家用智能檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及婦科生殖炎癥檢測技術(shù)，具體為一種可在家中使用的，常見婦科感染病源小型化自動分析診斷設(shè)備。本試劑盒可鑒別診斷出生殖道感染的三種常見病原體:支原體，淋病奈瑟氏菌、白色念球菌。
【背景技術(shù)】
[0002]生殖炎癥是最常見的女性生殖器官炎癥，為婦科門診常見的疾病。各個年齡階段都可發(fā)病。
[0003]主要由支原體，細(xì)菌、霉菌等所引起。正常健康婦女，由于解剖學(xué)及生物化學(xué)特點，陰道對病原體的侵入有自然防御功能；當(dāng)陰道的自然防御功能遭到破壞，則病原體易于侵入，導(dǎo)致炎癥如不即使治療會近一步造成身體傷害。
[0004]感染生殖道病原體主要分為細(xì)菌、霉菌、支原體、病毒四大類。則目前治療藥物有中藥、化藥、抗生素等。
[0005]不同的病原體引起的感染需要對癥藥物治療，才可以有效殺滅病原菌，保護(hù)生殖系統(tǒng)的生理環(huán)境，如長期濫用藥物則會使病原體易產(chǎn)生耐藥性，造成久治不愈甚至更加嚴(yán)重的后果。
[0006]鑒于婦科感染的常發(fā)性與病患的隱私性因此，需要開發(fā)出一種適合家用的操作簡便、高便攜性、無需要采血，高度智能化的鑒別診斷設(shè)備來指導(dǎo)用藥。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明解決的技術(shù)問題是:提供一種家用智能檢測試劑盒，是一種小型化家用智能檢測設(shè)備，可在短時間內(nèi)診斷出患者所感染病原體。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案是:家用智能檢測試劑盒，是由電子讀取分析部分與單克隆抗體檢測試劑兩大部分構(gòu)成，所述電子讀取分析部分包括單片機(jī)系統(tǒng)、光電檢測系統(tǒng)、電池、開關(guān)K、液晶顯示器、復(fù)合金標(biāo)檢測探針和試紙;所述復(fù)合金標(biāo)檢測探針、電池、開關(guān)K、單片機(jī)系統(tǒng)密封在機(jī)殼內(nèi)，液晶顯示器安裝于機(jī)殼窗口處;所述單克隆抗體檢測試劑包括特異性識別生殖道支原體的單克隆抗體、淋病奈瑟氏菌單克隆抗體、白色念球菌單克隆抗體、羊抗鼠IgG抗體、復(fù)合金標(biāo)檢測探針；
[0009]所述試紙包括金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜、樣品墊、吸水墊；
[0010]所述復(fù)合金標(biāo)檢測探針包被在金標(biāo)墊上，所述復(fù)合金標(biāo)檢測探針是由膠體金標(biāo)記的特異性識別生殖道支原體的單克隆抗體、淋病奈瑟氏菌單克隆抗體、白色念球菌單克隆抗體的復(fù)合膠體金-抗體結(jié)合物；
[0011]所述硝酸纖維素膜上設(shè)有檢測線1、檢測線2、檢測線3和對照線4，所述檢測線I上包被特異性識別生殖道支原體的單克隆抗體，所述檢測線2上包被淋病奈瑟氏菌單克隆抗體，所述檢測線3上包被淋白色念球菌單克隆抗體，所述對照線4上包被羊抗鼠IgG抗體；
[0012]進(jìn)一步地，在上述方案中，所述復(fù)合金標(biāo)檢測探針的制備方法為:
[0013](I)單克隆抗體的制備:分別用人型支原體和解尿支原體作免疫原產(chǎn)生腹水型支原體單克隆抗體，用淋病奈瑟氏菌作免疫原產(chǎn)生淋病奈瑟氏菌單克隆抗體，用白色念珠菌作免疫原產(chǎn)生白色念球菌單克隆抗體；
