工作電極生物反應(yīng)物及電極式測(cè)試條的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及工作電極生物反應(yīng)物及電極式測(cè)試 條。
【背景技術(shù)】
[0002] ?00'，即時(shí)檢驗(yàn)(口〇;[111：-0;1^-03代七6 81:;[1^)，指在病人旁邊進(jìn)行的臨床檢測(cè)，通常 不一定是臨床檢驗(yàn)師來進(jìn)行。多數(shù)情況下P0CT是在采樣現(xiàn)場(chǎng)即刻進(jìn)行分析，省去標(biāo)本在實(shí) 驗(yàn)室檢驗(yàn)時(shí)的復(fù)雜處理程序，快速得到檢驗(yàn)結(jié)果的一類新方法?，F(xiàn)在P0CT已成為檢驗(yàn)醫(yī)學(xué) 的重要組成部分，因其實(shí)驗(yàn)儀器小型化、操作簡(jiǎn)單化、報(bào)告結(jié)果即時(shí)化受到人們的青睞。
[0003] 基于酶安培生物傳感器原理的電化學(xué)測(cè)試條廣泛應(yīng)于各種即時(shí)檢測(cè)(P0CT)產(chǎn)品， 如已商品化的血糖、血酮、血脂和血肌酐電化學(xué)測(cè)試條。一般，電化學(xué)測(cè)試條表面含有識(shí)別 目標(biāo)分析物的特異性酶分子以及輔酶或電子介體，目標(biāo)分析物在電化學(xué)測(cè)試條表面發(fā)生酶 促氧化還原反應(yīng)，轉(zhuǎn)換為可收集和測(cè)量的電信號(hào)(氧化或還原電流），通過酶生物化學(xué)反應(yīng) (信號(hào)轉(zhuǎn)換)和電化學(xué)反應(yīng)(信號(hào)收集與測(cè)量)兩步可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分析物的定量檢測(cè)。
[0004] 通常，目標(biāo)分析物在工作電極表面產(chǎn)生酶促反應(yīng)電流信號(hào)的過程中，血液中存在 的多種內(nèi)源或外源的還原性干擾物亦會(huì)參與電流信號(hào)的發(fā)生過程，對(duì)測(cè)量結(jié)果造成正或負(fù) 的干擾，其中以抗壞血酸的干擾最為常見。對(duì)于以氧化電流為檢測(cè)信號(hào)的電化學(xué)測(cè)試條(如 血糖或血酮電化學(xué)測(cè)試條），抗壞血酸可在電極表面被直接電氧化或被氧化型電子介體氧 化，故所測(cè)氧化電流為目標(biāo)分子產(chǎn)生的真實(shí)電流和抗壞血酸產(chǎn)生的干擾電流的累加，導(dǎo)致 測(cè)量結(jié)果為正偏差。對(duì)于以還原電流為檢測(cè)信號(hào)的電化學(xué)測(cè)試條(如血脂或血肌酐電化學(xué) 測(cè)試條），抗壞血酸可與過氧化氫發(fā)生酶(過氧化物酶)促氧化還原反應(yīng)，減少與還原性電子 介體發(fā)生酶促氧化還原反應(yīng)的過氧化氫含量，導(dǎo)致測(cè)得的真實(shí)還原電流降低，測(cè)量結(jié)果產(chǎn) 生負(fù)偏差。通常，降低或消除抗壞血酸對(duì)電化學(xué)試條的干擾主要基于以下幾種途徑：
[0005] 途徑一：間接扣除工作電極表面的干擾電流信號(hào)。采用多電極模式(比如三電極結(jié) 構(gòu)的傳感器），抗壞血酸在工作電極和背景電極表面同時(shí)產(chǎn)生直接氧化電流信號(hào)，再將背景 電極的電流信號(hào)從工作電極中扣除，達(dá)到降低干擾的目的。此法可有效降低抗壞血酸的干 擾，但所用電化學(xué)試條需采用多電極工作模式，電極結(jié)構(gòu)復(fù)雜，不易制造。此外，該方法目前 僅用于提高以氧化電流為信號(hào)的電化學(xué)測(cè)試條對(duì)抗壞血酸的抗干擾能力，不適用于降低抗 壞血酸對(duì)以還原電流為檢測(cè)信號(hào)的電化學(xué)試條的負(fù)干擾。
[0006] 途徑二：試條結(jié)構(gòu)包含抗干擾層，如專利CN201110294269.1、CN201210407884.3及 CN201510188547.3中所提到的方案，在常規(guī)試條結(jié)構(gòu)上增加一個(gè)抗干擾層，抗干擾層與試 條本身的反應(yīng)層隔離開，使樣本通過抗干擾層時(shí)，干擾物質(zhì)（如抗壞血酸）與抗干擾層內(nèi)的 抗干擾酶(如傳統(tǒng)的抗壞血酸氧化酶)反應(yīng)，使樣本內(nèi)的干擾物質(zhì)被清除，然后樣本再進(jìn)入 到試條的反應(yīng)層進(jìn)行反應(yīng)，生成待檢測(cè)物相應(yīng)的電信號(hào)。這種方案使試條的結(jié)構(gòu)變得復(fù)雜， 至少在試條的厚度上必須有所增加，同樣地制造成本較高，并且在工業(yè)生產(chǎn)過程中難于批 量生產(chǎn)，試條質(zhì)量不好控制。
