一種蜂蜜基質中氯霉素的快速篩查方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種蜂蜜基質中氯霉素的快速篩查方法，包括：稱取待測蜂蜜樣品，加入去離子水，經(jīng)加熱水浴后渦旋至蜂蜜完全溶解；添加乙酸乙酯后震蕩提取并離心操作，移取上層清液至離心管；重復用水反萃一次，得到樣品上清液；將所述樣品上清液水浴后，氮氣吹干，用乙腈復溶，得到待測樣品溶液；使用移液器定量滴加所述待測樣品溶液在Dip?it管上；采用實時直接分析質譜離子源DART?MS/MS對所述待測樣品溶液進行檢測。本發(fā)明實施例的方案，能夠實現(xiàn)快速準確的對蜂蜜基質中氯霉素的篩查檢測。
【專利說明】
一種蜂蜜基質中氯霉素的快速篩查方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及食品中抗生素篩查技術領域，特別涉及一種蜂蜜基質中氯霉素的快速 篩查方法。
【背景技術】
[0002] 蜂業(yè)養(yǎng)殖過程中，蜜蜂經(jīng)?；几舨　⒙菰w病等細菌性疾病，這些疾病會對養(yǎng)蜂 生產(chǎn)和蜂產(chǎn)品安全構成嚴重威脅。為了防治蜜蜂疾病，各種抗生素類藥物被蜂農(nóng)頻繁使用， 甚至會在效果不佳時加大劑量，因此導致了蜂蜜中抗生素殘留。2002年歐盟等國家禁運我 國蜂蜜事件后，歐盟理事會通過《關于對產(chǎn)自中國的進口動物產(chǎn)品實行某些保護性措施的 決議》（2002/69/EC)，將氯霉素殘留限量改為0.1yg/kg。在2005年歐盟解禁中國蜂蜜后，但 從中國進口的動物源食品的保護措施2005/573/EC決議中指出，中國出口的蜂蜜必須附加 氯霉素和硝基呋喃及其代謝物等殘留檢驗報告（2005/573/EC)。2009年12月歐盟委員會條 例(EU)No.37/2010中指出蜂蜜中氯霉素、硝基呋喃等為禁用藥理活性物質，其他抗生素為 非法使用藥物。
[0003] 蜂蜜中抗生素檢測技術目前主要包括以下幾種：
[0004] 微生物法，是用于測定抗生素效價的生物學定量方法之一。我國也建立了杯碟法 檢測蜂蜜中紅霉素和青霉素的國家標準。原理簡單、操作便捷是微生物學測定法的最大優(yōu) 勢，但檢測靈敏度過低是其最大缺陷。
[0005] 酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)，是一種讓抗體與酶結合物結合，然后通過顯色來檢測的 方法。這種方法簡單易行，具有特異性強、靈敏度高等優(yōu)點，已經(jīng)越來越多的應用于蜂蜜中 抗生素殘留的檢測，我國也有酶聯(lián)免疫法檢測蜂蜜中氯霉素和四環(huán)素的國家標準。但是，免 疫測定法提供的待測物組成或結構方面的信息太少，一般不具備多殘留分析能力；分析過 程影響因素眾多且不易控制，結果易出現(xiàn)假陽性，方法難以標準化;方法建立過程復雜，研 究周期長，某些待測物的半抗原難以合成。
[0006] 液相色譜法，可以將復雜組分分離后，逐一進行檢測。液相色譜法具有高效、快速、 靈敏的特點，幾乎可以測定包括高極性/離子型和大分子物質在內(nèi)的所有化合物，但在處理 復雜樣品時可能因預處理手段無法去除所有干擾，導致雜質無法與待測物分離，從而引起 假陽性檢出。
[0007]色質聯(lián)用一般是指液相色譜或氣相色譜-質譜聯(lián)用技術，在蜂蜜中抗生素殘留檢 測領域得到了廣泛的應用。氣相色譜-質譜檢測法(GC-MS)以主要用于熱穩(wěn)定、易揮發(fā)的化 合物的檢測，也有報道將其應用于檢測蜂蜜中氯霉素。然而抗生素絕大部分是熱不穩(wěn)定、難 氣化化合物，在使用GC-MS檢測時一般需要將其進行衍生化處理，不同抗生素的官能團不 同，衍生化過程十分繁瑣且易引入分析誤差。液相色譜-質譜檢測法(LC-MS)是目前對于蜂 蜜中抗生素殘留檢測最常用方法，但是對樣品預處理的要求較高，樣品預處理繁瑣，分析時 間較長。
