單個(gè)囊泡融合和回收及其與鈣離子通道耦合的膜片鉗檢測(cè)裝置的制造方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種單個(gè)囊泡融合和回收及其與鈣離子通道耦合的膜片鉗檢測(cè)裝置，屬于神經(jīng)生物學(xué)研究檢測(cè)儀器領(lǐng)域。其技術(shù)方案要點(diǎn)是電腦程序控制下包括膜電容檢測(cè)模塊、鈣離子單通道電流檢測(cè)模塊和測(cè)量平臺(tái)。本發(fā)明的用途是為檢測(cè)單個(gè)囊泡融合與回收的動(dòng)力學(xué)特性、鈣離子單通道電流特性以及單個(gè)囊泡融合和回收與鈣離子通道的耦合的動(dòng)力學(xué)特性提供了一種直接、定量、實(shí)時(shí)以及高時(shí)間分辨率、高信噪比、高精度的檢測(cè)裝置。
【專利說明】
單個(gè)囊泡融合和回收及其與鈣離子通道耦合的膜片鉗檢測(cè)裝置
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于科學(xué)儀器領(lǐng)域，具體涉及一種用于研究單個(gè)囊泡與突觸前膜融合與回收的動(dòng)力學(xué)、鈣離子單通道電流的動(dòng)力學(xué)，單個(gè)囊泡的融合和回收及其與鈣離子通道耦合的高精度檢測(cè)裝置。尤其涉及一種用于神經(jīng)突觸傳遞領(lǐng)域研究以及突觸相關(guān)神經(jīng)疾病研究的電生理檢測(cè)系統(tǒng)。
【背景技術(shù)】
[0002]萬億個(gè)神經(jīng)元構(gòu)成了一個(gè)有序而動(dòng)態(tài)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。神經(jīng)突觸的聯(lián)接形成神經(jīng)信息處理的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，突觸神經(jīng)遞質(zhì)的釋放成為神經(jīng)信息傳遞的生理基礎(chǔ)。當(dāng)突觸前膜去極化或是產(chǎn)生動(dòng)作電位，Ca2+通過電壓門控的鈣離子通道流入，與相應(yīng)的Ca2+感應(yīng)器結(jié)合而觸發(fā)突觸囊泡與突觸前膜發(fā)生融合形成囊泡的胞吐，神經(jīng)遞質(zhì)繼而釋放并與突觸后受體結(jié)合從而引發(fā)突觸后神經(jīng)元的后續(xù)電活動(dòng)，從而完成神經(jīng)信息的傳遞和處理，而突觸囊泡通過胞吞方式再次回收利用。神經(jīng)系統(tǒng)完成復(fù)雜的功能有賴于其基本單元一一神經(jīng)元之間的高度精確和有效的信息傳遞。神經(jīng)遞質(zhì)釋放動(dòng)力學(xué)的改變可引起神經(jīng)系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)的紊亂并可能導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生。Thomas C.Sudhof發(fā)現(xiàn)了 Ca2+通過電壓門控的鈣離子通道流入后與相應(yīng)的Ca2+感應(yīng)器synaptogamin結(jié)合并觸發(fā)囊泡融合，從而揭示了囊泡釋放被運(yùn)輸物的時(shí)間精確性，從而于2013年被授予了諾貝爾獎(jiǎng)醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。目前為止研究者提出了兩種主要的囊泡胞吐和胞吞的方式:全融合方式(full-collapse)和快速胞吐-胞吞(kiss-and_run)方式。
