單組份tmb顯色液及其配制方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種單組份TMB顯色液及其配制方法。該單組份TMB顯色液包括以下組分：TMB、二甲基亞砜、甘油、氧化劑、糖類化合物或其衍生物、緩沖液；所述單組份TMB顯色液的pH值為3.0?7.0；所述緩沖液選自檸檬酸?檸檬酸鈉緩沖液、檸檬酸?EDTA緩沖液、檸檬酸?乙酸鈉緩沖液或檸檬酸?磷酸氫二鈉緩緩沖液；所述糖類化合物或其衍生物選自糖苷或其衍生物、葡聚糖或其衍生物和聚蔗糖或其衍生物中的至少一種。所述單組份TMB顯色液能夠用于Western、IHC或原位雜交等實(shí)驗(yàn)，靈敏度高、穩(wěn)定性好、保存時(shí)間長。
【專利說明】
單組份TMB顯色液及其配制方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及生物體外診斷試劑技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種單組分TMB顯色液及其制備方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]在分子生物學(xué)與病理領(lǐng)域中，進(jìn)行Western、免疫組化(IHC)或原位雜交等試驗(yàn)時(shí)， 傳統(tǒng)的方法一般使用DAB(3,3’_二氨基聯(lián)苯胺)作為辣根過氧化物酶(HRP)的顯色底物，在顯色反應(yīng)中產(chǎn)生棕色沉淀。DAB具有一定的致癌性，而且DAB作為HRP的底物，配成溶液后穩(wěn)定性差，靈敏度也比較低。11?(3,3〃，5,5〃-四甲基聯(lián)苯胺)是一種無致癌特性的試劑，也是 HRP的顯色底物之一，具有高靈敏度的特性，因此被廣泛用于ELISA反應(yīng)(酶聯(lián)免疫反應(yīng))。
[0003]現(xiàn)有市售的酶聯(lián)免疫試劑盒所采用的TMB顯色液大多為雙組份，分A液和B液，使用之前需要先混勻，因此存在以下缺點(diǎn):使用不夠方便、提高了包裝材料的成本、浪費(fèi)資源，且使用中的混合過程容易造成批間質(zhì)量不均一。市售的酶聯(lián)免疫試劑盒也有采用單組份的 TMB顯色液，但是現(xiàn)有的單組份TMB顯色液存在穩(wěn)定性差、保存時(shí)間短、顯色背景高、靈敏度低等問題。而且，TMB與HRP作用后只產(chǎn)生藍(lán)色溶液而不能產(chǎn)生沉淀，因此，傳統(tǒng)的TMB顯色液只能用于ELISA反應(yīng)，而不能用于Western、免疫組化(IHC)或原位雜交等實(shí)驗(yàn)。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]基于此，本發(fā)明提供了一種單組份TMB顯色液，該顯色液可用于Western、免疫組化 (IHC)或原位雜交等實(shí)驗(yàn)。
[0005]具體技術(shù)方案如下:
[0006]一種單組份TMB顯色液，包括以下組分:0.l-2mg/mL TMB、體積分?jǐn)?shù)為0.1-3%的二甲基亞砜、體積分?jǐn)?shù)為1-10 %的甘油、0.01 -0.5mg/ml氧化劑、0.5-1 Omg/mL糖類化合物或其衍生物、0.1 -2.5mo 1 /L緩沖液；
[0007]所述單組份TMB顯色液的pH值為3.0-7.0;所述緩沖液選自檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、檸檬酸-EDTA緩沖液、檸檬酸-乙酸鈉緩沖液或檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液；
[0008]所述糖類化合物或其衍生物選自糖苷或其衍生物、葡聚糖或其衍生物和聚蔗糖或其衍生物中的至少一種。
[0009]在其中一些實(shí)施例中，所述糖類化合物或其衍生物選自葡聚糖或其衍生物。
[0010]在其中一些實(shí)施例中，所述葡聚糖或其衍生物選自DEAE葡聚糖鹽酸鹽或右旋糖酐。
[0011]在其中一些實(shí)施例中，所述緩沖液選自檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。
[0012]在其中一些實(shí)施例中，所述氧化劑選自過氧化氫、過氧化脲和過硼酸鈉中的至少一種。
[0013]在其中一些實(shí)施例中，所述氧化劑選自過氧化脲。
[0014]在其中一些實(shí)施例中，所述單組份TMB顯色液包括以下組分:0.3-0.5mg/mL TMB、體積分?jǐn)?shù)為0.4-0.6 %的二甲基亞砜、體積分?jǐn)?shù)為8-10 %的甘油、0.3-0.4mg/mL氧化劑、 2.5-3.5mg/mL糖類化合物或其衍生物、0.2-0.3mol/L緩沖液;所述單組份TMB顯色液的pH值為3.0-5.0。[〇〇15] 本發(fā)明還提供了上述單組份TMB顯色液的配制方法。[〇〇16]具體技術(shù)方案如下:[〇〇17] 上述單組份TMB顯色液的配制方法，包括以下步驟:
[0018]配制緩沖液，用酸調(diào)節(jié)pH值，再加入甘油，用水定容，得混合溶液A;