[0007] 途徑三:直接降低工作電極表面的干擾電流信號(hào)。直接減少或清除電極表面附近 的抗壞血酸，降低或消除抗壞血酸在電極表面產(chǎn)生干擾電流信號(hào)。通常，抗壞血酸在生理環(huán) 境中（如血液)帶負(fù)電，可在工作電極表面覆蓋一層帶負(fù)電的高分子薄膜(如磺化氟代聚合 物Naf ion)，利用靜電排斥原理將帶負(fù)電的抗壞血酸與工作電極隔開，減少電極表面抗壞血 酸的量。這種方案在理論上可行，但在實(shí)際生產(chǎn)中，由于這種高分子薄膜成本較高，同時(shí)對(duì) 抗壞血酸的隔離效果難以控制，很難保證每次都可以達(dá)到預(yù)期效果，以現(xiàn)階段的技術(shù)水平 不具備實(shí)用性。
[0008] 途徑四：將抗干擾酶與待檢測(cè)物酶放在一起形成混合酶，如專利 CN200710119127.5中提到的方案，采用傳統(tǒng)的抗壞血酸氧化酶參加反應(yīng)，雖然在理論上可 以達(dá)到抗干擾的效果，同時(shí)也能采用現(xiàn)有的這種簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)的試條，使用上也較為簡(jiǎn)單。但 是，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明傳統(tǒng)抗壞血酸氧化酶加入待檢測(cè)物酶后，未能明顯改善試條對(duì)抗壞血酸 的抗干擾能力，同時(shí)加入該傳統(tǒng)的抗壞血酸氧化酶會(huì)產(chǎn)生一些未知的化學(xué)反應(yīng)，對(duì)電化學(xué) 試條自身的酶反應(yīng)電流響應(yīng)信號(hào)產(chǎn)生嚴(yán)重干擾(如降低試條精密度，減小電流響應(yīng)靈敏度， 降低線性范圍）。因此，目前在可拋棄的商品化一次性電化學(xué)試條中鮮有采用直接混合待檢 測(cè)物酶與傳統(tǒng)的抗壞血酸氧化酶的方法來降低抗壞血酸的干擾。
[0009] 因此，開發(fā)一種有效降低或消除抗壞血酸對(duì)電化學(xué)測(cè)試條干擾的方法，提高電化 學(xué)測(cè)試條的準(zhǔn)確度具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 有鑒于此，本發(fā)明提供了工作電極生物反應(yīng)物及電極式測(cè)試條。該發(fā)明在電極式 測(cè)試條中采用直接混合目標(biāo)分析物專一用酶(與待檢測(cè)物相對(duì)應(yīng)的生物酶)與新型抗壞血 酸氧化酶(N-AS0)的方法來降低抗壞血酸的干擾。本發(fā)明的抗干擾方法適用于采用單個(gè)或 多個(gè)工作電極系統(tǒng)的電化學(xué)測(cè)試條，不僅可降低抗壞血酸對(duì)以氧化電流為檢測(cè)信號(hào)的電化 學(xué)測(cè)試條的干擾，也可降低抗壞血酸對(duì)以還原電流為檢測(cè)信號(hào)的電化學(xué)測(cè)試條的干擾。
[0011] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
[0012] 本發(fā)明提供了一種工作電極生物反應(yīng)物，包括微生物來源的抗壞血酸氧化酶，與 待檢測(cè)物相對(duì)應(yīng)的生物酶，以及電子介體。
[0013] 與傳統(tǒng)的抗壞血酸氧化酶(AS0)相比，本發(fā)明中新型抗壞血酸氧化酶（以N-AS0表 示)在酶的來源，理化性質(zhì)以及酶催化反應(yīng)路徑方面有所區(qū)別，如表1所示。該N-AS0是日本 天野公司出品的一種新型的抗壞血酸氧化酶，其酶來源為微生物體，而傳統(tǒng)AS0的來源為黃 瓜(植物提取物），兩者的分子量、等電點(diǎn)等理化性質(zhì)上有差別，故兩者在分子結(jié)構(gòu)和組成上 存在差異，這種結(jié)構(gòu)和組成上的差異導(dǎo)致了兩者對(duì)抗壞血酸的酶催化反應(yīng)路徑不同，N-AS0 可氧化抗壞血酸產(chǎn)生雙氧水，而傳統(tǒng)AS0的產(chǎn)物為水。同時(shí)，本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)將該N-AS0與目 標(biāo)分析物專一用酶直接混合后所制電化學(xué)試條不僅可有效減小抗壞血酸的干擾，而且對(duì)目 標(biāo)分析物專一用酶的酶反應(yīng)電流響應(yīng)信號(hào)不產(chǎn)生任何干擾(如不影響試條的精密度，不減 小電流響應(yīng)靈敏度）。該N-AS0即可用于降低抗壞血酸對(duì)以氧化電流為檢測(cè)信號(hào)的電化學(xué)測(cè) 試條的干擾，又可用于降低抗壞血酸對(duì)以還原電流為檢測(cè)信號(hào)的電化學(xué)測(cè)試條的干擾：
