氨甲苯酸和注射液組合物及其質(zhì)控方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及氨甲苯酸和注射液組合物及其質(zhì)控方法。具體地說(shuō)，一方面，本發(fā)明涉及對(duì)氨甲苯酸原料藥或氨甲苯酸注射液進(jìn)行質(zhì)量控制的方法，該方法包括使用高效液相色譜法對(duì)供試品中的對(duì)甲基苯甲酸和對(duì)羧基氯芐進(jìn)行含量測(cè)定的步驟。在一個(gè)實(shí)例中，還包括使用上述高效液相色譜法測(cè)定供試品中的氨甲苯酸含量的步驟。另一方面，本發(fā)明涉及作為藥用原料藥的氨甲苯酸、以及包含氨甲苯酸和注射用水的注射液，其是使用高效液相色譜法對(duì)供試品中的對(duì)甲基苯甲酸和對(duì)羧基氯芐進(jìn)行含量測(cè)定的方式進(jìn)行質(zhì)量控制的。本發(fā)明方法具有如說(shuō)明書所述優(yōu)異性能。
【專利說(shuō)明】
氨甲苯酸和注射液組合物及其質(zhì)控方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種可用于因原發(fā)性纖維蛋白溶解過(guò)度所引起的出 血，包括急性和慢性、局限性或全身性的高纖溶出血，后者常見于癌腫、白血病、婦產(chǎn)科意 外、嚴(yán)重肝病出血等的原料藥及其注射液藥物組合物，特別是涉及氨甲苯酸原料藥和包含 氨甲苯酸的注射液藥物組合物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及所述氨甲苯酸原料藥和氨甲苯酸注射液 組合物的質(zhì)量控制方法。本發(fā)明方法具有優(yōu)異的性能。
【背景技術(shù)】
[0002] 氨甲苯酸(Aminomethylbenzoic Acid)，為對(duì)氨甲基苯甲酸一水合物，又名抗血纖 溶芳酸、對(duì)羧基芐胺、4-(氨基甲基）苯甲酸、4-氨甲基苯甲酸、對(duì)氨甲基苯甲酸;4-(Amino metmy 1)benzoic acid、4_(Aminomethyl)benzoic acid，CAS號(hào)56-91-7。適用于肺、月干、膜、 前列腺、甲狀腺、腎上腺等手術(shù)時(shí)的異常出血，婦產(chǎn)科和產(chǎn)后出血及肺結(jié)核咯血、痰中帶血、 血尿，前列腺肥大出血、上消化道出血等。氨甲苯酸的分子式為C8H9N02 ? H20,分子量為 169.18,其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：
[0004] 氨甲苯酸為白色或類白色的鱗片狀結(jié)晶或結(jié)晶性粉末;無(wú)臭，味微苦。氨甲苯酸在 沸水中溶解，在水中略溶，在乙醇、氯仿、乙醚或苯中幾乎不溶。
[0005] 氨甲苯酸為氨甲苯酸類抗纖維蛋白溶解藥。具有與6-氨基乙酸、氨甲環(huán)酸相同的 作用機(jī)理。其立體構(gòu)形與賴氨酸相似，能競(jìng)爭(zhēng)性地抑制纖溶酶與纖維蛋白的吸附，保護(hù)纖維 蛋白，使其不被纖溶酶降解，從而達(dá)到止血作用。其抗纖溶活性比6-氨基已酸強(qiáng)4-5倍。氨甲 苯酸為促凝血藥。血循環(huán)中存在各種纖溶酶(原）的天然拮抗物，如抗纖溶酶素等。正常情況 下，血液中抗纖溶物質(zhì)活性比纖溶物質(zhì)活性高很多倍，所以不致發(fā)生纖溶性出血。但這些拮 抗物不能阻滯已吸附在纖維蛋白網(wǎng)上的激活物(如尿激酶等)所激活而形成纖溶酶。纖溶酶 是一種肽鏈內(nèi)切酶，在中性環(huán)境中能裂解纖維蛋白（原）的精氨酸和賴氨酸肽鏈，形成纖維 蛋白降解產(chǎn)物，并引起凝血塊溶解出血。纖溶酶原通過(guò)其分子結(jié)構(gòu)中的賴氨酸結(jié)合部位而 特異性地吸附在纖維蛋白上，賴氨酸則可以競(jìng)爭(zhēng)性地阻抑這種吸附作用，減少纖溶酶原的 吸附率，從而減少纖溶酶原的激活程度，以減少出血。本品的立體構(gòu)型與賴氨酸（1，5_二氨 基己酸)相似，能競(jìng)爭(zhēng)性阻抑纖溶酶原吸附在纖維蛋白網(wǎng)上，從而防止其激活，保護(hù)纖維蛋 白不被纖溶酶降解而達(dá)到止血作用。
[0006] 氨甲苯酸靜注后有效血藥濃度可維持3-5小時(shí)。服藥24小時(shí)，36% ±5%以原形隨 尿排出，靜注則排出63% ±17%，其余為乙?；苌?。氨甲苯酸口服后胃腸道吸收率為 69% 士 2%。體內(nèi)分布濃度依次為腎 >肝>心>脾>肺>血液等。服藥后3小時(shí)血藥濃度即 達(dá)峰值，口服按體重7.5mg/kg，峰值一般為4~5ug/ml?？诜?小時(shí)血藥濃度已降到很低水 平;靜注后有效血藥濃度可維恃3~5小時(shí)。服藥24小時(shí)，36% ± 5 %以原形隨尿排出，靜注則 排出63% ±17%，其余為乙酰化衍生物。
[0007] 氨甲苯酸通過(guò)化學(xué)合成法制得，例如CN102718673A中公開了一種合成制備氨甲苯 酸的工藝，其包括以下兩步：
[0008] (1)對(duì)氰基氯芐的水解反應(yīng):在攪拌下將80毫升濃硫酸滴加到80毫升水中，然后加 入38克對(duì)氰基氯芐，升溫至120度左右，攪拌反應(yīng)2-3小時(shí)，直至原料完全反應(yīng)，補(bǔ)加120毫升 純化水，冷卻降至室溫，再攪拌一小時(shí)后過(guò)濾析出的白色固體，將所得水解產(chǎn)物重新懸浮于 5-6倍量的純化水中打漿1小時(shí)，過(guò)濾，水洗抽干得對(duì)氯甲基苯甲酸粗品，稱濕重48.9克， HPLC檢測(cè)純度約為96%，不需精制，直接投入下一步氨化反應(yīng)；
[0009] (2)對(duì)氯甲基苯甲酸的氨化:在500毫升三頸瓶中依次加入烏洛托品40克和80毫升 純化水，常溫?cái)嚢枋谷芙獬吻澹±鋮s至20度以下加入上步得到的對(duì)氯甲基苯甲酸，攪拌 半小時(shí)，然后開始滴加濃氨水，滴加過(guò)程中控制內(nèi)溫不超過(guò)25度，氨水滴完后撤去水浴，內(nèi) 溫在15-30度攪拌反應(yīng)2-3小時(shí)，薄層監(jiān)測(cè)反應(yīng)原料對(duì)氯甲基苯甲酸完全消失，其中展開條 件為二氯甲烷/甲醇=3/1;然后加入活性炭，攪拌15-30分鐘，過(guò)濾，脫色處理后，40-50度減 壓旋蒸去除絕大部分氨和一小部分水分，蒸至pH值在7-8.5之間，有大量白色晶體析出，靜 止放冷至室溫下，過(guò)濾析出的晶體，母液投入下一批套用；過(guò)濾后稱濕品重量為30克左右， 然后重新用120毫升氨水溶解，減壓蒸氨濃縮，能得到18克左右的氨甲苯酸白色晶體，純度 99 %以上，收率在50-60 %之間。
[0010] 此外，CN 105037186 A(201510338012.X)公開了一種氨甲苯酸的制備方法，其包 括如下步驟：
[0011] 1)對(duì)氰基鹵芐與氨之間進(jìn)行的氨解反應(yīng)：向反應(yīng)容器中加入有機(jī)溶劑和對(duì)氰基鹵 芐，室溫?cái)嚢枋谷芙?，得到?duì)氰基鹵芐溶液；向另一個(gè)反應(yīng)容器中加入烏洛托品和水，室溫 攪拌使溶解，冰鹽浴冷卻，內(nèi)溫降至5°c后加入氨水，然后向其中滴加所述對(duì)氰基鹵芐溶液， 滴加過(guò)程中控制內(nèi)溫不超過(guò)15°C，滴加完畢后于10~80°C攪拌反應(yīng)5~6小時(shí);反應(yīng)完畢后， 冷卻至室溫，靜置分層后分液，氨水層留待下批套用，含有對(duì)氰基芐胺的有機(jī)溶劑層直接投 入下一步酸水解反應(yīng)：
[0012] 2)對(duì)氰基芐胺與酸之間進(jìn)行的酸水解反應(yīng)：向反應(yīng)容器中加入水，攪拌條件下滴 加酸，然后加入步驟1)中制得的含有對(duì)氰基芐胺的有機(jī)溶劑層，加熱至80°C，停止攪拌，靜 置分層后分液，上層的有機(jī)溶劑層返回步驟1)中套用，下層的酸水層加入到另一個(gè)反應(yīng)容 器中，攪拌條件下加熱蒸水，待內(nèi)溫到達(dá)120°C，停止蒸水，保溫回流4h;回流結(jié)束后，冷卻至 90°C，加入水，冷卻至室溫，再攪拌lh，過(guò)濾析出的固體，酸水層留待下批套用，將過(guò)濾所得 固體加入到水中，攪拌lh，中和至中性，冷卻至-5°C，過(guò)濾，水洗抽干，得到氨甲苯酸。
[0013]周雪萍等（周雪萍，等，氨甲苯酸注射液及其有關(guān)物質(zhì)的HPLC法測(cè)定，中國(guó)醫(yī)藥工 業(yè)雜志，2014，45(10): 956;在本發(fā)明中該HPLC法可簡(jiǎn)稱為周雪萍法)在其研究著述中，詳細(xì) 研究了分析氨甲苯酸注射液的有關(guān)物質(zhì)的方法，其中開發(fā)出的HPLC法可以有效地用于檢測(cè) 合成工藝中間體對(duì)氯甲基苯甲酸，即該文獻(xiàn)的圖1中的峰2。該文獻(xiàn)記載的注射液色譜圖（該 文獻(xiàn)圖1之B)顯示在對(duì)氯甲基苯甲酸處并未檢出該工藝雜質(zhì)（相對(duì)保留時(shí)間RRT約1.4);該 文獻(xiàn)記載的原料藥色譜圖（該文獻(xiàn)圖2之B)同樣地顯示在對(duì)氯甲基苯甲酸處并未檢出該工 藝雜質(zhì)；但是，在注射液、原料粗品、原料中均在相對(duì)保留時(shí)間RRT約1.7處，即保留時(shí)間約 27min處，顯示出一個(gè)未知的雜質(zhì)，即圖2中指出的RRT1.7雜質(zhì)?？梢?，原料中存在的該未知 RRT1.7雜質(zhì)在制劑中仍然明顯地存在。