[0014](2)膠體金的制備:先將10mL的0.01%HAuC14溶液加熱至沸騰，一次性迅速加入1.4mL的I %檸檬酸三鈉水溶液，繼續(xù)加熱至溶液由淡黃色轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)黑色最終變?yōu)榫萍t色，顏色穩(wěn)定后繼續(xù)加熱5min，室溫冷卻，加三蒸水定容至10mL，即得到膠體金溶液;制備的膠體金溶液用透射電鏡鏡檢，確保膠體金顆粒大小一致、均勻，否則重新制備；
[0015](3)復(fù)合金標(biāo)檢測探針的制備:用0.1moVLK2CO3調(diào)節(jié)上述膠體金溶液的pH為9.0，向10mL膠體金溶液中緩慢加入1.2?3.0mg/ml特異性識別生殖道支原體的單克隆抗體、I.2?3.0mg/ml淋病奈瑟氏菌單克隆抗體、1.2?3.0mg/ml白色念球菌單克隆抗體，磁力攪拌器緩慢攪拌Ih使其結(jié)合，加牛血清白蛋白(BSA)作為穩(wěn)定劑，使得終濃度為I %，2000?4000r/min離心6?10分鐘，棄上清液，沉淀用PH5?7檬酸磷酸鹽緩沖液稀釋至50m，制成抗體金；取抗體金I?20ml加PH5?7檬酸磷酸鹽緩沖液稀釋到30?60ml，加入微孔板中，-40?-60 V凍干，制成復(fù)合膠體金-抗體結(jié)合物，即為復(fù)合金標(biāo)檢測探針。
[0016]進(jìn)一步地，在上述方案中，所述試紙的制備方法為:
[0017](I)硝酸纖維素膜上檢測線的制備:將特異性識別生殖道支原體的單克隆抗體、淋病奈瑟氏菌單克隆抗體、白色念球菌單克隆抗體分別以0.1?3mg/ml的濃度在硝酸纖維素膜上按從左至右的順序劃線，分別為檢測線1、檢測線2和檢測線3，相鄰兩膜線間的距離為5?6mm，粗細(xì)均勻，噴完檢測好的膜需立即放入30?40 °C烘干10?12小時；
[00?8] (2)硝酸纖維素膜上質(zhì)控線的制備:將羊抗鼠IgG抗體按0.1?lmg/ml的濃度在硝酸纖維素膜上劃線，該膜線為質(zhì)控線，位于檢測線3的右側(cè)，距離檢測線3的距離為5?6mm，粗細(xì)均勻，噴完檢測好的膜需立即放入30?45°C的烘干10?12小時；
[0019](3)金標(biāo)墊的制備:用復(fù)合金標(biāo)檢測探針溶液噴涂經(jīng)預(yù)處理的金標(biāo)墊，制得包含復(fù)合膠體金-抗體結(jié)合物的金標(biāo)墊;將金標(biāo)墊在20?40 °C下干燥0.5?I小時；
[0020](4)將吸水墊粘貼在所述纖維素膜的遠(yuǎn)離檢測線的一端，將金標(biāo)墊粘貼在纖維素膜的靠近檢測線的一端，將樣品墊粘貼于金標(biāo)墊上與所述纖維素膜相對的一端，即制成試紙。
[0021]進(jìn)一步地，在上述方案中，所述的一種家用智能檢測試劑盒的檢測方法為:
[0022](I)取樣:使用專用陰道棉拭子完成陰道分泌物取樣后，混合稀釋液后加注于智能檢測試劑盒；
[0023](2)拔出隔片，合閉開關(guān)K，接通電池回路，通過液晶顯示器顯示電源接通;開關(guān)K由可插拔隔片把電池回路斷開，平時不使用時減少電池待機(jī)損耗；
[0024](3)將樣本加入加注口，當(dāng)單片機(jī)系統(tǒng)檢測到復(fù)合金標(biāo)檢測探針碰到試劑后，自動喚醒單片機(jī)程序，程序點亮發(fā)光二極管，發(fā)光二極管的光經(jīng)試紙反射到光電檢測系統(tǒng)，光電檢測系統(tǒng)把光轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的電信號送給單片機(jī)，單片機(jī)通過內(nèi)部程序?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行分析比較，得出測試結(jié)果，然后顯示到液晶顯示器屏幕上。