[0003]—般認(rèn)為胞吐發(fā)生在活性帶區(qū)域(active zone)，胞吞發(fā)生在內(nèi)吞區(qū)(endocytotic zone)，而I丐離子是調(diào)控突觸囊泡胞吐和胞吞的關(guān)鍵信使。因此，I丐離子通道與囊泡釋放位點(diǎn)的耦合對(duì)囊泡的融合至關(guān)重要。從某種意義上說，鈣通道與囊泡的距離決定了突觸傳遞的動(dòng)力學(xué)特性。利用冷凍斷裂技術(shù)(freeze-fracture)，并結(jié)合電子顯微鏡或原子力顯微鏡技術(shù)對(duì)活性帶區(qū)域的結(jié)構(gòu)分析，從而對(duì)囊泡融合位點(diǎn)與鈣離子通道的空間分布估算顯示:鈣離子通道呈簇狀分布，且與囊泡的距離小于20nm，顯示兩者之間的高度耦合關(guān)系。
[0004]檢測(cè)突觸前囊泡胞吐和胞吞的方法主要有電子顯微圖像、光學(xué)顯微熒光成像、膜片鉗突觸后電流間接推測(cè)方法和全細(xì)胞膜電容測(cè)量法。其中，膜片鉗全細(xì)胞膜電容測(cè)量技術(shù)是通過對(duì)全細(xì)胞膜電容的檢測(cè)，得到細(xì)胞膜面積的改變，觀測(cè)囊泡與細(xì)胞膜融合以及囊泡回收的現(xiàn)象。具有直接、定量和實(shí)時(shí)顯示的優(yōu)勢(shì)。然而這種方法受突觸終末的電學(xué)性質(zhì)的局限很大。在早期，這一技術(shù)主要用于對(duì)嗜鉻細(xì)胞、肥大細(xì)胞和顆粒細(xì)胞等分泌細(xì)胞的單個(gè)囊泡與細(xì)胞膜融合時(shí)產(chǎn)生的膜電容進(jìn)行檢測(cè)。之后通過提高信噪比成功地對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中單個(gè)囊泡與細(xì)胞膜的融合進(jìn)行電容檢測(cè)。近年來，這一技術(shù)已成功地用于觀察中樞神經(jīng)分泌和神經(jīng)突觸，實(shí)現(xiàn)了毫秒級(jí)時(shí)間分辨率精度上對(duì)中樞神經(jīng)細(xì)胞突觸前終末進(jìn)行突觸囊泡釋放和回收相關(guān)的全細(xì)胞膜電容記錄。但是它的實(shí)現(xiàn)是通過對(duì)270萬個(gè)自發(fā)性突觸后電流進(jìn)行疊加后計(jì)算得到單個(gè)囊泡的膜電容，雖然提高了檢測(cè)精度，但是它是一種間接的手段。近年來用細(xì)胞貼附式膜電容檢測(cè)技術(shù)將膜電容記錄精度提高到觀測(cè)單個(gè)突觸囊泡的水平，并且可以對(duì)kiss-and-run和全融合方式的胞吞胞吐進(jìn)行區(qū)分，但是其檢測(cè)精度難以應(yīng)用于對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)單個(gè)囊泡進(jìn)行檢測(cè)。關(guān)鍵點(diǎn)在于信噪比，只有將信噪比提高，將噪聲峰峰值水平降低到50aF以下才有可能檢測(cè)到中樞神經(jīng)系統(tǒng)單個(gè)囊泡的活動(dòng)。
[0005]鈣離子內(nèi)流驅(qū)動(dòng)突觸囊泡釋放神經(jīng)遞質(zhì)的動(dòng)力學(xué)，即鈣離子通道與單個(gè)囊泡胞吐胞吞的耦合是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域具有挑戰(zhàn)性且引起廣泛興趣的一個(gè)重要問題。對(duì)于理解局部鈣信號(hào)傳遞和突觸的生理過程，解釋突觸可塑性的機(jī)制以及鈣緩沖劑的作用，揭示大腦中信息的處理和編碼的機(jī)理至關(guān)重要。目前對(duì)這個(gè)問題的研究主要有兩種方法。