[0014] 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，許多種來(lái)源的氨甲苯酸及其制劑例如注射液中，能夠檢測(cè)到兩種雜質(zhì)， 即對(duì)甲基苯甲酸和對(duì)羧基氯芐，二者有可能是由對(duì)二甲苯經(jīng)氧化、氯化、氨化制備氨甲苯酸 時(shí)的中間體。
[0015] 因此，本領(lǐng)域仍然期待有新的方法來(lái)對(duì)氨甲苯酸原料藥或其制劑例如注射液進(jìn)行 有效的質(zhì)量控制，例如對(duì)其中的兩種雜質(zhì)對(duì)甲基苯甲酸和對(duì)羧基氯芐的量進(jìn)行有效的監(jiān) 控。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016] 本發(fā)明目的在于提供一種新的方法，來(lái)對(duì)氨甲苯酸原料藥或其制劑例如注射液進(jìn) 行有效的質(zhì)量控制，例如對(duì)其中的兩種雜質(zhì)對(duì)甲基苯甲酸和對(duì)羧基氯芐的量進(jìn)行有效的監(jiān) 控。本發(fā)明人已經(jīng)出人意料地發(fā)現(xiàn)，使用本發(fā)明的方法可以有效地監(jiān)控上述兩種雜質(zhì)。本發(fā) 明因此而得以完成。
[0017] 因此，本發(fā)明第一方面提供了一種對(duì)氨甲苯酸原料藥或氨甲苯酸注射液進(jìn)行質(zhì)量 控制的方法，該方法包括使用高效液相色譜法對(duì)供試品中的對(duì)甲基苯甲酸和對(duì)羧基氯芐進(jìn) 行含量測(cè)定的步驟。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實(shí)施方案的方法，其中使用高效液相色譜法對(duì)供試品中 的對(duì)甲基苯甲酸和對(duì)羧基氯芐進(jìn)行含量測(cè)定的步驟包括如下操作：
[0019] (1)中國(guó)藥典2015年版四部第59所第0512節(jié)所載的高效液相色譜法中的規(guī)范進(jìn)行 測(cè)定；
[0020] (2)色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇-乙 腈-水以體積比25:15:60為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm;取系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液測(cè)定，理論板 數(shù)按氨甲苯酸峰計(jì)應(yīng)不低于3000,氨甲苯酸、對(duì)甲基苯甲酸、對(duì)羧基氯芐各自之間的分離度 應(yīng)大于1.5;
[0021] (3)溶液制備：
[0022] 取氨甲苯酸原料藥或氨甲苯酸注射液適量，加流動(dòng)相溶解或者稀釋，制成每lml溶 液中含有氨甲苯酸〇.4mg的溶液，過(guò)濾，作為供試品溶液(即，400μg/ml);
[0023] 精密量取供試品溶液lml置于100ml量瓶中，用流動(dòng)相稀釋刻度，搖勻，制成含氨甲 苯酸濃度為4μg/ml的溶液，作為對(duì)照溶液(即，4μg/ml);
[0024] 精密稱取對(duì)甲基苯甲酸對(duì)照品、對(duì)羧基氯芐對(duì)照品適量，分別用流動(dòng)相溶解并制 成兩種物質(zhì)濃度均為4μg/ml的溶液，作為二種雜質(zhì)的對(duì)照品溶液(即，4μg/ml、4μg/ml);
[0025] 精密稱取氨甲苯酸對(duì)照品、對(duì)甲基苯甲酸對(duì)照品、對(duì)羧基氯芐對(duì)照品各適量，加流 動(dòng)相溶解并稀釋，制成每lml溶液中含有氨甲苯酸0.4mg、對(duì)甲基苯甲酸4邱、對(duì)羧基氯芐4邱 的混合溶液，作為系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液(即，400辟/1111+4辟/1111+4辟/1111) ;
[0026] ⑷測(cè)定：
[0027] 精密量取對(duì)照溶液20yl、對(duì)甲基苯甲酸對(duì)照品溶液20yl、對(duì)羧基氯芐對(duì)照品溶液 2〇yl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，確定各成分的保留時(shí)間，并讀取各成分峰的峰面 積；
[0028]精密量取系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液20iil，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算理論板數(shù) 和各峰之間的分離度；
[0029]精密量取供試品溶液20yl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖至對(duì)羧基氯芐保留時(shí)間 的2倍，讀取供試品溶液色譜圖中主成峰峰面積和各雜質(zhì)的峰面積，當(dāng)檢測(cè)到存在對(duì)甲基苯 甲酸和/或?qū)︳然绕S時(shí)，以對(duì)照溶液色譜圖中主成份峰面積為1.0%，計(jì)算供試品溶液色 譜圖中對(duì)甲基苯甲酸和/或?qū)︳然绕S相對(duì)于氨甲苯酸的百分含量，即得到供試品中的對(duì) 甲基苯甲酸和對(duì)羧基氯芐的含量（g卩，如果對(duì)照溶液主峰面積為100,供試品溶液色譜圖中 雜質(zhì)對(duì)甲基苯甲酸的峰面積為115%，則對(duì)甲基苯甲酸相對(duì)于氨甲苯酸的百分含量，簡(jiǎn)稱對(duì) 甲基苯甲酸含量為1.15%;供試品溶液色譜圖中雜質(zhì)對(duì)羧基氯芐的峰面積為87%，則對(duì)羧 基氯節(jié)含量為0.87%)。
[0030]根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實(shí)施方案的方法，所述色譜柱的規(guī)格是:柱長(zhǎng)15~30cm、 柱內(nèi)徑4.6mm、填料粒徑5wii。根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實(shí)施方案的方法，所述色譜柱的規(guī)格 是:柱長(zhǎng)20~30cm、柱內(nèi)徑4.6mm、填料粒徑5wii。根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實(shí)施方案的方法， 所述色譜柱的規(guī)格是:柱長(zhǎng)25cm、柱內(nèi)徑4.6mm、填料粒徑5wii。
[0031]根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實(shí)施方案的方法，所述流動(dòng)相中還添加1~2w/v%的冰 乙酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述流動(dòng)相中還添加1.5w/v%的冰乙酸。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在流動(dòng)相 中添加1.5w/v%的冰乙酸時(shí)，氨甲苯酸、對(duì)甲基苯甲酸、對(duì)羧基氯芐三者的保留時(shí)間分別約 為5 . Omin、11.3min、12.2min。兩個(gè)雜質(zhì)峰的出峰時(shí)間較晚，這是不利于色譜測(cè)定的。還發(fā) 現(xiàn)，在流動(dòng)相中添加1.5w/v%的冰乙酸時(shí)，在進(jìn)行精密度試驗(yàn)時(shí)，取同一批氨甲苯酸樣品溶 液(濃度為〇. 4mg/mL)，按上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定5次，按氨甲苯酸峰面積計(jì)算，RSD為 通常在0.35~0.38%范圍內(nèi)，顯示氨甲苯酸具有優(yōu)良的精密度;但是，同樣地如果針對(duì)供試 品溶液、各雜質(zhì)對(duì)照品溶液、系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液色譜圖中的各雜質(zhì)峰面積計(jì)算時(shí)，對(duì)甲基 苯甲酸的RSD均在1.82~1.96%范圍內(nèi)，對(duì)羧基氯芐的RSD均在1.48~1.53%范圍內(nèi)，顯示 這兩種雜質(zhì)的精密度不能滿足要求。根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實(shí)施方案的方法，所述流動(dòng) 相中，如果不添加冰乙酸，對(duì)甲基苯甲酸、對(duì)羧基氯芐二者的分離度小于1.0,不能滿足測(cè)定 要求。