[0008]現(xiàn)有技術中，對于蜂蜜基質中抗生素的檢測方法存在著各種問題，復雜不易操作， 以及檢測結果不穩(wěn)定等。亟需要一種快速簡便有效的蜂蜜基質中抗生素殘留的快速篩查方 法，以滿足業(yè)界對于抗生素殘留檢測的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明提供一種蜂蜜基質中氯霉素的快速篩查方法，用以解決現(xiàn)有技術中蜂蜜基 質中抗生素殘留無法快速有效檢測篩查的問題。
[0010] 本發(fā)明提供一種蜂蜜基質中氯霉素的快速篩查方法，包括：
[0011] 稱取5g蜂蜜樣品于50mL-次性離心管，加入5mL去離子水，經(jīng)60°C水浴后渦旋至蜂 蜜完全溶解；
[0012] 添加15mL乙酸乙酯后振蕩提取lOmin，以3000rpm的速率離心5min，移取上層清液 至15mL離心管；
[00?3] 在上清液中加入5mL去離子水，振蕩lOmin，3000rpm離心5min，取上清液；
[0014]重復用水反萃一次，取上清液10mL;
[0015] 45 °C水浴，氮氣吹干上清液后用2mL乙腈復溶。
[0016] 使用移液器定量滴加5μΙ^?述待測樣品溶液在Dip-it管上(DIP-5yL)。
[0017]設置實時直接分析質譜離子源DART-MS/MS參數(shù):負離子采集，多反應監(jiān)測(MRM)模 式，載氣為氦氣，載氣溫度550°C，樣品傳輸速度0.6mm/s。
[0018] 本發(fā)明實施例的方案與目前文獻和國標方法比，其特點在于：
[0019] 本方法采取乙酸乙酯有機溶劑簡單提取后，用水反萃有效去除蜂蜜基體中大量的 單糖類干擾物，顯著降低了質譜檢測的基質效應，提高了方法的靈敏度;使用移液器定量滴 加所述待測樣品溶液在Dip-it管上，改善了 Dip-it進樣方式的精密度，使得檢測方法可以 作為定量方法使用；與傳統(tǒng)的LC/MS/MS測試方法相比，樣品的測試效率從每24個樣品48h提 尚到每24個樣品不足4h。
[0020] 本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將在隨后的說明書中闡述，并且，部分地從說明書中變 得顯而易見，或者通過實施本發(fā)明而了解。本發(fā)明的目的和其他優(yōu)點可通過在所寫的說明 書、權利要求書、以及附圖中所特別指出的結構來實現(xiàn)和獲得。
[0021] 下面通過附圖和實施例，對本發(fā)明的技術方案做進一步的詳細描述。
【附圖說明】
[0022]附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與本發(fā)明的實 施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構成對本發(fā)明的限制。在附圖中：
[0023]圖1為Dip-it與Mesh兩種進樣模塊下氯霉素提取離子流圖；
[0024]圖2為簡單提取與用水反萃三種蜂蜜中氯霉素 (0.2yg/kg)提取離子圖。
【具體實施方式】
[0025] 以下結合附圖對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行說明，應當理解，此處所描述的優(yōu)選實 施例僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0026] 實時直接分析(Direct Analysis in Real Time)簡稱DART，是一種熱解析和離子 化技術。DART操作簡單，樣品置放于DART源和質譜儀的離子采樣口直接，便可進行分析。
[0027] 本實施例所采用的儀器：
[0028] DART實時直接分析離子源，Qtrap 5500質譜；LC-30AD XR液相色譜、ME614S天平； CF16RX| |離心機;Vortex-Genie 2型渦旋混合器、MCX固相萃取柱
[0029]樣品預處理方法：
[0030] 稱取5g蜂蜜樣品于50mL-次性離心管，加入5mL去離子水，經(jīng)60°C水浴后渦旋至蜂 蜜完全溶解。添加15mL乙酸乙酯后振蕩提取lOmin，以3000rpm的速率離心5min，移取上層清 液至15mL離心管。在上清液中加入5mL去離子水，振蕩lOmin，3000rpm離心5min，取上清液。 重復用水反萃一次，取上清液1〇111匕45°(：水浴，氮氣吹干上清液后用2mL乙腈復溶，供DART-MS/MS檢測。