第一種是通過對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)釋放的速率和突觸前終扣鈣通道電流之間對(duì)數(shù)-對(duì)數(shù)的關(guān)系進(jìn)行分析，得到的斜率被稱為鈣電流與囊泡融合的協(xié)同(cooperativity)。它間接的提供了鈣離子通道與囊泡胞吐的耦合關(guān)系以及活性帶的形態(tài)特征。通過這種分析方法得到在大鼠的calyx突觸中，不同類型的鈣離子通道電流N、P/Q和R型具有不同的協(xié)同作用。其中P/Q型高于N和R型，表明P/Q型鈣離子通道與囊泡間的距離小于另外兩種類型。隨著發(fā)育，囊泡融合速率明顯加快而所需開放的鈣離子通道數(shù)目減少，表明成熟突觸的鈣通道與鈣感受器的耦合更加緊密。在神經(jīng)肌肉接頭上，人們?cè)媒７抡婕夹g(shù)推測(cè)，Ca2+可以通過一個(gè)或是兩個(gè)鈣離子通道驅(qū)動(dòng)單個(gè)囊泡融合。通過突觸前終扣內(nèi)注入鈣離子螯合劑BAPTA和EGTA后進(jìn)行的突觸傳遞動(dòng)力學(xué)分析提供了另一種，可以分析鈣通道與Ca2+感受器耦合的方法。在幼齡動(dòng)物(出生后?8-10天)的calyx of Held突觸中，Ca2+與I丐感應(yīng)器的平均親合距離小于lOOnm。而在成熟(出生后?16-18天)的calyx of Held突觸中，親合距離小于20nmo
[0006]上述兩種方法基于全細(xì)胞記錄進(jìn)行檢測(cè)，通過間接的方式得到鈣通道與囊泡釋放的耦合關(guān)系。其缺點(diǎn)是難以確認(rèn)參與囊泡融合耦合的部分鈣通道，且難以區(qū)分fullcollapse和kiss-and-run兩種融合回收方式。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明優(yōu)化了現(xiàn)有的細(xì)胞貼附式膜片鉗膜電容檢測(cè)方法，降低了系統(tǒng)噪聲，將細(xì)胞貼附式膜片鉗電容檢測(cè)方法拓展到應(yīng)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)單個(gè)囊泡融合和回收的檢測(cè)，并在檢測(cè)單個(gè)囊泡活動(dòng)的同時(shí)對(duì)鈣通道電流進(jìn)行檢測(cè)，為研究單個(gè)突觸囊泡及其與鈣離子通道的耦合提供了一種直接的、高精度的，高分辨率的檢測(cè)系統(tǒng)。
[0008]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了以下方面:
[0009]本發(fā)明的第一方面提供一種膜片鉗檢測(cè)裝置，所述裝置包括膜電容檢測(cè)模塊、鈣離子單通道電流檢測(cè)模塊和測(cè)量平臺(tái)，其中所述膜電容檢測(cè)模塊包括膜片鉗放大器EPC-8 (安裝電容校準(zhǔn)按鈕的EPC-8，HEKA)、鎖相放大器(SR850，Stanford ResearchInstrument,U.S.A.)、第一帶阻濾波器(Quest Scientific Instruments)和第二帶阻濾波器；所述鈣離子單通道電流信號(hào)檢測(cè)模塊包括膜片鉗放大器EPC-10、第三帶阻濾波器、貝塞爾濾波器(Frequency Devices INC., Tunable acitve filter900);所述測(cè)量平臺(tái)包括光學(xué)顯微鏡(Olympus Corporat1n)(帶有物鏡和目鏡)與高精度樣本操作平臺(tái)(SutterInstrument, R0E-200)(包括微操縱器和載物臺(tái))，計(jì)算機(jī)工作站與AD/DA數(shù)據(jù)交換接口(BNC-2090，Nat1nal Instruments, U.S.A)和紅外相機(jī)(DVC Company, 710M-00-FW)以及灌流浴槽。