[0032]根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實(shí)施方案的方法，所述流動(dòng)相中還添加0.1~lw/v%的 酒石酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述流動(dòng)相中還添加〇. 1~〇. 5w/v%的酒石酸。在一個(gè)實(shí)施方 案中，所述流動(dòng)相中還添加0.25w/v %的酒石酸。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在流動(dòng)相中添加0.25w/v %的 酒石酸時(shí)，氨甲苯酸、對(duì)甲基苯甲酸、對(duì)羧基氯芐三者的保留時(shí)間分別約為4.9min、7.8min、 9. lmin。兩個(gè)雜質(zhì)峰的出峰時(shí)間顯示地提前，這將是有利于色譜測(cè)定的。還發(fā)現(xiàn)，在流動(dòng)相 中添加0.25W/V%的酒石酸時(shí)，在進(jìn)行精密度試驗(yàn)時(shí)，取同一批氨甲苯酸樣品溶液(濃度為 0.4mg/mL)，按上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定5次，按氨甲苯酸峰面積計(jì)算，RSD為通常在0.33 ~0.35%范圍內(nèi)，顯示氨甲苯酸具有優(yōu)良的精密度；另外，針對(duì)供試品溶液、各雜質(zhì)對(duì)照品 溶液、系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液色譜圖中的各雜質(zhì)峰面積計(jì)算時(shí)，對(duì)甲基苯甲酸的RSD均在0.51 ~0.54%范圍內(nèi)，對(duì)羧基氯芐的RSD均在0.43~0.46%范圍內(nèi)，顯示這兩種雜質(zhì)的精密度非 常好，完全能夠滿足測(cè)定要求。在此流動(dòng)相中添加0.25W/V%的酒石酸的色譜方法中，理論 板數(shù)按氨甲苯酸峰計(jì)大于5000,氨甲苯酸、對(duì)甲基苯甲酸、對(duì)羧基氯芐各自之間的分離度均 大于2.0。但是，完全無(wú)法解釋的是，當(dāng)將流動(dòng)相中的0.25w/v%酒石酸改為0.25w/v%枸櫞 酸時(shí)，其測(cè)定結(jié)果卻仍然與1.5%冰乙酸所得結(jié)果基本相同，而遠(yuǎn)不能達(dá)到酒石酸的優(yōu)異效 果。
[0033] 根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實(shí)施方案的方法，其中還包括使用上述高效液相色譜法 測(cè)定供試品中的氨甲苯酸含量的步驟。
[0034] 根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實(shí)施方案的方法，其中使用上述高效液相色譜法測(cè)定供 試品中的氨甲苯酸含量的步驟中，根據(jù)供試品溶液色譜圖中氨甲苯酸峰面積、系統(tǒng)適用性 試驗(yàn)溶液色譜圖中氨甲苯酸峰面積、系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液中氨甲苯酸濃度，按外標(biāo)法以峰 面積計(jì)算供試品中氨甲苯酸的含量。
[0035]進(jìn)一步，本發(fā)明第二方面提供了一種作為藥用原料藥的氨甲苯酸。
[0036] 根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實(shí)施方案的氨甲苯酸，其是使用高效液相色譜法對(duì)供試 品中的對(duì)甲基苯甲酸和對(duì)羧基氯芐進(jìn)行含量測(cè)定的方式進(jìn)行質(zhì)量控制的。
[0037] 根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實(shí)施方案的氨甲苯酸，其中使用高效液相色譜法對(duì)供試 品中的對(duì)甲基苯甲酸和對(duì)羧基氯芐進(jìn)行含量測(cè)定的步驟包括如下操作：
[0038] (1)中國(guó)藥典2015年版四部第59所第0512節(jié)所載的高效液相色譜法中的規(guī)范進(jìn)行 測(cè)定；
[0039] (2)色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇-乙 腈-水以體積比25:15:60為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm;取系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液測(cè)定，理論板 數(shù)按氨甲苯酸峰計(jì)應(yīng)不低于3000,氨甲苯酸、對(duì)甲基苯甲酸、對(duì)羧基氯芐各自之間的分離度 應(yīng)大于1.5;
[0040] (3)溶液制備：
[0041 ]取氨甲苯酸原料藥或氨甲苯酸注射液適量，加流動(dòng)相溶解或者稀釋，制成每lml溶 液中含有氨甲苯酸〇.4mg的溶液，過(guò)濾，作為供試品溶液(即，400μg/ml);
[0042] 精密量取供試品溶液lml置于100ml量瓶中，用流動(dòng)相稀釋刻度，搖勻，制成含氨甲 苯酸濃度為4μg/ml的溶液，作為對(duì)照溶液(即，4μg/ml);
[0043] 精密稱取對(duì)甲基苯甲酸對(duì)照品、對(duì)羧基氯芐對(duì)照品適量，分別用流動(dòng)相溶解并制 成兩種物質(zhì)濃度均為4μg/ml的溶液，作為二種雜質(zhì)的對(duì)照品溶液(即，4μg/ml、4μg/ml);
[0044] 精密稱取氨甲苯酸對(duì)照品、對(duì)甲基苯甲酸對(duì)照品、對(duì)羧基氯芐對(duì)照品各適量，加流 動(dòng)相溶解并稀釋，制成每lml溶液中含有氨甲苯酸0.4mg、對(duì)甲基苯甲酸4邱、對(duì)羧基氯芐4邱 的混合溶液，作為系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液(即，400辟/1111+4辟/1111+4辟/1111) ;
[0045] ⑷測(cè)定：
[0046] 精密量取對(duì)照溶液20yl、對(duì)甲基苯甲酸對(duì)照品溶液20yl、對(duì)羧基氯芐對(duì)照品溶液 2〇yl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，確定各成分的保留時(shí)間，并讀取各成分峰的峰面 積；
[0047]精密量取系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液20yl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算理論板數(shù) 和各峰之間的分離度；
[0048]精密量取供試品溶液20yl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖至對(duì)羧基氯芐保留時(shí)間 的2倍，讀取供試品溶液色譜圖中主成峰峰面積和各雜質(zhì)的峰面積，當(dāng)檢測(cè)到存在對(duì)甲基苯 甲酸和/或?qū)︳然绕S時(shí)，以對(duì)照溶液色譜圖中主成份峰面積為1.0%，計(jì)算供試品溶液色 譜圖中對(duì)甲基苯甲酸和/或?qū)︳然绕S相對(duì)于氨甲苯酸的百分含量，即得到供試品中的對(duì) 甲基苯甲酸和對(duì)羧基氯芐的含量（g卩，如果對(duì)照溶液主峰面積為100,供試品溶液色譜圖中 雜質(zhì)對(duì)甲基苯甲酸的峰面積為115%，則對(duì)甲基苯甲酸相對(duì)于氨甲苯酸的百分含量，簡(jiǎn)稱對(duì) 甲基苯甲酸含量為1.15%;供試品溶液色譜圖中雜質(zhì)對(duì)羧基氯芐的峰面積為87%，則對(duì)羧 基氯節(jié)含量為0.87%)。
[0049] 根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實(shí)施方案的氨甲苯酸，所述色譜柱的規(guī)格是:柱長(zhǎng)15~ 30cm、柱內(nèi)徑4.6mm、填料粒徑5wii。根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實(shí)施方案的氨甲苯酸，所述色 譜柱的規(guī)格是:柱長(zhǎng)20~30cm、柱內(nèi)徑4.6mm、填料粒徑5wii。根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實(shí)施 方案的氨甲苯酸，所述色譜柱的規(guī)格是:柱長(zhǎng)25cm、柱內(nèi)徑4.6mm、填料粒徑5wii。
