一種利用免疫熒光測(cè)定古代羊毛織品的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及文物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種利用免疫熒光測(cè)定古代羊毛織品的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]羊毛織品是古代北方地區(qū)主要的紡織原料，是中國(guó)的寶貴遺產(chǎn)。但由于北方地區(qū)的環(huán)境因素以及羊毛蛋白纖維的性質(zhì)，腐朽文物大都化為痕跡，如何采用科學(xué)的手段鑒定羊毛成了燃眉之急。常用的檢測(cè)方法受樣品、雜質(zhì)等影響較大，結(jié)果準(zhǔn)確性不高，所以一種更加簡(jiǎn)便、直觀的科學(xué)方法迫切需要。
[0003]申請(qǐng)?zhí)枮?01010577180.1的中國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)了一種物理法細(xì)化羊毛纖維與羊絨、羊毛混紡纖維含量分析方法，是利用纖維照相技術(shù)把所有物理細(xì)化綿羊毛纖維工藝生產(chǎn)的拉伸綿羊毛進(jìn)行分類(lèi)拍照建成圖譜庫(kù)，把物理細(xì)化綿羊毛纖維工藝技術(shù)得到的拉伸羊毛纖維整纖維長(zhǎng)度上的鱗片變化形態(tài)、特點(diǎn)分類(lèi)說(shuō)明。采取對(duì)比、分類(lèi)比對(duì)綜合觀測(cè)分析方法定性，用投影顯微鏡根據(jù)國(guó)家方法標(biāo)準(zhǔn)GB/T16988-1997《特種動(dòng)物纖維與綿羊毛混和物含量的測(cè)定》檢測(cè)不同纖維混紡比例。該方法的實(shí)施，解決了物理細(xì)化綿羊毛纖維與綿羊毛、羊絨等特種動(dòng)物纖維形成的二組分或多組分混紡產(chǎn)品的纖維含量測(cè)定沒(méi)有相應(yīng)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的問(wèn)題，測(cè)定準(zhǔn)確率100%，檢驗(yàn)結(jié)果均在國(guó)家產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)的誤差范圍內(nèi)。
[0004]但是上述方法只是適用于現(xiàn)代羊毛織品中的羊毛含量檢測(cè)，對(duì)于羊毛織品文物并不適用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種利用免疫熒光測(cè)定古代羊毛織品的檢測(cè)方法。本發(fā)明采用免疫熒光的方法對(duì)古代羊毛織品進(jìn)行了檢測(cè)，一方面靈敏度高，操作簡(jiǎn)單，成本低，結(jié)果直觀，易于分析。另一方面能夠避免來(lái)自其它蛋白的干擾，特異性強(qiáng)。
[0006]本發(fā)明的具體技術(shù)方案為:一種利用免疫熒光測(cè)定古代羊毛織品的檢測(cè)方法，采用如下步驟:
A)取三塊大小一致的文物樣并分別放置于三個(gè)打孔皿中，并將打孔皿分別標(biāo)記為A、B、C;用pH 7.4的I3BS緩沖液對(duì)文物樣進(jìn)行洗滌直至文物樣表面無(wú)附著物;接著向A中加入10-50體積份的兔抗羊毛角蛋白抗體稀釋液，向C中加入10-50體積份的pH7.4的PBS溶液，B不作處理；分別將A、B、C冷藏10-14h;然后分別向各打孔皿中加入1500-2500體積份的pH7.4的PBS溶液，浸泡4-6min，洗滌三次，每次2_4min。
[0007]B)分別向A、B中加入10-50體積份的綠色熒光素標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)抗體稀釋液，向C中加入10-50體積份的pH 7.4的PBS溶液;然后分別將A、B、C放置于底層鋪有濕毛巾的盒子中，用錫箔紙將盒子密封，36-38°C避光孵育0.5-2h;然后分別向各打孔皿中加入1500-2500體積份的pH 7.4的PBS溶液，浸泡4_6min，洗滌三次，每次2_4min。