[0025]進(jìn)一步地，當(dāng)接通電池電源，將樣本加入加注口，單片機(jī)接收到需要測試的指令，開始工作。當(dāng)檢測到檢測指令，延時片刻，首先自檢本儀器內(nèi)的檢測試紙是否有效？當(dāng)試紙有效后，按設(shè)定程序逐條檢測試紙標(biāo)定檢測條。如發(fā)生變化即按不同變化，得出各自的檢驗結(jié)果。最終顯示在顯示器屏幕上。當(dāng)測試到試紙無效后直接跳過檢測環(huán)節(jié)，顯示本測試儀無效。
[0026]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明家用智能檢測試劑盒的是基于單克隆抗體技術(shù)，直接檢測感染病原體，具有特異性強(qiáng)、無需采血、早期診斷、速度快捷等諸多優(yōu)點，由于采用單片機(jī)組成的自動檢測功能，免除人為因素的干擾，直觀的顯示檢測結(jié)果，為自動檢測開辟了一個新的途徑。另外，本發(fā)明操作簡便、結(jié)果直觀，體積小，成本低，攜帶方便。
【附圖說明】
?0027]圖1是本發(fā)明硬件構(gòu)成示意圖；
[0028]圖2是本發(fā)明軟件構(gòu)成示意圖；
【具體實施方式】
[0029]實施例1:
[0030]1、腹水型支原體單克隆抗體的制備
[0031]菌種:人型支原體、解尿支原體由美國ATCC公司提供，以上菌株用作免疫原產(chǎn)生單克隆抗體。
[0032]細(xì)胞株:SP20小鼠骨髓瘤細(xì)胞株由第四軍醫(yī)大學(xué)細(xì)胞工程研究中心提供，作細(xì)胞融合用。
[0033]方法:
[0034]免疫原支原體菌株的制備和滅活:分別將人型支原體、解尿支原體液體培養(yǎng)基Iml加到人型支原體、解尿支原體標(biāo)準(zhǔn)菌株凍干粉中，溶解后，分別用移液器吸取支原體菌液分別加到10瓶肺炎支原體液體培養(yǎng)基、10瓶人型支原體液體培養(yǎng)基、10瓶解尿支原體液體培養(yǎng)基，每瓶分別加ΙΟΟμΙ，經(jīng)培養(yǎng)成陽性反應(yīng)后，每種將9瓶置一 25 °0冰箱作種子保存，一瓶用作二級擴(kuò)增培養(yǎng)，每瓶擴(kuò)增成10瓶，呈陽性反應(yīng)后收獲，于4°C冰箱保存，以備用作免疫原菌液。
[0035 ] Ba I b/C小鼠的免疫:8周齡的Ba I b/C小鼠20只，分成2組，每組1只，將種作免疫原的支原體菌株的濃度調(diào)到105/ml，置50°C恒溫箱30分鐘滅活，和等量完全佐劑混合后，以每只0.2ml的量，腹腔注射分別免疫Balb/C小鼠。于第一次免疫后第7、14、28天分別追加免疫一次，第31天取脾細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合。
[0036]細(xì)胞融合:
[0037](I)免疫脾細(xì)胞的制備:
[0038]①取免疫小鼠脾臟，放入盛有5ml不完全培養(yǎng)液的平皿中，置于200目的不銹鋼網(wǎng)上。用注射器內(nèi)芯研磨脾臟，并用平皿內(nèi)不完全培養(yǎng)液輕輕洗鋼網(wǎng)，使脾細(xì)胞全部通過網(wǎng)孔擠壓到溶液中。
[0039]②將脾細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入50ml離心管中，加不完全培養(yǎng)液到30ml，混勻后，經(jīng)100rpm離心5分鐘，棄去上清。