[0050] 根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實(shí)施方案的氨甲苯酸，所述流動(dòng)相中還添加1~2w/v% 的冰乙酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述流動(dòng)相中還添加1.5w/v %的冰乙酸。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在流 動(dòng)相中添加1.5w/v%的冰乙酸時(shí)，氨甲苯酸、對(duì)甲基苯甲酸、對(duì)羧基氯芐三者的保留時(shí)間分 別約為5.0min、ll .3min、12.2min。兩個(gè)雜質(zhì)峰的出峰時(shí)間較晚，這是不利于色譜測(cè)定的。還 發(fā)現(xiàn)，在流動(dòng)相中添加1.5w/v%的冰乙酸時(shí)，在進(jìn)行精密度試驗(yàn)時(shí)，取同一批氨甲苯酸樣品 溶液(濃度為0.4mg/mL)，按上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定5次，按氨甲苯酸峰面積計(jì)算，RSD 為通常在0.35~0.38%范圍內(nèi)，顯示氨甲苯酸具有優(yōu)良的精密度;但是，同樣地如果針對(duì)供 試品溶液、各雜質(zhì)對(duì)照品溶液、系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液色譜圖中的各雜質(zhì)峰面積計(jì)算時(shí)，對(duì)甲 基苯甲酸的RSD均在1.82~1.96%范圍內(nèi)，對(duì)羧基氯芐的RSD均在1.48~1.53%范圍內(nèi)，顯 示這兩種雜質(zhì)的精密度不能滿足要求。根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實(shí)施方案的方法，所述流 動(dòng)相中，如果不添加冰乙酸，對(duì)甲基苯甲酸、對(duì)羧基氯芐二者的分離度小于1.0,不能滿足測(cè) 定要求。
[0051] 根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實(shí)施方案的氨甲苯酸，所述流動(dòng)相中還添加0.1~lw/ v%的酒石酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述流動(dòng)相中還添加0.1~0.5w/v%的酒石酸。在一個(gè)實(shí) 施方案中，所述流動(dòng)相中還添加〇. 25w/v%的酒石酸。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在流動(dòng)相中添加0.25w/ v%的酒石酸時(shí)，氨甲苯酸、對(duì)甲基苯甲酸、對(duì)羧基氯芐三者的保留時(shí)間分別約為4.9min、 7.8min、9.1min。兩個(gè)雜質(zhì)峰的出峰時(shí)間顯示地提前，這將是有利于色譜測(cè)定的。還發(fā)現(xiàn)，在 流動(dòng)相中添加〇.25w/v%的酒石酸時(shí)，在進(jìn)行精密度試驗(yàn)時(shí)，取同一批氨甲苯酸樣品溶液 (濃度為〇. 4mg/mL)，按上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定5次，按氨甲苯酸峰面積計(jì)算，RSD為通 常在0.33~0.35 %范圍內(nèi)，顯示氨甲苯酸具有優(yōu)良的精密度；另外，針對(duì)供試品溶液、各雜 質(zhì)對(duì)照品溶液、系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液色譜圖中的各雜質(zhì)峰面積計(jì)算時(shí)，對(duì)甲基苯甲酸的RSD 均在0.51~0.54%范圍內(nèi)，對(duì)羧基氯芐的RSD均在0.43~0.46%范圍內(nèi)，顯示這兩種雜質(zhì)的 精密度非常好，完全能夠滿足測(cè)定要求。在此流動(dòng)相中添加0.25W/V%的酒石酸的色譜方法 中，理論板數(shù)按氨甲苯酸峰計(jì)大于5000,氨甲苯酸、對(duì)甲基苯甲酸、對(duì)羧基氯芐各自之間的 分離度均大于2.0。
[0052]根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實(shí)施方案的氨甲苯酸，其中還包括使用上述高效液相色 譜法測(cè)定供試品中的氨甲苯酸含量的步驟。
[0053]根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實(shí)施方案的氨甲苯酸，其中使用上述高效液相色譜法測(cè) 定供試品中的氨甲苯酸含量的步驟中，根據(jù)供試品溶液色譜圖中氨甲苯酸峰面積、系統(tǒng)適 用性試驗(yàn)溶液色譜圖中氨甲苯酸峰面積、系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液中氨甲苯酸濃度，按外標(biāo)法 以峰面積計(jì)算供試品中氨甲苯酸的含量。
[0054]進(jìn)一步，本發(fā)明第三方面提供了一種注射液，其中包括活性成分氨甲苯酸和注射 用水。
[0055] 根據(jù)本發(fā)明第三方面任一實(shí)施方案的注射液，其是使用高效液相色譜法對(duì)供試品 中的對(duì)甲基苯甲酸和對(duì)羧基氯芐進(jìn)行含量測(cè)定的方式進(jìn)行質(zhì)量控制的。
[0056] 根據(jù)本發(fā)明第三方面任一實(shí)施方案的注射液，其中使用高效液相色譜法對(duì)供試品 中的對(duì)甲基苯甲酸和對(duì)羧基氯芐進(jìn)行含量測(cè)定的步驟包括如下操作：
[0057] (1)中國(guó)藥典2015年版四部第59所第0512節(jié)所載的高效液相色譜法中的規(guī)范進(jìn)行 測(cè)定；
[0058] (2)色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇-乙 腈-水以體積比25:15:60為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm;取系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液測(cè)定，理論板 數(shù)按氨甲苯酸峰計(jì)應(yīng)不低于3000,氨甲苯酸、對(duì)甲基苯甲酸、對(duì)羧基氯芐各自之間的分離度 應(yīng)大于1.5;
[0059] (3)溶液制備：
[0060] 取氨甲苯酸原料藥或氨甲苯酸注射液適量，加流動(dòng)相溶解或者稀釋，制成每lml溶 液中含有氨甲苯酸〇.4mg的溶液，過(guò)濾，作為供試品溶液(即，400μg/ml);
[0061] 精密量取供試品溶液lml置于100ml量瓶中，用流動(dòng)相稀釋刻度，搖勻，制成含氨甲 苯酸濃度為4μg/ml的溶液，作為對(duì)照溶液(即，4μg/ml);
[0062] 精密稱取對(duì)甲基苯甲酸對(duì)照品、對(duì)羧基氯芐對(duì)照品適量，分別用流動(dòng)相溶解并制 成兩種物質(zhì)濃度均為4μg/ml的溶液，作為二種雜質(zhì)的對(duì)照品溶液(即，4μg/ml、4μg/ml);
[0063] 精密稱取氨甲苯酸對(duì)照品、對(duì)甲基苯甲酸對(duì)照品、對(duì)羧基氯芐對(duì)照品各適量，加流 動(dòng)相溶解并稀釋，制成每lml溶液中含有氨甲苯酸0.4mg、對(duì)甲基苯甲酸4邱、對(duì)羧基氯芐4邱 的混合溶液，作為系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液(即，400辟/1111+4辟/1111+4辟/1111) ;
[0064] ⑷測(cè)定：
[0065] 精密量取對(duì)照溶液20yl、對(duì)甲基苯甲酸對(duì)照品溶液20yl、對(duì)羧基氯芐對(duì)照品溶液 2〇yl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，確定各成分的保留時(shí)間，并讀取各成分峰的峰面 積；
[0066]精密量取系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液20iil，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算理論板數(shù) 和各峰之間的分離度；