[0031] DART-MS/MS 檢測方法：
[0032]離子源參數(shù):負離子采集，多反應監(jiān)測(MRM)模式，載氣氦氣，載氣溫度550°C，樣品 傳輸速度〇. 6mm/s。質譜采集參數(shù)見表1。
[0033]表 1
[0035] DART-MS-MS進樣方式優(yōu)化：
[0036] 為了考慮進樣方式對實驗結果的影響，對樣品的進樣方式進行的驗證和重新設 計。DART進樣方式種類較多，較為常見的有Dip-it和Mesh篩網(wǎng)兩種模塊。Mesh模塊因重現(xiàn)性 較好而被用于定量分析，且Mesh模塊進樣量比Dip-it模塊大，理論上檢測靈敏度應該比 Dip-it模塊高。但實際上，Mesh模塊其樣品分布面積大，單次上樣時其靈敏度是低的，通過 多次點樣以增加進樣量，理論上是可以彌補不足，但是在實際樣品的檢測中，多次點樣后引 入的內(nèi)源性基質干擾更多，有時會導致靈敏度降低。實驗將Dip-it模塊蘸取的進樣方式改 為使用移液器定量滴加5yL樣品溶液在Dip-it管上(DIP-5yL)，與Mesh模塊作比較，在兩種 模塊下分別對〇. 5、2.5、5、10yg/kg 4個濃度水平的氯霉素進行檢測，結果見圖1，為Dip-it 與Mesh兩種進樣模塊下氯霉素提取離子流圖?？梢钥闯鱿嗤瑵舛人綍r，氯霉素響應的信 噪比在Dip-it模塊下明顯高于Mesh模塊，將樣品溶液定量滴加到Dip-it管上的操作可以確 實有效的提取DART檢測的靈敏度。
[0037]為對比Dip-it與Mesh模塊的重現(xiàn)性差異，考察經(jīng)改進點樣方式后的Dip-it模塊是 否可以用于定量檢測，實驗選用2.5yg/kg的氯霉素標準溶液分別在三種模塊下重復進樣10 次，結果見表2?？梢钥闯觯Ｒ?guī)Dip-it蘸取進樣方式下峰面積相對標準偏差為77.13%，遠 大于另外兩種進樣方式;經(jīng)定量滴加樣品溶液到Dip-it管后的Dip-it進樣模塊重復進樣10 針，峰面積的相對標準偏差為24.63% ;Mesh模塊重復進樣10針，峰面積的相對標準偏差為 21.06%，二者相差3.6%?？梢娊?jīng)改進后的Dip-it模塊與Mesh模塊的檢測重現(xiàn)性差異不大。 原因可能是Dip-it常規(guī)蘸取模式下實際附著在Dip-it管表面的樣品溶液體積差異很大，經(jīng) 移液器簡單控制后，進樣體積差異有較大改善，與Mesh模塊相當。
[0038]表2
[0041] 樣品預處理方法優(yōu)化：
[0042] 蜂蜜主要成分是糖類，基質極為復雜，一般來說成熟蜂蜜含糖總量高達75%，主要 為果糖和葡萄糖。提取溶液中大量的糖，質譜檢測時會引起嚴重的基質效應。本方法利用葡 萄糖與果糖易溶于水，而不溶于提取溶劑乙酸乙酯的特性，對乙酸乙酯提取液用水反萃兩 次，有效去除了提取溶液中大量單糖干擾，提高了方法靈敏度。結果見附圖2,由圖可知三種 不同種類的蜂蜜在用水反萃處理后的響應明顯比簡單提取處理后的高?？梢娪盟摧湍軌?有效提高檢測信噪比，提升蜂蜜中氯霉素檢測的靈敏度。且與標準溶液(m，a 2)相比，蜂蜜樣 品中的氯霉素響應雖然稍低，但差異不大，說明該處理方法能夠有效減小基質效應。
[0043] DART-MS/MS 與LC-MS/MS 分析方法比較：
[0044]實驗從定量結果、樣品預處理時間、分析時間、檢出限等方面綜合比較了DART-MS/ MS與LC-MS/MS兩種分析方法在分析蜂蜜中氯霉素的優(yōu)劣，結果見表3?？紤]到DART的定量能 力和篩查方便易操作的原則，實驗使用外標法定量對比了 DART-MS/MS與LC-MS/MS定量結果 的差異。在野桂花與槐花蜂蜜中分別添加〇. 5ng/g濃度水平的氯霉素，扣除本底值后分別使 用DART-MS/MS與LC-MS/MS對其定量，結果見表3。總體來說，兩種檢測方法在使用外標法定 量時存在一定差異，但綜合考慮DART檢測重現(xiàn)性，認為DART-MS/MS與LC-MS/MS定量結果準 確性在可接受范圍內(nèi)。樣品預處理和分析時間則是DART-MS/MS明顯優(yōu)于LC-MS/MS。而檢出 限則是LC-MS/MS 優(yōu)于 DART-MS/MS。