[0008]C)分別向A，B，C中加入8-12體積份的緩沖甘油進(jìn)行封片。
[0009]D)將A，B，C放置于激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察;若B，C未發(fā)出綠色的熒光，而A發(fā)出了綠色的熒光，說(shuō)明文物樣與兔抗羊毛角蛋白抗體發(fā)生了特異性結(jié)合，證明文物樣為羊毛織品O
[0010]本發(fā)明采用免疫熒光的方法對(duì)古代羊毛織品進(jìn)行了檢測(cè)，將兔抗羊毛角蛋白抗體浸漬于文物樣表面，洗滌干凈后，加入綠色熒光素標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)抗體，形成抗原-一抗-二抗復(fù)合物，然后洗滌干凈將文物樣放在激光共聚焦顯微鏡下觀察?？筛鶕?jù)樣品是否發(fā)出綠色熒光進(jìn)行定性分析。
[0011 ] 作為優(yōu)選，所述pH7.4的PBS緩沖液配制方法如下:稱取KCl0.2g, KH2PO40.27g，NaCl8.0g,Na2HPO41.42g，用800mL蒸餾水溶解并定容至100mL，調(diào)節(jié)pH至7.4。
[0012]作為優(yōu)選，步驟C)中所述緩沖甘油的配制方法如下:稱取Na2CO30.1 5g，NaHCO30.29g，用800mL蒸餾水溶解并定容至lOOOmL，調(diào)節(jié)pH至9.6 ；將pH 9.6的I3BS緩沖液和丙三醇按照體積比1:1混合。
[0013]作為優(yōu)選，所述兔抗羊毛角蛋白抗體稀釋液的制備方法為:用質(zhì)量濃度為1%的牛血清白蛋白溶液將初始濃度為lmg/mL的兔抗羊毛角蛋白抗體稀釋10-200倍。
[0014]作為優(yōu)選，所述綠色熒光素標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)抗體稀釋液的制備方法如下:用質(zhì)量濃度為1%的牛血清白蛋白溶液將綠色熒光素標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)抗體溶液稀釋50-500倍。
[0015]作為優(yōu)選，綠色熒光素山羊抗兔IgG(H+L)抗體溶液的制備方法如下:向每2.5-3.5mL pH為5.5的PBS緩沖液中依次加入0.14-0.16mg的綠色熒光微球、2.6-2.8yL的現(xiàn)配的濃度為4_6mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺溶液和8-12yL的濃度為lmg/mL的山羊抗兔IgG(H+L)抗體溶液，得到混合液，將所述混合液在室溫下攪拌1.5-2.5h，用1被％的牛血清蛋白溶液封閉25-35min后在8000-10000 r/min、4°C條件下離心處理8_12min，移除上清液，將沉淀加入到體積為山羊抗兔IgG(H+L)抗體溶液I倍pH為5.5的PBS緩沖液中復(fù)溶、混勻，制得綠色熒光素標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)抗體溶液。
[0016]與現(xiàn)有技術(shù)對(duì)比，本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明采用免疫熒光的方法對(duì)古代羊毛織品進(jìn)行了檢測(cè)，一方面靈敏度高，操作簡(jiǎn)單，成本低，結(jié)果直觀，易于分析。另一方面能夠避免來(lái)自其它蛋白的干擾，特異性強(qiáng)。
【具體實(shí)施方式】
[0017]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。
[0018]實(shí)施例1
一種利用免疫熒光測(cè)定古代羊毛織品的檢測(cè)方法，采用如下步驟:
原料制備:
ρΗ7.4的PBS緩沖液:稱取KCl0.2g，KH2PO40.27g，NaCl 8.0g,Na2HPO4I.42g，用800mL蒸餾水溶解并定容至1000mL，調(diào)節(jié)pH至7.4。