[0067]精密量取供試品溶液20yl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖至對(duì)羧基氯芐保留時(shí)間 的2倍，讀取供試品溶液色譜圖中主成峰峰面積和各雜質(zhì)的峰面積，當(dāng)檢測(cè)到存在對(duì)甲基苯 甲酸和/或?qū)︳然绕S時(shí)，以對(duì)照溶液色譜圖中主成份峰面積為1.0%，計(jì)算供試品溶液色 譜圖中對(duì)甲基苯甲酸和/或?qū)︳然绕S相對(duì)于氨甲苯酸的百分含量，即得到供試品中的對(duì) 甲基苯甲酸和對(duì)羧基氯芐的含量（g卩，如果對(duì)照溶液主峰面積為100,供試品溶液色譜圖中 雜質(zhì)對(duì)甲基苯甲酸的峰面積為115%，則對(duì)甲基苯甲酸相對(duì)于氨甲苯酸的百分含量，簡(jiǎn)稱對(duì) 甲基苯甲酸含量為1.15%;供試品溶液色譜圖中雜質(zhì)對(duì)羧基氯芐的峰面積為87%，則對(duì)羧 基氯節(jié)含量為0.87%)。
[0068]根據(jù)本發(fā)明第三方面任一實(shí)施方案的注射液，所述色譜柱的規(guī)格是：柱長(zhǎng)15~ 30cm、柱內(nèi)徑4.6mm、填料粒徑5wii。根據(jù)本發(fā)明第三方面任一實(shí)施方案的注射液，所述色譜 柱的規(guī)格是:柱長(zhǎng)20~30cm、柱內(nèi)徑4.6mm、填料粒徑5wii。根據(jù)本發(fā)明第三方面任一實(shí)施方 案的注射液，所述色譜柱的規(guī)格是:柱長(zhǎng)25cm、柱內(nèi)徑4.6mm、填料粒徑5wii。
[0069] 根據(jù)本發(fā)明第三方面任一實(shí)施方案的注射液，所述流動(dòng)相中還添加1~2w/v%的 冰乙酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述流動(dòng)相中還添加1.5w/v %的冰乙酸。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在流動(dòng) 相中添加1.5w/v%的冰乙酸時(shí)，氨甲苯酸、對(duì)甲基苯甲酸、對(duì)羧基氯芐三者的保留時(shí)間分別 約為5. Omin、11.3min、12.2min。兩個(gè)雜質(zhì)峰的出峰時(shí)間較晚，這是不利于色譜測(cè)定的。還發(fā) 現(xiàn)，在流動(dòng)相中添加1.5w/v%的冰乙酸時(shí)，在進(jìn)行精密度試驗(yàn)時(shí)，取同一批氨甲苯酸樣品溶 液(濃度為〇. 4mg/mL)，按上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定5次，按氨甲苯酸峰面積計(jì)算，RSD為 通常在0.35~0.38%范圍內(nèi)，顯示氨甲苯酸具有優(yōu)良的精密度;但是，同樣地如果針對(duì)供試 品溶液、各雜質(zhì)對(duì)照品溶液、系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液色譜圖中的各雜質(zhì)峰面積計(jì)算時(shí)，對(duì)甲基 苯甲酸的RSD均在1.82~1.96%范圍內(nèi)，對(duì)羧基氯芐的RSD均在1.48~1.53%范圍內(nèi)，顯示 這兩種雜質(zhì)的精密度不能滿足要求。根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實(shí)施方案的方法，所述流動(dòng) 相中，如果不添加冰乙酸，對(duì)甲基苯甲酸、對(duì)羧基氯芐二者的分離度小于1.0,不能滿足測(cè)定 要求。
[0070] 根據(jù)本發(fā)明第三方面任一實(shí)施方案的注射液，所述流動(dòng)相中還添加0.1~lw/v% 的酒石酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述流動(dòng)相中還添加0.1~0.5W/V%的酒石酸。在一個(gè)實(shí)施 方案中，所述流動(dòng)相中還添加〇. 25W/V%的酒石酸。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在流動(dòng)相中添加0.25w/v% 的酒石酸時(shí)，氨甲苯酸、對(duì)甲基苯甲酸、對(duì)羧基氯芐三者的保留時(shí)間分別約為4.9min、 7.8min、9.1min。兩個(gè)雜質(zhì)峰的出峰時(shí)間顯示地提前，這將是有利于色譜測(cè)定的。還發(fā)現(xiàn)，在 流動(dòng)相中添加〇.25w/v%的酒石酸時(shí)，在進(jìn)行精密度試驗(yàn)時(shí)，取同一批氨甲苯酸樣品溶液 (濃度為〇. 4mg/mL)，按上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定5次，按氨甲苯酸峰面積計(jì)算，RSD為通 常在0.33~0.35 %范圍內(nèi)，顯示氨甲苯酸具有優(yōu)良的精密度；另外，針對(duì)供試品溶液、各雜 質(zhì)對(duì)照品溶液、系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液色譜圖中的各雜質(zhì)峰面積計(jì)算時(shí)，對(duì)甲基苯甲酸的RSD 均在0.51~0.54%范圍內(nèi)，對(duì)羧基氯芐的RSD均在0.43~0.46%范圍內(nèi)，顯示這兩種雜質(zhì)的 精密度非常好，完全能夠滿足測(cè)定要求。在此流動(dòng)相中添加0.25W/V%的酒石酸的色譜方法 中，理論板數(shù)按氨甲苯酸峰計(jì)大于5000,氨甲苯酸、對(duì)甲基苯甲酸、對(duì)羧基氯芐各自之間的 分離度均大于2.0。
[0071] 根據(jù)本發(fā)明第三方面任一實(shí)施方案的注射液，其中還包括使用上述高效液相色譜 法測(cè)定供試品中的氨甲苯酸含量的步驟。
[0072 ]根據(jù)本發(fā)明第三方面任一實(shí)施方案的注射液，其中使用上述高效液相色譜法測(cè)定 供試品中的氨甲苯酸含量的步驟中，根據(jù)供試品溶液色譜圖中氨甲苯酸峰面積、系統(tǒng)適用 性試驗(yàn)溶液色譜圖中氨甲苯酸峰面積、系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液中氨甲苯酸濃度，按外標(biāo)法以 峰面積計(jì)算供試品中氨甲苯酸的含量。
[0073] 在本發(fā)明上述制備方法的步驟中，雖然其描述的具體步驟在某些細(xì)節(jié)上或者語(yǔ)言 描述上與下文【具體實(shí)施方式】部分的制備例中所描述的步驟有所區(qū)別，然而，本領(lǐng)域技術(shù)人 員根據(jù)本發(fā)明全文的詳細(xì)公開完全可以概括出以上所述方法步驟。
[0074] 本發(fā)明的任一方面的任一實(shí)施方案，可以與其它實(shí)施方案進(jìn)行組合，只要它們不 會(huì)出現(xiàn)矛盾。此外，在本發(fā)明任一方面的任一實(shí)施方案中，任一技術(shù)特征可以適用于其它實(shí) 施方案中的該技術(shù)特征，只要它們不會(huì)出現(xiàn)矛盾。
[0075]下面對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。
[0076]本發(fā)明所引述的所有文獻(xiàn)，它們的全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入本文，并且如果這些文 獻(xiàn)所表達(dá)的含義與本發(fā)明不一致時(shí)，以本發(fā)明的表述為準(zhǔn)。此外，本發(fā)明使用的各種術(shù)語(yǔ)和 短語(yǔ)具有本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的一般含義，即便如此，本發(fā)明仍然希望在此對(duì)這些術(shù)語(yǔ)和 短語(yǔ)作更詳盡的說(shuō)明和解釋，提及的術(shù)語(yǔ)和短語(yǔ)如有與公知含義不一致的，以本發(fā)明所表 述的含義為準(zhǔn)。
[0077]根據(jù)本發(fā)明的的氨甲苯酸或其注射液，其中的活性成分是具有下式結(jié)構(gòu)的化合 物：