[0045]表 3
[0047]本實施例中，稱取待測蜂蜜樣品，加入去離子水，經(jīng)加熱水浴后渦旋至蜂蜜完全溶 解;添加乙酸乙酯后震蕩提取并離心操作，移取上層清液至離心管;重復用水反萃一次，得 到樣品上清液;將所述樣品上清液水浴后，氮氣吹干，用乙腈復溶，得到待測樣品溶液;使用 移液器定量滴加所述待測樣品溶液在Dip-it管上;采用實時直接分析質譜離子源DART-MS/ MS對所述待測樣品溶液進行檢測。并將待測樣品的檢測結果采用液相色譜-質譜聯(lián)用儀LC-MS/MS進行驗證。圖2為簡單提取與用水反萃三種蜂蜜中氯霉素 (0.2yg/kg)提取離子圖，其 中，a. 0.2yg/kg標準溶液，b.棗花蜂蜜，c.槐花蜂蜜，d.野桂花蜂蜜。
[0048]本發(fā)明實施例的方案，改進了DART-MS分析中采用Dip-it管直接蘸取的傳統(tǒng)進樣 方式，改為移液器定量滴加的取樣方式，有效提高Dip-it進樣方式的精密度，保障了DART-MS/MS分析方法的靈敏度;優(yōu)化了提取方式和凈化方法，使篩查的靈敏度提高100倍。與傳統(tǒng) LC-MS-MS定量方法相比，本方法的測試效率從每20個樣品大于24h提高到每20個樣品不足 4h〇
[0049]顯然，本領域的技術人員可以對本發(fā)明進行各種改動和變型而不脫離本發(fā)明的精 神和范圍。這樣，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權利要求及其等同技術的范圍 之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動和變型在內(nèi)。
【主權項】
1. 一種蜂蜜基質中氯霉素的快速篩查方法，其特征在于，包括： 稱取待測蜂蜜樣品，加入去離子水，經(jīng)加熱水浴后渦旋至蜂蜜完全溶解； 添加乙酸乙酯后震蕩提取并離心操作，移取上層清液至離心管； 重復用水反萃一次，得到樣品上清液； 水浴氮氣吹干樣品，殘渣用乙腈復溶，得到待測樣品溶液； 定量滴加所述待測樣品溶液在D i p- i t管上； 采用實時直接分析質譜離子源DART-MS/MS對所述待測樣品溶液進行檢測。2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括： 所述加熱水浴為60 °C水浴。3. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括： 所述用水反萃為:在上清液中加入5mL去離子水，振蕩lOmin，3000rpm離心5min，取上清 液。4. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中前處理過程具體包括： 稱取5g蜂蜜樣品于50mL-次性離心管，加入5mL去離子水，經(jīng)60°C水浴后渦旋至蜂蜜完 全溶解;添加15mL乙酸乙酯后振蕩提取lOmin，以3000rpm的速率離心5min，移取上層清液至 15mL離心管;在上清液中加入5mL去離子水，振蕩lOmin，3000rpm離心5min，取上清液;重復 用水反萃一次，取上清液1 OmL; 45 °C水浴，氮氣吹干上清液后用2mL乙腈復溶。5. 如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法還包括： 移液器定量滴加5yL所述待測樣品溶液在Dip-it管上。6. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括： 設置實時直接分析質譜離子源DART-MS/MS參數(shù)：負離子采集，多反應監(jiān)測(MRM)模式， 載氣為氦氣，載氣溫度550°C，樣品傳輸速度0.6mm/s。
【文檔編號】G01N27/62GK105865885SQ201610210048
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月6日
【發(fā)明人】李秀琴, 張慶合, 許森, 李紅梅
【申請人】中國計量科學研究院