[0010]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，其中所述膜片鉗放大器EPC-8的參數(shù)設(shè)置為慢電容補(bǔ)償(C-slow):10pF range ;慢電容補(bǔ)償數(shù)值:0.2pF ;串聯(lián)電阻補(bǔ)償:off ;串聯(lián)電導(dǎo)補(bǔ)償數(shù)值:0.2 μ S ;增益:20-50mV/pA ;濾波器=Full ;刺激比例因子:0.1 ；TR:2 μ S。
[0011]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，其中所述鎖相放大器的參數(shù)設(shè)置為時(shí)間常數(shù):lms，24dB ;信號(hào)輸入:input:A，couple:AC，ground:Float ;靈敏度:lVr.m.s.；濾波:Line&2*Line ;通道 1:0utput:X，Offset:0ff，Rat1n:0ff，Expand:1 ;通道 2:Output:X，Offset:0ff，Rat1n:0ff，Expand:1 ;正弦波頻率 20KHz ;正弦波幅度:150mV-200mV ；Harm:I ；Trig:Sine ；Source:1nternal0
[0012]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，其中所述膜片鉗放大器EPC-10的參數(shù)設(shè)置為記錄模式:電壓鉗模式;增益:50mV/pA ;低通濾波filterl:30kHz ;低通濾波filter2:2.9_5kHz，記錄模式:0n Cello
[0013]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，其中所述貝塞爾濾波器的頻率設(shè)置為500Hz-lkHz。
[0014]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，其中所述光學(xué)顯微鏡為倒置顯微鏡，且物鏡米用長(zhǎng)工作距離。
[0015]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，其中所述的灌流浴槽的面積約為75_2，優(yōu)選當(dāng)使用腦片作為制備時(shí)，面積不大于75mm2，當(dāng)使用培養(yǎng)細(xì)胞或是急性分離細(xì)胞作為制備時(shí)，面積可以大于75mm2ο
[0016]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，其中所述的灌流浴槽的形狀為圓形。
[0017]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，其中所述膜片鉗放大器EPC-8、鎖相放大器、第一帶阻濾波器和第二帶阻濾波器，所述膜片鉗放大器EPC-10、第三帶阻濾波器、貝塞爾濾波器，所述光學(xué)顯微鏡、微操縱器的機(jī)箱外殼和紅外相機(jī)均將外殼做接地處理。
[0018]本發(fā)明的第二個(gè)方面提供本發(fā)明第一個(gè)方面所述的膜片鉗檢測(cè)裝置用于研究單個(gè)突觸囊泡胞吐和胞吞動(dòng)力學(xué)過程及其與鈣離子通道的耦合。
[0019]具體的，所述的膜電容檢測(cè)模塊的功能是檢測(cè)單個(gè)囊泡與細(xì)胞膜融合或回收時(shí)，產(chǎn)生的膜電容的改變。其中的膜片鉗放大器EPC-8用于提供膜電壓控制電位，測(cè)量被測(cè)細(xì)胞膜上的膜電流，對(duì)電極電容以及膜片電容進(jìn)行補(bǔ)償；鎖相放大器SR850功能是產(chǎn)生正弦波，并將記錄到的膜電流信號(hào)轉(zhuǎn)換為膜電容改變Y2和膜電導(dǎo)改變Yl兩路信號(hào)，并輸出；第一和第二帶阻濾波器的功能是將工頻噪聲50Hz濾掉。