[0079]氨甲苯酸主要用于因原發(fā)性纖維蛋白溶解過(guò)度所引起的出血，包括急性和慢性、 局限性或全身性的高纖溶出血，后者常見于癌腫、白血病、婦產(chǎn)科意外、嚴(yán)重肝病出血等。通 常而言氨甲苯酸注射液每瓶中的活性成分含量為0.1 g。氨甲苯酸注射液通常通過(guò)靜脈注射 或滴注，一次0.1~0.3g(1支~3支），一日不超過(guò)0.6g(6支）；或遵醫(yī)囑。在使用氨甲苯酸注 射液時(shí)，患者要監(jiān)護(hù)血栓形成并發(fā)癥的可能性。對(duì)于有血栓形成傾向者（如急性心肌梗死） 宜慎用。氨甲苯酸注射液一般不單獨(dú)用于彌散性血管內(nèi)凝血所致的繼發(fā)性纖溶性出血，以 防進(jìn)一步血栓形成，影響臟器功能，特別是急性腎功能衰竭。如有必要，應(yīng)在肝素化的基礎(chǔ) 上才應(yīng)用本品。如與其他凝血因子(如因子IX)等合用，應(yīng)警惕血栓形成。一般認(rèn)為在凝血因 子使用后8小時(shí)再用本品較為妥善。由于氨甲苯酸可導(dǎo)致繼發(fā)腎盂和輸尿管凝血塊阻塞，血 友病或腎盂實(shí)質(zhì)病變發(fā)生大量血尿時(shí)要慎用。宮內(nèi)死胎所致低纖維蛋白原血癥出血，肝素 治療較本品為安全。慢性腎功能不全時(shí)用量酌減，給藥后尿液濃度常較高。治療前列腺手術(shù) 出血時(shí)，用量也應(yīng)減少。使用氨甲苯酸，期間，如出現(xiàn)任何不良事件和/或不良反應(yīng)，請(qǐng)咨詢 醫(yī)生。
[0080] 氨甲苯酸為氨甲苯酸類抗纖維蛋白溶解藥。具有與6-氨基乙酸、氨甲環(huán)酸相同的 作用機(jī)理。其立體構(gòu)形與賴氨酸相似，能競(jìng)爭(zhēng)性地抑制纖溶酶與纖維蛋白的吸附，保護(hù)纖維 蛋白，使其不被纖溶酶降解，從而達(dá)到止血作用。其抗纖溶活性比6-氨基已酸強(qiáng)4-5倍。氨甲 苯酸在臨床上通?？捎糜谝蛟l(fā)性纖維蛋白溶解過(guò)度所引起的出血，包括急性或慢性、局 限性或全身性的高纖溶出血，后者常見于癌癥、白血病、婦產(chǎn)科意外、嚴(yán)重肝病出血等。藥代 動(dòng)力學(xué)方面，氨甲苯酸靜注后有效血藥濃度可維持3-5小時(shí)。服藥24小時(shí)，36% ± 5%以原形 隨尿排出，靜注則排出63% ±17%，其余為乙?；苌?。
【具體實(shí)施方式】
[0081] 通過(guò)下面的實(shí)施例可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的描述，然而，本發(fā)明的范圍并不限 于下述實(shí)施例。本領(lǐng)域的專業(yè)人員能夠理解，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的前提下，可以 對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種變化和修飾。本發(fā)明對(duì)試驗(yàn)中所使用到的材料以及試驗(yàn)方法進(jìn)行一般性 和/或具體的描述。雖然為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的所使用的許多材料和操作方法是本領(lǐng)域公知的， 但是本發(fā)明仍然在此作盡可能詳細(xì)描述。以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，而不是限制本發(fā) 明。
[0082] 在下面的例子中，使用的pH調(diào)節(jié)劑(在本發(fā)明中亦即酸堿調(diào)節(jié)劑），如無(wú)另外說(shuō)明， 是1M氫氧化鈉溶液或者1M鹽酸溶液。下文各種試驗(yàn)是為了舉例的目的，并基于各舉例的可 比較性而作了某些具體描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)已有知識(shí)完全可以從中概括得到本發(fā)明 技術(shù)方案的方法。在下面的試驗(yàn)中，所用到的對(duì)甲基苯甲酸、對(duì)羧基氯芐對(duì)照品，均市售購(gòu) 得，且均符合對(duì)照品要示。在下面配液制備各種組合物中，如未另外說(shuō)明，每批的總配液量 為1000瓶的量，但是列明配方時(shí)，均以每瓶含氨甲苯酸lOOmg的量闡明。
[0083] 一、氨甲苯酸原料藥的實(shí)例部分 [0084]原料藥例1、制備氨甲苯酸原料藥
[0085] (1)對(duì)氰基氯芐的氨解：向500mL四口瓶中加入甲苯（300mL)和對(duì)氰基氯芐（60g， 0.396mol)，室溫?cái)嚢枋谷芙?，得到?duì)氰基氯芐甲苯液，備用；向lOOOmL四口瓶中加入烏洛托 品（30g，0.214mol)和純化水(270mL)，室溫?cái)嚢枋谷芙猓}浴冷卻至5°C后加入28 %氨水 (135g，2.223mo 1)，然后開始向其中滴加對(duì)氰基氯芐甲苯液，滴加過(guò)程中控制內(nèi)溫不超過(guò)15 °C，滴完后撤去冰鹽浴，使內(nèi)溫在15~30°C攪拌反應(yīng)3h，水浴加熱至70~75°C，保溫反應(yīng)3h， 液相色譜分析，對(duì)氰基氯芐反應(yīng)完全;冷卻至室溫，靜置分層，下層的氨水母液下批套用，上 層的甲苯液中含有對(duì)氰基芐胺，備用。氨水母液的套用方法：向上述氨水母液中通入液氨， 直至氨的質(zhì)量濃度為9~10%，加入烏洛托品（30g)，冷卻至5°C，滴加對(duì)氰基氯芐(60g)和甲 苯(300mL)，可選用上批回收液），操作同前，反應(yīng)正常。再套用一次后，蒸出氨水回收，余液 蒸餾回收氯化銨。
[0086] (2)對(duì)氰基芐胺的酸水解：向1000mL四口瓶中加入水（240mL)，攪拌下滴加硫酸 (120g)，然后加入步驟1中制得的對(duì)氰基芐胺甲苯液，加熱至80°C，停止攪拌，靜置分層，上 層的甲苯層返回步驟1中套用，下層的硫酸層加入500mL四□瓶中，攪拌條件下加熱蒸水，待 內(nèi)溫到達(dá)120°C，停止蒸水，保溫回流4h;直至原料完全反應(yīng)，冷卻至90°C，加入純化水 (120mL)，冷卻至室溫，再攪拌lh，過(guò)濾析出的固體，硫酸母液下批套用；將所得的氨甲苯酸 硫酸鹽固體加入到水(240mL)中，攪拌lh，滴加氨水中和至中性，冷卻至-5 °C，過(guò)濾，水洗抽 干，得氨甲苯酸粗品，稱濕重85.1克，HPLC檢測(cè)純度約為99.6% ;用2.5%氨水(550g)溶解， 加入活性炭(3g)，攪拌，加熱至75 °C，保溫反應(yīng)2h，趁熱過(guò)濾，濾液減壓濃縮至200g左右后冷 卻至0°C，過(guò)濾，烘干，得到49g固體氨甲苯酸，HPLC檢測(cè)純度約為99.92% ;濾液下批套用，三 次后蒸水回收氨甲苯酸。
[0087]原料藥例2、制備氨甲苯酸原料藥
[0088] (1)對(duì)氰基氯芐的水解反應(yīng):在攪拌下將80毫升濃硫酸滴加到80毫升水中，然后加 入38克對(duì)氰基氯芐，升溫至120度左右，攪拌反應(yīng)2-3小時(shí)，直至原料完全反應(yīng)，補(bǔ)加120毫升 純化水，冷卻降至室溫，再攪拌一小時(shí)后過(guò)濾析出的白色固體，將所得水解產(chǎn)物重新懸浮于 5-6倍量的純化水中打漿1小時(shí)，過(guò)濾，水洗抽干得對(duì)氯甲基苯甲酸粗品，稱濕重48.4克， HPLC檢測(cè)純度約為96%，不需精制，直接投入下一步氨化反應(yīng)。
[0089] (2)對(duì)氯甲基苯甲酸的氨化:在500毫升三頸瓶中依次加入烏洛托品40克和80毫升 純化水，常溫?cái)嚢枋谷芙獬吻?，水浴冷卻至20度以下加入上步得到的對(duì)氯甲基苯甲酸，攪拌 半小時(shí)，然后開始滴加濃氨水，滴加過(guò)程中控制內(nèi)溫不超過(guò)25度，氨水滴完后撤去水浴，內(nèi) 溫在15-30度左右攪拌反應(yīng)2-3小時(shí)，薄層監(jiān)測(cè)反應(yīng)原料對(duì)氯甲基苯甲酸完全消失，（展開條 件:二氯甲烷/甲醇= 3/1)，然后加入活性炭，攪拌15-30分鐘，過(guò)濾。脫色處理后，40-50度減 壓旋蒸去除絕大部分氨和一小部分水分，蒸至pH值在7-8.5之間，有大量白色晶體析出，靜 止放冷至室溫下，過(guò)濾析出的晶體，母液投入下一批套用；過(guò)濾后稱濕品重量約為30克左 右，然后重新用120毫升氨水溶解，減壓蒸氨濃縮，約能得到18克左右的氨甲苯酸白色晶體， 純度99 %以上，收率約在50-60 %之間。
[0090]原料藥例3、市售購(gòu)得，產(chǎn)自江蘇常州某公司。
[0091 ]原料藥例4、市售購(gòu)得，產(chǎn)自江蘇揚(yáng)州某公司。
[0092] 原料藥例5、市售購(gòu)得，產(chǎn)自山西某公司。
[0093] 原料藥例6、來(lái)自湖南洞庭藥業(yè)股份有限公司。
[0094] 二、氨甲苯酸注射液的實(shí)例部分
[0095]注射液例1、制備氨甲苯酸注射液
[0096]在濃配罐中加入配制量50%的新煮沸的注射用水，加入氨甲苯酸，攪拌溶解；
[0097]加入藥用炭(0.1%)，攪拌均勻；用蘇州砂棒回濾脫炭至澄明后，濾入稀配罐中； [0098] 加入注射用水至全量(10ml: 100mg)，攪拌15分鐘，使其均勻；
[0099] 用蘇州砂棒、0.33M1聚醚砜折疊式濾器回濾；
[0100] 取樣做可見異物檢查，同時(shí)取樣送檢測(cè)中心測(cè)中間體含量和PH值(pH6.5，必要時(shí) 調(diào)節(jié)pH值至該值），各項(xiàng)均合格后，將藥液濾入貯液罐；