[0019]將TMB溶解于二甲基亞砜中，再加入到所述混合溶液A中，得混合溶液B;
[0020]在所述混合溶液B中加入糖類化合物或其衍生物以及氧化劑，充分混勻，即得所述單組份TMB顯色液。
[0021]在其中一些實(shí)施例中，用于調(diào)節(jié)pH值的酸為濃鹽酸。[〇〇22]本發(fā)明的單組份TMB顯色液具有以下有優(yōu)點(diǎn)和有益效果:[〇〇23]本發(fā)明的單組份TMB顯色液，通過在顯色體系中加入糖類化合物或其衍生物作為著附劑，使TMB與HRP顯色反應(yīng)的反應(yīng)產(chǎn)物能夠固定于反應(yīng)膜或者細(xì)胞原位上，形成與DAB— 致的顯色斑點(diǎn)，因此能夠用于Western、免疫組化(IHC)或原位雜交等實(shí)驗(yàn)，解決了傳統(tǒng)的 TMB顯色液不能用于Western、IHC或原位雜交實(shí)驗(yàn)的問題。[〇〇24]本發(fā)明的單組份TMB顯色液，通過糖類化合物或其衍生物與其它各組分(TMB、二甲基亞砜、甘油、氧化劑、緩沖液)以特定濃度互配，可以實(shí)現(xiàn)以混合的單一液體存在，無需分成A液、B液，該單組份TMB顯色液可直接使用，操作更為便利，也可降低包裝成本，減少了 A 液、B液在混勻過程中的實(shí)驗(yàn)誤差和批間質(zhì)量不均一的問題。[〇〇25]本發(fā)明的單組份TMB顯色液，通過糖類化合物或其衍生物與其它各組分(TMB、二甲基亞砜、甘油、氧化劑、緩沖液)以特定濃度互配，使其靈敏度高、穩(wěn)定性好、保存時(shí)間長、靈敏度與穩(wěn)定性均比DAB顯色液強(qiáng)，同時(shí)解決了現(xiàn)有的單組份TMB顯色液的穩(wěn)定性問題。【附圖說明】[〇〇26]圖1為單組分TMB顯色液與DAB顯色液的靈敏度比較結(jié)果示意圖；[〇〇27]圖2為經(jīng)過不同保存條件保存后的單組分TMB顯色液的靈敏度比較結(jié)果示意圖； [〇〇28] 圖3為本發(fā)明的單組份TMB顯色液與傳統(tǒng)單組份TMB顯色液的顯色效果比較示意圖。【具體實(shí)施方式】[〇〇29]以下結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明的單組份TMB顯色液和配制方法作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0030]以下實(shí)施例中所用試劑如無特殊說明均為市售普通試劑。
[0031]實(shí)施例1
[0032]本實(shí)施例的單組份TMB顯色液由以下方法配制得到:[〇〇33] 稱取25g檸檬酸(0 ? 13mol)與29g二水檸檬酸三鈉(0 ? 099mol)，溶于800ml去離子水中，用濃鹽酸調(diào)pH至4.0,加入100ml甘油后再定容到1000ml，即得混合溶液A。[〇〇34] 稱取350mg TMB粉末，溶解于5ml二甲基亞砜中，完全溶解后加入到上述混合溶液A中，得到新的混合液B。[〇〇35]向上述混合液B中加入3g DEAE葡聚糖鹽酸鹽與350mg過氧化脲，充分混勻，即得所述單組分TMB顯色液，避光4°C保存。
[0036] 實(shí)施例2[〇〇37]本實(shí)施例的單組份TMB顯色液由以下方法配制得到:[0〇38] 稱取120g梓檬酸(0.62mol)與150g乙酸鈉(1.83mol)，溶于800ml去離子水中，用濃鹽酸調(diào)pH至6.0，加入100ml甘油后再定容到1000ml，即得混合溶液A。[〇〇39] 稱取300mg TMB粉末，溶解于5ml二甲基亞砜中，完全溶解后加入到上述混合溶液A 中，得到新的混合液B。
[0040]向上述混合液B中加入3.5g右旋糖酐與350mg過氧化脲，充分混勻，即得所述單組分TMB顯色液，避光4°C保存。[〇〇41 ] 實(shí)施例3TMB顯色液與DAB顯色液的靈敏度比較[〇〇42]用abeam公司的HRP標(biāo)記羊抗鼠二抗(貨號(hào)ab6789)做梯度稀釋后，取lul直接在復(fù)印紙上劃線，待完全吸收干燥后，分別浸泡于上述實(shí)施例1所配置的單組分TMB顯色液與DAB 顯色液(廣州捷倍斯生物科技有限公司的產(chǎn)品，貨號(hào)G3433)中，浸泡30分鐘后用自來水沖洗終止顯色。顯色結(jié)果如圖1所示，A為TMB顯色液，B為DAB顯色液。[〇〇43] 從圖1可以看出，本發(fā)明的單組分TMB顯色液對1:4500稀釋度的HRP標(biāo)記羊抗鼠二抗能夠檢出，而DAB顯色液對1:2000稀釋度的HRP標(biāo)記羊抗鼠二抗也無法檢測，表明本發(fā)明的單組分TMB顯色液具有比DAB顯色液更高的靈敏度。[〇〇44] 實(shí)施例4TMB顯色液的穩(wěn)定性[〇〇45]用abeam公司的HRP標(biāo)記羊抗鼠二抗(貨號(hào)ab6789)做梯度稀釋后，取lul直接在復(fù)印紙上劃線，待完全吸收干燥后，分別浸泡于經(jīng)過不同保存條件保存后的單組分TMB顯色液中，浸泡30分鐘后用自來水沖洗終止顯色。其中單組分TMB顯色液按照上述實(shí)施例1的方法配制。