[0020]在所述的膜電容檢測(cè)模塊中，數(shù)據(jù)通過16位的模擬數(shù)字轉(zhuǎn)換器(AD/DA轉(zhuǎn)換器)進(jìn)行數(shù)字采集；并通過igor軟件編寫的程序控制計(jì)算機(jī)的RS-232數(shù)據(jù)采集串聯(lián)口(Nat1nal Instruments, PC1-M10-16XE-10)對(duì)鎖相放大器進(jìn)行控制；鎖相放大器產(chǎn)生的正弦波通過開關(guān)控制是否疊加在膜片鉗放大器中所設(shè)置的控制電位(holding potential)上；兩路模擬數(shù)字轉(zhuǎn)換輸出口 CHl和CH2 ;CH1為鎖相放大器產(chǎn)生的正弦波輸出，CH2提供電壓鉗控制電位和電壓脈沖，用于做膜片鉗細(xì)胞封接；開關(guān)將兩路模擬信號(hào)進(jìn)行選擇或是疊加，輸出的TTL信號(hào)決定是輸出控制電位信號(hào)，還是輸出控制電位信號(hào)疊加正弦信號(hào)；開關(guān)的輸出接入膜片鉗放大器的刺激輸入端；膜片鉗放大器的電流輸出進(jìn)入鎖相放大器的信號(hào)輸入端，經(jīng)過信號(hào)分離，得到Y(jié)l (實(shí)部)和Y2 (虛部)兩路信號(hào)，通過帶阻濾波器將50Hz工頻干擾噪聲濾掉，最后經(jīng)AD/DA轉(zhuǎn)換器由電腦記錄信號(hào)；
[0021]進(jìn)一步地，在鈣離子單通道電流信號(hào)檢測(cè)模塊中，膜片鉗放大器EPC-10的功能是對(duì)鈣離子通道在各個(gè)膜電壓下的單通道電流進(jìn)行記錄；第三帶阻濾波器用于將記錄的單通道電流中的工頻干擾成分濾掉；貝塞爾濾波器用于對(duì)記錄的單通道電流進(jìn)行低通濾波。
[0022]在所述的鈣離子單通道電流信號(hào)檢測(cè)模塊中，EPC-10記錄到單個(gè)鈣離子通道電流信號(hào)輸入貝塞爾濾波器，采用低通濾波器進(jìn)行硬件低通濾波；濾波后的電流輸入第三帶阻濾波器，濾掉50Hz工頻干擾。
[0023]上述鈣離子單通道電流信號(hào)檢測(cè)模塊中，當(dāng)單獨(dú)采用EPC-10膜片鉗放大器對(duì)鈣離子單通道電流記錄時(shí)的設(shè)置為:記錄模式:電壓鉗模式；增益:50mV/pA ;低通濾波500-lkHz。當(dāng)膜電容與通道電流進(jìn)行同時(shí)記錄時(shí)不采用EPC-10，而直接采用EPC-8進(jìn)行記錄，參數(shù)設(shè)置如上所述。
[0024]進(jìn)一步地，在所述的測(cè)量平臺(tái)中采用倒置顯微鏡，物鏡采用長(zhǎng)工作距離(40 X/0.8w, OLYMPUS)以減小寄生電容(stray capacitance)。如果采用短工作距離的物鏡，物鏡與浴池溶液間的寄生電容難以被補(bǔ)償。
[0025]在所述的測(cè)量平臺(tái)中采用樣本操作平臺(tái)，對(duì)被視樣本進(jìn)行前后左右四個(gè)方向的移動(dòng)，使得被測(cè)細(xì)胞的位置移動(dòng)到視野范圍內(nèi)。
[0026]在所述的測(cè)量平臺(tái)中采用微操縱器，將玻璃微電極進(jìn)行入液，移動(dòng)到視野范圍內(nèi)，將電極深入到細(xì)胞上方一系列微操作，調(diào)整電極位置使得電極能進(jìn)行G Ω封接操作。
[0027]在所述的測(cè)量平臺(tái)中采用紅外相機(jī)結(jié)合微分干涉對(duì)比DIC偏振片(Nikon)，使被測(cè)細(xì)胞或組織更加立體清晰，將光學(xué)顯微鏡所觀察到的圖像在電腦屏幕上進(jìn)行可視化。使得操作玻璃微電極時(shí)的微操作步驟都能在電腦屏幕上進(jìn)行可視化。