[0101] 貯液罐中的藥液經(jīng)0.41M1聚醚砜折疊式濾器過(guò)濾，取樣做可見異物檢查合格后， 輸入座瓶供灌封;座瓶中通入氮?dú)膺M(jìn)行灌封；
[0102] 在溫度為121°C、時(shí)間為15分鐘的條件下進(jìn)行殺菌。
[0103] 本實(shí)例使用原料藥例1所得原料藥進(jìn)行試驗(yàn)。
[0104] 注射液例2、制備氨甲苯酸注射液
[0105] 照注射液例1的方法進(jìn)行，不同的僅是將其中的氨甲苯酸原料改用原料藥例2~6 的原料藥投料，得到5批注射液。
[0106] 注射液例3、市售購(gòu)得，產(chǎn)自長(zhǎng)春某藥廠。
[0107] 注射液例4、市售購(gòu)得，產(chǎn)自常州某藥廠。
[0108] 注射液例5、市售購(gòu)得，產(chǎn)自徐州某藥廠。
[0109] 注射液例6、湖南洞庭藥業(yè)股份有限公司市售品。
[0110] 三、氨甲苯酸原料或其注射液的質(zhì)量控制方法
[0111] 方法例1:使用高效液相色譜法對(duì)供試品中的對(duì)甲基苯甲酸和對(duì)羧基氯芐進(jìn)行含 量測(cè)定
[0112] 操作步驟如下：
[0113] (1)中國(guó)藥典2015年版四部第59所第0512節(jié)所載的高效液相色譜法中的規(guī)范進(jìn)行 測(cè)定；
[0114] (2)色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(柱規(guī)格:柱 長(zhǎng)25cm、柱內(nèi)徑4.6mm、填料粒徑5mi)，以甲醇-乙腈-水以體積比25:15:60為流動(dòng)相，檢測(cè)波 長(zhǎng)為230nm;取系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液測(cè)定，理論板數(shù)按氨甲苯酸峰計(jì)應(yīng)不低于3000,氨甲苯 酸、對(duì)甲基苯甲酸、對(duì)羧基氯芐各自之間的分離度應(yīng)大于1.5;
[0115] (3)溶液制備：
[0116] 取氨甲苯酸原料藥或氨甲苯酸注射液適量，加流動(dòng)相溶解或者稀釋，制成每lml溶 液中含有氨甲苯酸〇.4mg的溶液，過(guò)濾，作為供試品溶液(即，400μg/ml);
[0117] 精密量取供試品溶液lml置于100ml量瓶中，用流動(dòng)相稀釋刻度，搖勻，制成含氨甲 苯酸濃度為4μg/ml的溶液，作為對(duì)照溶液(即，4μg/ml);
[0118] 精密稱取對(duì)甲基苯甲酸對(duì)照品、對(duì)羧基氯芐對(duì)照品適量，分別用流動(dòng)相溶解并制 成兩種物質(zhì)濃度均為4μg/ml的溶液，作為二種雜質(zhì)的對(duì)照品溶液(即，4μg/ml、4μg/ml);
[0119] 精密稱取氨甲苯酸對(duì)照品、對(duì)甲基苯甲酸對(duì)照品、對(duì)羧基氯芐對(duì)照品各適量，加流 動(dòng)相溶解并稀釋，制成每lml溶液中含有氨甲苯酸0.4mg、對(duì)甲基苯甲酸4邱、對(duì)羧基氯芐4邱 的混合溶液，作為系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液(即，400辟/1111+4辟/1111+4辟/1111) ;
[0120] (4)測(cè)定：
[0121] 精密量取對(duì)照溶液20yl、對(duì)甲基苯甲酸對(duì)照品溶液20yl、對(duì)羧基氯芐對(duì)照品溶液 2〇yl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，確定各成分的保留時(shí)間，并讀取各成分峰的峰面 積；
[0122] 精密量取系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液20iU，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算理論板數(shù) 和各峰之間的分離度；
[0123] 精密量取供試品溶液20iU，注入液相色譜儀，記錄色譜圖至對(duì)羧基氯芐保留時(shí)間 的2倍，讀取供試品溶液色譜圖中主成峰峰面積和各雜質(zhì)的峰面積，當(dāng)檢測(cè)到存在對(duì)甲基苯 甲酸和/或?qū)︳然绕S時(shí)，以對(duì)照溶液色譜圖中主成份峰面積為1.0%，計(jì)算供試品溶液色 譜圖中對(duì)甲基苯甲酸和/或?qū)︳然绕S相對(duì)于氨甲苯酸的百分含量，即得到供試品中的對(duì) 甲基苯甲酸和對(duì)羧基氯芐的含量（g卩，如果對(duì)照溶液主峰面積為100,供試品溶液色譜圖中 雜質(zhì)對(duì)甲基苯甲酸的峰面積為115%，則對(duì)甲基苯甲酸相對(duì)于氨甲苯酸的百分含量，簡(jiǎn)稱對(duì) 甲基苯甲酸含量為1.15%;供試品溶液色譜圖中雜質(zhì)對(duì)羧基氯芐的峰面積為87%，則對(duì)羧 基氯節(jié)含量為0.87%)。
[0124] 照以上方法例1測(cè)定原料藥例1~6的氨甲苯酸和注射液例1~6的氨甲苯酸注射 液，令人遺憾的是，各樣品中對(duì)甲基苯甲酸、對(duì)羧基氯芐二者的分離度均在0.86~0.90范圍 內(nèi)，不能令人滿意。
[0125] 方法例2:使用高效液相色譜法對(duì)供試品中的對(duì)甲基苯甲酸和對(duì)羧基氯芐進(jìn)行含 量測(cè)定
[0126] 參照方法例1，不同的僅是在三元系流動(dòng)相中還添加1.5w/v %的冰乙酸。測(cè)定原料 藥例1~6的氨甲苯酸和注射液例1~6的氨甲苯酸注射液。
[0127] 結(jié)果顯示：
[0128] 各樣品中氨甲苯酸、對(duì)甲基苯甲酸、對(duì)羧基氯芐三者的保留時(shí)間分別平均大約為 5.0min、ll .3min、12.2min，兩個(gè)雜質(zhì)峰之間的分離度在1.5~1.7范圍內(nèi)，勉強(qiáng)能夠接受;但 是出峰時(shí)間較晚，這是不利于色譜測(cè)定的；
[0129] 在進(jìn)行精密度試驗(yàn)時(shí)，取同一批氨甲苯酸樣品溶液(濃度為0.4mg/mL)，按上述色 譜條件，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定5次，按氨甲苯酸峰面積計(jì)算，RSD為通常在0.35~0.38%范圍內(nèi)，顯 示氨甲苯酸具有優(yōu)良的精密度;但是，同樣地如果針對(duì)供試品溶液、各雜質(zhì)對(duì)照品溶液、系 統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液色譜圖中的各雜質(zhì)峰面積計(jì)算時(shí)，對(duì)甲基苯甲酸的RSD均在1.82~ 1.96%范圍內(nèi)，對(duì)羧基氯芐的RSD均在1.48~1.53%范圍內(nèi)，顯示這兩種雜質(zhì)的精密度不能 滿足要求。
[0130] 根據(jù)以上結(jié)果可知，當(dāng)在注射液中添加少量冰乙酸時(shí)，盡管兩個(gè)雜質(zhì)之間的分離 度勉強(qiáng)能夠接受，但是它們的精密度差。
[0131 ]方法例3:使用高效液相色譜法對(duì)供試品中的對(duì)甲基苯甲酸和對(duì)羧基氯芐進(jìn)行含 量測(cè)定
[0132] 參照方法例1，不同的僅是在三元系流動(dòng)相中還添加0.25w/v %的酒石酸。測(cè)定原 料藥例1~6的氨甲苯酸和注射液例1~6的氨甲苯酸注射液。
[0133] 結(jié)果顯示：氨甲苯酸、對(duì)甲基苯甲酸、對(duì)羧基氯芐三者的保留時(shí)間分別約為 4.9min、7.8min、9. lmin，兩個(gè)雜質(zhì)峰的出峰時(shí)間顯示地提前;各原料藥或注射液測(cè)定的氨 甲苯酸峰精密度RSD在0.33~0.35%范圍內(nèi)、對(duì)甲基苯甲酸精密度RSD均在0.51~0.54%范 圍內(nèi)，對(duì)羧基氯芐精密度RSD均在0.43~0.46%范圍內(nèi)，表明這兩種雜質(zhì)的精密度非常好， 完全能夠滿足測(cè)定要求;在此添加0.25W/V%酒石酸的色譜方法中測(cè)定，理論板數(shù)按氨甲苯 酸峰計(jì)大于5000,氨甲苯酸、對(duì)甲基苯甲酸、對(duì)羧基氯芐各自之間的分離度均大于2.0。但 是，在補(bǔ)充試驗(yàn)中，當(dāng)將流動(dòng)相中的〇. 25w/v%酒石酸改為0.25w/v%枸橡酸時(shí)，其測(cè)定結(jié)果 卻仍然與方法例2中的使用1.5%冰乙酸所得結(jié)果基本相同，而遠(yuǎn)不能達(dá)到酒石酸的優(yōu)異效 果，這是完全無(wú)法解釋的。在補(bǔ)充試驗(yàn)中，將色譜柱的柱長(zhǎng)改為20cm或30cm，柱內(nèi)徑4.6mm、 填料粒徑5mi，其余方法條件與方法例3相同，結(jié)果顯示各項(xiàng)指標(biāo)與方法例3基本相同。