[0014] -、降低抗壞血酸對(duì)以氧化電流為檢測(cè)信號(hào)的電化學(xué)測(cè)試條的干擾。
[0015] 在以氧化電流為檢測(cè)信號(hào)的電化學(xué)測(cè)試條中，其氧化電流主要起源于反應(yīng)生成的 還原型電子介體在正電位下的電化學(xué)氧化反應(yīng)。對(duì)于采用單工作電極的此類電化學(xué)試條， 在工作電極表面加入新型抗壞血酸氧化酶可將抗壞血酸氧化生成雙氧水，而雙氧水在電極 表面發(fā)生電氧化反應(yīng)產(chǎn)生正干擾的程度要遠(yuǎn)小于抗壞血酸，故可降低或消除抗壞血酸對(duì)此 類電化學(xué)試條的干擾。
[0016] 此外，為一步提高試條的抗干擾能力，可采用雙工作電極的電化學(xué)試條。第一工作 電極為目標(biāo)分析物電極，所測(cè)電流記為I:，第二工作電極為空白電極，所測(cè)電流記為1 2,在第 一和第二工作電極表面均加入新型抗壞血酸氧化酶。實(shí)際測(cè)量中，第一和第二工作電極表 面的抗壞血酸均被氧化生成雙氧水，在正電位下，第一和第二電極表面的雙氧水均發(fā)生一 定程度的電氧化，產(chǎn)生部分正干擾氧化電流，將第一工作電極電流Ιι減去第二工作電極電 流1 2得扣除背景電流信號(hào)后的電流1(1 = 1:-12),即可消除該部分正干擾氧化電流，進(jìn)一步 提高電化學(xué)試條對(duì)抗壞血酸的抗干擾能力。
[0017] 二、降低抗壞血酸對(duì)以還原電流為檢測(cè)信號(hào)的電化學(xué)測(cè)試條的干擾。
[0018] 在以還原電流為檢測(cè)信號(hào)的電化學(xué)測(cè)試條中，其還原電流主要起源于反應(yīng)生成的 氧化型電子介體在負(fù)電位下的電化學(xué)還原反應(yīng)。對(duì)于此類電化學(xué)試條，可采用雙工作電極 模式降低抗壞血酸的干擾。同樣，第一工作為目標(biāo)分析物電極，所測(cè)電流記為I:，第二工作 電極為空白電極，所測(cè)電流記為1 2,在第一和第二工作電極表面均加入新型抗壞血酸氧化 酶。實(shí)際測(cè)量中，第一和第二工作電極表面的抗壞血酸均被氧化生成雙氧水，在負(fù)電位下， 第一和第二電極表面的雙氧水均發(fā)生一定程度的電還原，產(chǎn)生部分正干擾還原電流，將第 一工作電極電流11減去第二工作電極電流12得扣除背景電流信號(hào)后的電流I (I = I i-12 )，gp 可消除該部分正干擾還原電流，提高電化學(xué)試條對(duì)抗壞血酸的抗干擾能力。加入新型抗壞 血酸氧化酶將抗壞血酸的負(fù)干擾轉(zhuǎn)變成正干擾，利用雙工作電極模式扣除背景信號(hào)的方法 降低了抗壞血酸對(duì)以還原電流為檢測(cè)信號(hào)的電化學(xué)測(cè)試條的干擾。
[0019] 在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，新型抗壞血酸氧化酶的酶催化反應(yīng)路徑為:L-抗 壞血酸與氧氣在所述抗壞血酸氧化酶的催化下生成L-脫氫抗壞血酸和過氧化氫。
[0020] 在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，新型抗壞血酸氧化酶的分子量為130000,等電點(diǎn) 為9 · 0，Km 常數(shù)為4 · 9 X 10-4M。
[0021] 在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，與待檢測(cè)物相對(duì)應(yīng)的生物酶為葡萄糖氧化酶，或 者為羥丁酸脫氫酶和/或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，電子介體為氧化型電子介體；
[0022] 與待檢測(cè)物相對(duì)應(yīng)的生物酶為尿酸氧化酶和/或過氧化物酶，或者為膽固醇酯酶 和/或膽固醇氧化酶，電子介體為還原型電子介體。
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