[0019]緩沖甘油:稱取Na2CO30.15g,NaHCO30.29g，用800mL蒸餾水溶解并定容至100mL，調(diào)節(jié)pH至9.6;將pH 9.6的PBS緩沖液和丙三醇按照體積比1:1混合。
[0020]兔抗羊毛角蛋白抗體稀釋液:用質(zhì)量濃度為1%的牛血清白蛋白溶液將初始濃度為lmg/ mL的兔抗羊毛角蛋白抗體稀釋100倍。
[0021]綠色熒光素標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)抗體稀釋液:向3mLpH為5.5的I3BS緩沖液中依次加入0.15mg的綠色焚光微球、2.7yL的現(xiàn)配的濃度為5mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺溶液和1yL的濃度為lmg/mL的山羊抗兔IgG(H+L)抗體溶液，得到混合液，將所述混合液在室溫下攪拌2h，用lwt%的牛血清蛋白溶液封閉30min后在9000 r/min、4 °C條件下離心處理1min，移除上清液，將沉淀加入到體積為山羊抗兔IgG(H+L)抗體溶液I倍pH為5.5的PBS緩沖液中復(fù)溶、混勻，制得綠色熒光素標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)抗體溶液。用質(zhì)量濃度為1%的牛血清白蛋白溶液將綠色熒光素標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)抗體溶液稀釋300倍。
[0022]A)取三塊大小一致的文物樣并分別放置于三個(gè)打孔皿中，并將打孔皿分別標(biāo)記為A、B、C;用pH 7.4的PBS緩沖液對(duì)文物樣進(jìn)行洗滌直至文物樣表面無(wú)附著物;接著向A中加入30yL的兔抗羊毛角蛋白抗體稀釋液，向C中加入30yL的pH7.4的PBS溶液，B不作處理;分別將八、8、(:冷藏1211;然后分別向各打孔皿中加入2000yL的pH7.4的I3BS溶液，浸泡5min，洗滌三次，每次3min。
[0023]B)分別向A、B中加入30yL的綠色熒光素標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)抗體稀釋液，向C中加入30yL的pH 7.4的PBS溶液;然后分別將A、B、C放置于底層鋪有濕毛巾的盒子中，用錫箔紙將盒子密封，37°C避光孵育1.25h;然后分別向各打孔皿中加入2000yL的pH 7.4的PBS溶液，浸泡5min，洗滌三次，每次3min。
[0024]C)分別向A，B，C中加入1yL的緩沖甘油進(jìn)行封片。
[0025]D)將A，B，C放置于激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察;結(jié)果B，C未發(fā)出綠色的熒光，而A發(fā)出了綠色的熒光，說(shuō)明文物樣與兔抗羊毛角蛋白抗體發(fā)生了特異性結(jié)合，證明文物樣為羊毛織品。
[0026]實(shí)施例2
一種利用免疫熒光測(cè)定古代羊毛織品的檢測(cè)方法，采用如下步驟:
原料制備:
ρΗ7.4的PBS緩沖液:稱取KCl0.2g，KH2PO40.27g，NaCl 8.0g,Na2HPO4I.42g，用800mL蒸餾水溶解并定容至1000mL，調(diào)節(jié)pH至7.4。
[0027]緩沖甘油:稱取Na2CO30.15g,NaHCO30.29g，用800mL蒸餾水溶解并定容至100mL，調(diào)節(jié)pH至9.6;將pH 9.6的PBS緩沖液和丙三醇按照體積比1:1混合。
[0028]兔抗羊毛角蛋白抗體稀釋液:用質(zhì)量濃度為1%的牛血清白蛋白溶液將初始濃度為lmg/mL的兔抗羊毛角蛋白抗體稀釋1倍。
[0029]綠色熒光素標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)抗體稀釋液:向2.5mL pH為5.5的PBS緩沖液中依次加入0.14mg的綠色焚光微球、2.6yL的現(xiàn)配的濃度為4mg/m