[0134] 方法例4:使用高效液相色譜法對(duì)供試品中的對(duì)甲基苯甲酸和對(duì)羧基氯芐進(jìn)行含 量測(cè)定
[0135] 參照方法例1，不同的僅是在三元系流動(dòng)相中還添加0. lw/v%的酒石酸。測(cè)定原料 藥例1~6的氨甲苯酸和注射液例1~6的氨甲苯酸注射液。結(jié)果與方法例3的基本上相同，各 成分之間分離度好，精密度高。
[0136] 方法例5:使用高效液相色譜法對(duì)供試品中的對(duì)甲基苯甲酸和對(duì)羧基氯芐進(jìn)行含 量測(cè)定
[0137] 參照方法例1，不同的僅是在三元系流動(dòng)相中還添加0.5w/v %的酒石酸。測(cè)定原料 藥例1~6的氨甲苯酸和注射液例1~6的氨甲苯酸注射液。結(jié)果與方法例3的基本上相同，各 成分之間分離度好，精密度高。
[0138] 方法例6:使用高效液相色譜法測(cè)定供試品中的氨甲苯酸含量
[0139] 在上述方法例3、4、5中，測(cè)定原料藥例1~6的氨甲苯酸和注射液例1~6的氨甲苯 酸注射液供試品中的氨甲苯酸含量。對(duì)于每一批供試品，根據(jù)供試品溶液色譜圖中氨甲苯 酸峰面積、系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液色譜圖中氨甲苯酸峰面積、系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液中氨甲苯 酸濃度，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算供試品中氨甲苯酸的含量。結(jié)果顯示:使用全部的方法測(cè)定 全部原料藥中氨甲苯酸含量均在99.0~101.0%范圍內(nèi)；使用全部的方法測(cè)定全部注射液 中氨甲苯酸含量均在標(biāo)示量（即理論基礎(chǔ)配液投料量）的98.0~103.0%范圍內(nèi)。顯示出優(yōu) 良的方法學(xué)性能。
[0140] 產(chǎn)業(yè)適用性
[0141] 以上所述，僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，不能解釋為以此限定本發(fā)明的范圍，凡在本 發(fā)明的權(quán)利要求書要求保護(hù)的范圍內(nèi)所做出的等同的變形和改變的實(shí)施方式均在本發(fā)明 所要求保護(hù)的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 對(duì)氨甲苯酸原料藥或氨甲苯酸注射液進(jìn)行質(zhì)量控制的方法，該方法包括使用高效液 相色譜法對(duì)供試品中的對(duì)甲基苯甲酸和對(duì)羧基氯芐進(jìn)行含量測(cè)定的步驟。2. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中使用高效液相色譜法對(duì)供試品中的對(duì)甲基苯甲酸和對(duì) 羧基氯芐進(jìn)行含量測(cè)定的步驟包括如下操作： (1) 中國(guó)藥典2015年版四部第59所第0512節(jié)所載的高效液相色譜法中的規(guī)范進(jìn)行測(cè) 定； (2) 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇-乙腈-水 以體積比25:15:60為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm;取系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液測(cè)定，理論板數(shù)按 氨甲苯酸峰計(jì)應(yīng)不低于3000,氨甲苯酸、對(duì)甲基苯甲酸、對(duì)羧基氯芐各自之間的分離度應(yīng)大 于 1.5; (3) 溶液制備： 取氨甲苯酸原料藥或氨甲苯酸注射液適量，加流動(dòng)相溶解或者稀釋，制成每1ml溶液中 含有氨甲苯酸〇. 4mg的溶液，過(guò)濾，作為供試品溶液； 精密量取供試品溶液Iml置于100mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋刻度，搖勻，制成含氨甲苯酸 濃度為4μg/ml的溶液，作為對(duì)照溶液； 精密稱取對(duì)甲基苯甲酸對(duì)照品、對(duì)羧基氯芐對(duì)照品適量，分別用流動(dòng)相溶解并制成兩 種物質(zhì)濃度均為4μg/ml的溶液，作為二種雜質(zhì)的對(duì)照品溶液； 精密稱取氨甲苯酸對(duì)照品、對(duì)甲基苯甲酸對(duì)照品、對(duì)羧基氯芐對(duì)照品各適量，加流動(dòng)相 溶解并稀釋，制成每1ml溶液中含有氨甲苯酸0.4mg、對(duì)甲基苯甲酸4yg、對(duì)羧基氯芐4yg的混 合溶液，作為系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液； ⑷測(cè)定： 精密量取對(duì)照溶液20μ1、對(duì)甲基苯甲酸對(duì)照品溶液20μ1、對(duì)羧基氯芐對(duì)照品溶液20μ1， 分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，確定各成分的保留時(shí)間，并讀取各成分峰的峰面積； 精密量取系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液20μ1，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算理論板數(shù)和各 峰之間的分離度； 精密量取供試品溶液20μ1，注入液相色譜儀，記錄色譜圖至對(duì)羧基氯芐保留時(shí)間的2 倍，讀取供試品溶液色譜圖中主成峰峰面積和各雜質(zhì)的峰面積，當(dāng)檢測(cè)到存在對(duì)甲基苯甲 酸和/或?qū)︳然绕S時(shí)，以對(duì)照溶液色譜圖中主成份峰面積為1.0%，計(jì)算供試品溶液色譜 圖中對(duì)甲基苯甲酸和/或?qū)︳然绕S相對(duì)于氨甲苯酸的百分含量，即得到供試品中的對(duì)甲 基苯甲酸和對(duì)羧基氯芐的含量。3. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，所述色譜柱的規(guī)格是:柱長(zhǎng)20~30cm、柱內(nèi)徑4.6mm、填料粒 徑 5μηι〇4. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，所述色譜柱的規(guī)格是:柱長(zhǎng)25cm、柱內(nèi)徑4.6mm、填料粒徑5μ m〇5. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，所述流動(dòng)相中還添加1~2w/v %或者1.5w/v %的冰乙酸。6. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，所述流動(dòng)相中還添加0.1~0.5w/v %或者0.25w/v %的酒石 酸。7. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中還包括使用上述高效液相色譜法測(cè)定供試品中的氨甲 苯酸含量的步驟。8. 根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中使用所述高效液相色譜法測(cè)定供試品中的氨甲苯酸含 量的步驟中，根據(jù)供試品溶液色譜圖中氨甲苯酸峰面積、系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液色譜圖中氨 甲苯酸峰面積、系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液中氨甲苯酸濃度，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算供試品中氨 甲苯酸的含量。9. 作為藥用原料藥的氨甲苯酸，其是使用高效液相色譜法對(duì)供試品中的對(duì)甲基苯甲酸 和對(duì)羧基氯芐進(jìn)行含量測(cè)定的方式進(jìn)行質(zhì)量控制的。10. -種注射液，其中包括活性成分氨甲苯酸和注射用水，其是使用高效液相色譜法對(duì) 供試品中的對(duì)甲基苯甲酸和對(duì)羧基氯芐進(jìn)行含量測(cè)定的方式進(jìn)行質(zhì)量控制的。
【文檔編號(hào)】A61K31/195GK105929098SQ201610502957
【公開日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年6月30日
【發(fā)明人】侯奇?zhèn)? 朱姣, 劉勇
【申請(qǐng)人】湖南洞庭藥業(yè)股份有限公司