[0028]在所述的測(cè)量平臺(tái)中采用AD/DA數(shù)據(jù)交換接口，數(shù)據(jù)通過16位的模擬數(shù)字轉(zhuǎn)換器進(jìn)行數(shù)字采集。膜電容變化Y2，膜電導(dǎo)變化Y1，和單通道電流I分別通過AD/DA數(shù)據(jù)交換接口輸入，并將數(shù)據(jù)輸出通過軟件程序讀入。
[0029]在所述測(cè)量平臺(tái)中，設(shè)計(jì)灌流浴槽的面積約為75mm2，形狀不限制于圓形。當(dāng)使用腦片作為制備時(shí)，面積不大于75mm2，當(dāng)使用培養(yǎng)細(xì)胞或是急性分離細(xì)胞作為制備時(shí)，面積可以大于75mm2。
[0030]本發(fā)明涉及的檢測(cè)裝置和檢測(cè)技術(shù)方案產(chǎn)生的有益效果是:(1)信噪比高，噪聲水平低。各個(gè)模塊的系統(tǒng)噪聲為:膜電容噪聲< 10aF，膜電導(dǎo)噪聲IpS，單通道電流噪聲(0.1pA0在體記錄時(shí)，膜電容噪聲彡50aF，膜電導(dǎo)噪聲10pS，單通道電流噪聲彡0.3pA ；
(2)檢測(cè)精度提高，拓展了該系統(tǒng)的應(yīng)用范圍，適用于分泌細(xì)胞如嗜鉻細(xì)胞、肥大細(xì)胞、PC12和顆粒細(xì)胞等的檢測(cè)，以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)中突觸尺寸較大的細(xì)胞如Calyx of Held ； (3)在檢測(cè)單個(gè)囊泡的融合和回收的同時(shí)能檢測(cè)鈣通道電流活動(dòng)。
【附圖說明】
[0031]圖1、細(xì)胞貼附式膜電容測(cè)量和離子通道電流偶聯(lián)檢測(cè)裝置
[0032]其中I表示紅外相機(jī)，2表示物鏡，3表示被測(cè)樣本，4表示灌流浴槽，5表示微操縱器，6表示載物臺(tái)，7表示目鏡
[0033]圖2、細(xì)胞貼附式膜電容檢測(cè)裝置
[0034]圖3、離子通道單通道電流檢測(cè)裝置
[0035]圖4、測(cè)量平臺(tái)
[0036]圖5、單個(gè)囊泡胞吐(A)和胞吞⑶的膜電容變化
[0037]圖6、Calyx of Held突觸前終末神經(jīng)遞質(zhì)釋放面鈣離子單通道電流(A)及統(tǒng)計(jì)結(jié)果(B)
【具體實(shí)施方式】
[0038]本系統(tǒng)的特征及技術(shù)內(nèi)容，參閱以下有關(guān)本發(fā)明的詳細(xì)說明與附圖，所附附圖僅提供參考和說明用，并非對(duì)本發(fā)明加以限制。
[0039]根據(jù)本發(fā)明，整個(gè)檢測(cè)裝置包括膜電容檢測(cè)模塊(左虛線框)、鈣離子單通道電流檢測(cè)模塊(右虛線框)和測(cè)量平臺(tái)(下虛線框)，如圖1所示。在記錄膜電容變化Yl和膜電導(dǎo)變化Y2的同時(shí)，記錄離子通道電流I。
[0040]在膜電容檢測(cè)模塊中，如圖2所示，膜片鉗放大器提供膜電位控制電壓，以及在信號(hào)記錄時(shí)對(duì)快電容和慢電容進(jìn)行補(bǔ)償，并記錄膜片電流。記錄的電流輸入到鎖相放大器中，鎖相放大器在信號(hào)記錄過程中提供一定頻率和一定幅度的正弦波，并將膜片鉗放大器記錄到的膜片電流分成膜電導(dǎo)變化Yl和膜電容變化Y2兩個(gè)信號(hào)通路進(jìn)行輸出。兩路信號(hào)分別使用帶阻濾波器將工頻噪聲濾掉后，信號(hào)輸入AD/DA轉(zhuǎn)換器，然后輸入電腦。
