電化學(xué)檢測的靈敏度和 檢測限。6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種檢測大腸桿菌的電化學(xué)傳感器，其用途在于能夠快速，準(zhǔn) 確的對大腸桿菌進(jìn)行定量檢測。
【文檔編號】G01N27/48GK106093171SQ201610361791
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年5月27日
【發(fā)明人】許世超, 溫俊男, 張憶, 張憶一
【申請人】天津工業(yè)大學(xué)