結(jié)果如圖2所示，C為新鮮配制的單組分TMB顯色液;D為室溫避光保存1年的單組分TMB 顯色、液。[〇〇46]從圖2中可以看出，室溫避光保存一年的單組分TMB顯色液(C)與新鮮配制的單組分TMB顯色液(D)對HRP標(biāo)記羊抗鼠二抗的檢測靈敏度無明顯差異，表明本發(fā)明的單組分TMB 顯色液穩(wěn)定性優(yōu)越。[〇〇47] 實(shí)例5本發(fā)明的單組份TMB顯色液與傳統(tǒng)單組份TMB顯色液的比較 [〇〇48]用abeam公司的HRP標(biāo)記羊抗鼠二抗(貨號(hào)ab6789)做梯度稀釋后，取lul直接在復(fù)印紙上劃線，待完全吸收干燥后，分別浸泡于上述實(shí)施例1所配置的單分TMB顯色液與傳統(tǒng)單組份TMB顯色液(廣州捷倍斯生物科技有限公司的產(chǎn)品，貨號(hào)G4308)中，浸泡30分鐘后用自來水沖洗終止顯色。顯色結(jié)果如圖3所示，G為實(shí)施例1所配置的TMB顯色液，H為傳統(tǒng)單組份TMB顯色液。[〇〇49] 從圖3中可以看出，傳統(tǒng)的TMB顯色液，用水沖洗終止顯色時(shí)，會(huì)把顯色產(chǎn)物一并沖洗掉，而本發(fā)明的單組份TMB顯色液能夠?qū)@色產(chǎn)物固定在膜上。
[0050]以上所述實(shí)施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實(shí)施例中的各個(gè)技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說明書記載的范圍。
[0051]以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種單組份TMB顯色液，其特征在于，包括以下組分:0.l-2mg/mL TMB、體積分?jǐn)?shù)為 0.1 -3%的二甲基亞砜、體積分?jǐn)?shù)為1-10%的甘油、0.01-0.5mg/ml氧化劑、0.5-1 Omg/mL糖 類化合物或其衍生物、〇.1-2.5mol/L緩沖液；所述單組份TMB顯色液的pH值為3.0-7.0;所述緩沖液選自檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、檸 檬酸-EDTA緩沖液、檸檬酸-乙酸鈉緩沖液或檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液；所述糖類化合物或其衍生物選自糖苷或其衍生物、葡聚糖或其衍生物和聚蔗糖或其衍 生物中的至少一種。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單組份TMB顯色液，其特征在于，所述糖類化合物或其衍生物 選自葡聚糖或其衍生物。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的單組份TMB顯色液，其特征在于，所述葡聚糖或其衍生物選自 DEAE葡聚糖鹽酸鹽或右旋糖酐。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單組份TMB顯色液，其特征在于，所述緩沖液選自檸檬酸-檸檬 酸鈉緩沖液。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單組份TMB顯色液，其特征在于，所述氧化劑選自過氧化氫、過 氧化脲和過硼酸鈉中的至少一種。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的單組份TMB顯色液，其特征在于，所述氧化劑選自過氧化脲。7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的單組份TMB顯色液，其特征在于，包括以下組分:0.3_ 0.5mg/mL TMB、體積分?jǐn)?shù)為0.4-0.6 %的二甲基亞砜、體積分?jǐn)?shù)為8-10 %的甘油、0.3-0.4mg/mL氧化劑、2.5-3.5mg/mL糖類化合物或其衍生物、0.2-0.3mo 1/L緩沖液;所述單組份 TMB顯色液的pH值為3.0-5.0。8.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的單組份TMB顯色液的配制方法，其特征在于，包括以下步 驟:配制緩沖液，用酸調(diào)節(jié)pH值，再加入甘油，用水定容，得混合溶液A;將TMB溶解于二甲基亞砜中，再加入到所述混合溶液A中，得混合溶液B;在所述混合溶液B中加入糖類化合物或其衍生物以及氧化劑，充分混勻，即得所述單組 份TMB顯色液。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的單組份TMB顯色液的配制方法，其特征在于，用于調(diào)節(jié)pH值的 酸為濃鹽酸。
【文檔編號(hào)】G01N33/531GK105974107SQ201610557182
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年7月13日
【發(fā)明人】盧秀勁, 王小芳
【申請人】廣州捷倍斯生物科技有限公司