[0041]在鈣離子單通道電流檢測(cè)模塊中，如圖3所示。電流放大器通過提供電壓控制電位以及對(duì)電極電容進(jìn)行補(bǔ)償，通過高增益50mV/pA，記錄膜片上的單個(gè)或是多個(gè)離子通道電流，電流通過貝塞爾濾波器濾除高頻成分后，通過帶阻濾波器將工頻成分濾掉，最后信號(hào)輸入電腦記錄。
[0042]在測(cè)量平臺(tái)中，如圖4所示，將被測(cè)樣本(3)放在灌流浴槽(4)中，通過進(jìn)水管出水管以一定的速度進(jìn)行灌流，將灌流浴槽放在載物臺(tái)(6)上，通過樣本操作平臺(tái)，對(duì)被測(cè)樣本進(jìn)行前后左右四個(gè)方向的移動(dòng)，使得被測(cè)細(xì)胞的位置移動(dòng)到視野范圍內(nèi)。其中通過顯微鏡放大被視，采用倒置顯微鏡，物鏡(2)采用長(zhǎng)工作距離(40X/0.8w，OLYMPUS)以減小寄生電容(stray capacitance)。如果采用短工作距離的物鏡，物鏡與浴池溶液間的寄生電容難以被補(bǔ)償。在實(shí)驗(yàn)過程中，采用微操縱器(5)，將玻璃微電極進(jìn)行入液，移動(dòng)到視野范圍內(nèi)，將電極深入到細(xì)胞上方一系列微操作，調(diào)整電極位置使得電極能進(jìn)行GQ封接操作。以上操作均通過紅外相機(jī)(I)，并將光學(xué)顯微鏡所觀察到的圖像在電腦屏幕上進(jìn)行可視化。使得操作玻璃微電極時(shí)的微操作步驟都能在電腦屏幕上進(jìn)行可視化，并且操作更容易。
[0043]與現(xiàn)有裝置相比，膜電容、膜電導(dǎo)信噪比均有提高，膜電容檢測(cè)精度由檢測(cè)單個(gè)分泌細(xì)胞囊泡(約200nm)提高到檢測(cè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)單個(gè)突觸囊泡(約50nm)。有研究組利用細(xì)胞貼附式膜電容檢測(cè)系統(tǒng)，檢測(cè)嗜鉻細(xì)胞中單個(gè)囊泡回收時(shí)產(chǎn)生的膜電容變化(Henkel, et.al.，2001)。本發(fā)明中在中樞神經(jīng)系統(tǒng)Calyx of Held突觸上，對(duì)突觸前終末神經(jīng)遞質(zhì)釋放面做G Ω封接，測(cè)量到中樞神經(jīng)單個(gè)突觸囊泡膜電容約為74pF，直徑約為50nm，如圖5所示。單通道電流噪聲減小到可檢測(cè)單個(gè)鈣離子通道電流，同樣對(duì)突觸前終末神經(jīng)遞質(zhì)釋放面做細(xì)胞貼附式檢測(cè)，如圖6所示為記錄的靜息狀態(tài)下在不同胞外鈣濃度下鈣離子單通道電流，可記錄到在正常生理狀態(tài)下(2mM胞外鈣濃度，靜息膜電位)，鈣離子單通道電流約為0.28pA。
[0044]參考文獻(xiàn):
[0045]Henkel, A Wj Horstmannj Hj Kerstinj M.Direct observat1n of membraneretrieval in chromaffin cells by capacitance measutrements.FEBSLetters505(2001):414-418
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種膜片鉗檢測(cè)裝置，所述裝置包括膜電容檢測(cè)模塊、鈣離子單通道電流檢測(cè)模塊和測(cè)量平臺(tái)，其中所述膜電容檢測(cè)模塊包括安裝電容校準(zhǔn)按鈕的膜片鉗放大器EPC-8、鎖相放大器、第一帶阻濾波器和第二帶阻濾波器；所述鈣離子單通道電流信號(hào)檢測(cè)模塊包括膜片鉗放大器EPC-10、第三帶阻濾波器、貝塞爾濾波器；所述測(cè)量平臺(tái)包括光學(xué)顯微鏡、高精度樣本操作平臺(tái)、計(jì)算機(jī)工作站與AD/DA數(shù)據(jù)交換接口和紅外相機(jī)以及灌流浴槽。