[0040]③用不完全培養(yǎng)液將沉淀細(xì)胞再離心、洗滌一次(重復(fù)步驟②)，將沉淀的細(xì)胞垂懸至10ml，混勻，用細(xì)胞計數(shù)版計數(shù)。總細(xì)胞數(shù)調(diào)為I X 108。
[0041 ] (2)sp20骨髓瘤細(xì)胞懸液的制備
[0042]①將sp20骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。
[0043]②將4瓶擴(kuò)增培養(yǎng)的骨髓瘤細(xì)胞收集到50ml的離心管內(nèi)。
[0044]③100rpm離心5分鐘，棄去上清。
[0045]④加入30ml不完全培養(yǎng)液，重復(fù)步驟③，再離心洗滌一次，然后將細(xì)胞垂懸至1ml，混勾，計數(shù)?？偧?xì)胞數(shù)調(diào)為2 X 170
[0046](3)細(xì)胞融合
[0047]①分別吸取含IX 18個脾細(xì)胞懸液和2 X 17個骨髓瘤細(xì)胞懸液，加入50ml離心管中，補(bǔ)加不完全培養(yǎng)液至30ml，充分搖勾。
[0048]②100rpm離心7分鐘，棄去上清。
[0049]③加50%的融合劑聚乙二醇(PEG)0.7ml。
[0050]④加入25ml不完全培養(yǎng)液，使PEG稀釋而失去促融作用。
[0051 ] ⑤800rpm離心7分鐘，棄去上清。
[0052]⑥加入20ml含次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶的選擇性培養(yǎng)液(HAT培養(yǎng)液)，輕輕吹吸沉淀細(xì)胞，使其垂懸并混勻。
[0053]⑦將細(xì)胞懸液加入輔有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中，每孔0.1ml，在37°C含5%⑶2的孵箱中培養(yǎng)。
[0054](4)抗體陽性孔檢測一間接ELI SA法
[0055]①用已知支原體抗原菌液包被
[0056]②加有克隆生長的孔中的培養(yǎng)上清ΙΟΟμΙ。
[0057]③加酶標(biāo)抗鼠IgG抗體ΙΟΟμΙ。
[0058]④加底物液ΙΟΟμΙ，室溫避光顯色10分鐘。
[0059]⑤判定結(jié)果:在酶聯(lián)免疫檢測儀492波長下測定OD值，空白對照調(diào)零。若待測控OD值大于或等于陰性對照孔OD值2.1倍，則可判定為陽性孔，孔內(nèi)生長有陽性克隆。
[0060](5)克隆化一有限稀釋法
[0061 ]將96孔板中培養(yǎng)上清被檢測為抗體陽性的孔標(biāo)記出來。用加樣器將孔內(nèi)的雜交瘤細(xì)胞反復(fù)吹打均勻后計數(shù)，然后用有限稀釋法進(jìn)行逐級稀釋，再加到96孔板進(jìn)行培養(yǎng)。觀察克隆生長，記錄單克隆孔，并及時進(jìn)行陽性檢測。將陽性克隆的細(xì)胞轉(zhuǎn)到24孔板培養(yǎng)，待其增殖到一定數(shù)量后再轉(zhuǎn)入細(xì)胞瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)。
[0062](6)雜交瘤細(xì)胞的凍存
[0063]將呈對數(shù)生長的雜交瘤細(xì)胞收集于離心管，100rpm離心10分鐘，棄去上清，加入Iml凍存液混勻，然后加到凍存管，在一 70°C低溫冰箱過夜后轉(zhuǎn)入液氮罐長期保存。
[0064](7)腹水型單克隆抗體制備
[0065]將凍存的雜交