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膜片鉗檢測(cè)裝置，其中所述膜片鉗放大器EPC-8的參數(shù)設(shè)置為慢電容補(bǔ)償(C-slow):10pF range ;慢電容補(bǔ)償數(shù)值:0.2pF ;串聯(lián)電阻補(bǔ)償:off ;串聯(lián)電導(dǎo)補(bǔ)償數(shù)值:0.2 μ S ;增益:20-50mV/pA ;濾波器=Full ;刺激比例因子:0.1 ；TR:2 μ S。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膜片鉗檢測(cè)裝置，其中所述鎖相放大器的參數(shù)設(shè)置為時(shí)間常數(shù):1ms，24dB ;信號(hào)輸入:input:A，couple:AC，地(ground):Float ;靈敏度:lVr.m.s.?’濾波:Line&2*Line ;通道 1:輸出(Output):X，Offset:0ff，Rat1n:0ff，Expand:1 ;通道 2:輸出(Output):X，Offset:0ff，Rat1n:0ff，Expand:1 ;正弦波頻率 20KHz ;正弦波幅度:150mV-200mV ；Harm:1 ；Trig:Sine ；Source:1nternal。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膜片鉗檢測(cè)裝置，其中所述膜片鉗放大器EPC-10的參數(shù)設(shè)置為記錄模式:電壓鉗模式；增益:50mV/pA ;低通濾波filterl:30kHz ;低通濾波filter2:2.9_5kHz，記錄模式:0n Cell。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膜片鉗檢測(cè)裝置，其中所述貝塞爾濾波器的頻率設(shè)置為500Hz-lkHzo6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膜片鉗檢測(cè)裝置，其中所述光學(xué)顯微鏡為倒置顯微鏡，且物鏡采用長(zhǎng)工作距離。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膜片鉗檢測(cè)裝置，其中所述的灌流浴槽的面積約為75mm2，優(yōu)選當(dāng)使用腦片作為制備時(shí)，面積不大于75mm2，當(dāng)使用培養(yǎng)細(xì)胞或是急性分離細(xì)胞作為制備時(shí)，面積可以大于75mm2。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膜片鉗檢測(cè)裝置，其中所述的灌流浴槽的形狀為圓形。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膜片鉗檢測(cè)裝置，其中所述膜片鉗放大器EPC-8、鎖相放大器、第一帶阻濾波器和第二帶阻濾波器，所述膜片鉗放大器EPC-10、第三帶阻濾波器、貝塞爾濾波器，所述光學(xué)顯微鏡、微操縱器的機(jī)箱外殼和紅外相機(jī)均將外殼做接地處理。10.權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的膜片鉗檢測(cè)裝置用于研究單個(gè)突觸囊泡胞吐和胞吞的動(dòng)力學(xué)過程及其與鈣離子通道的耦合。
【文檔編號(hào)】G01N27/22GK106033069SQ201510104564
【公開日】2016年10月19日
【申請(qǐng)日】2015年3月10日
【發(fā)明人】陳培華, 孫堅(jiān)原, 申雪峰, 戴金葉, 張樹利
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所