一種腦脊液和尿蛋白液體單試劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明提供一種腦脊液和尿蛋白液體單試劑及其制備方法，屬于涉及體外診斷試 劑領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前市場上常用的腦脊液和尿蛋白分析方法有鄰苯三酚紅鉬法、雙縮脲法和磺基 水楊酸比濁法。雙縮脲是由兩分子尿素加熱縮合而成的化合物，雙縮脲在堿性條件下與硫 酸銅生成紫紅色絡(luò)合物，蛋白質(zhì)分子中含有肽鍵，與雙縮脲結(jié)構(gòu)類似，故蛋白質(zhì)與堿性硫酸 銅也能生成紫紅色絡(luò)合物，在一定條件下其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，可用來蛋白質(zhì) 定量。但該法無論手工法還是試劑盒，在測定低值時都存在測值偏高，偏差大等問題，尤其 在測定隨機(jī)尿樣時，由于隨機(jī)尿樣中蛋白含量約為10-140mg/L，用該法檢測準(zhǔn)確度低，且尿 樣用量大。
[0003] 磺基水楊酸比濁法是在略低于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的pH條件下，蛋白質(zhì)帶有正電荷的氨 基與帶負(fù)電荷的磺基水楊酸根結(jié)合，形成不溶性蛋白質(zhì)鹽而沉淀。其濁度的變化與酸性沉 淀劑的化學(xué)性質(zhì)、溫度及酸的濃度等因素均影響測定，且抗干擾性能差，一般用于定性，很 少用于定量。
[0004] 目前市場上的試劑盒都存在精確度不夠，低值測試出現(xiàn)負(fù)值，反應(yīng)生成物粘性大， 易沾比色杯，造成儀器污染，降低儀器使用壽命。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供一種腦脊液和尿蛋白液體單試劑，提供了 一種可在全自動生化分析儀 上適用的腦脊液和尿蛋白定量檢測試劑盒，本發(fā)明的腦脊液和尿蛋白定量檢測試劑盒通過 不同于現(xiàn)有技術(shù)的藥品和配制方法，使該試劑更穩(wěn)定，分散性更好，檢測更準(zhǔn)確，且不會污 染損傷儀器，線性范圍達(dá)到2-3000mg/L。
[0006] 本發(fā)明提供一種腦脊液和尿蛋白液體單試劑的制備方法，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0007] 本發(fā)明所述的一種腦脊液和尿蛋白液體單試劑，其特征在于是由以下藥物按重量 份數(shù)比制成的： 丁二酸-苯甲酸鈉緩沖液:50mmol/L、鄰苯三酚紅:0.01g-0.1g、二甲亞砜:20-100 ml、 TritonX-305:5-20 ml、草酸鈉：1 · 39-5 · 56 g、2-甲酰-1，1-二甲基肼:0 · 09-0 · 54g。
[0008] 本發(fā)明提供一種腦脊液和尿蛋白液體單試劑的制備方法，包括以下步驟： 稱取5.94g丁二酸加入到1L純化水中，攪拌溶解，再加入苯甲酸鈉0.5g，攪拌溶解，HC1 調(diào)節(jié)pH到2.0-3.5作為緩沖液;量取TritonX-305 5-20ml加入到20-100ml二甲亞砜中，充分 攪拌混勻，再加入0.01-0. lg鄰苯三酚紅，攪拌至完全溶解，加入到丁二酸-苯甲酸鈉緩沖液 中，再依次加入0.012-0.0484g鉬酸鈉、1.39-5.56g草酸鈉、0.09-0.54g 2-甲酰-1，1-二甲 基餅。
[0009] 本發(fā)明所使用的溶劑是二甲亞砜，在二甲亞砜中加入適量TritonX-305，兩種藥品 協(xié)同作用，有助于鄰苯三酚紅的溶解，對試劑的均一性和穩(wěn)定性起到重要作用，有效改善測 試低值的準(zhǔn)確性。
[0010] 在加入2-甲酰-1，1-二甲基肼后，試劑反應(yīng)的顏色變化更明顯，進(jìn)一步提高試劑靈 敏度，提高線性測值上線30%。
[0011] 本發(fā)明的積極效果在于： 鄰苯三酚紅與鉬酸結(jié)合形成紅色復(fù)合物，在467nm有最大的吸收，此復(fù)合物在酸性條件 下與蛋白結(jié)合形成藍(lán)紫色復(fù)合物，在598nm下有最大的吸收峰，通過測定598nm的峰值可就 算蛋白濃度。鄰苯三酚紅難溶于水，常用甲醇等有機(jī)溶劑溶解，但甲醇等有機(jī)溶劑溶解的鄰 苯三酚紅具有較大的粘性，且鄰苯三酚紅分散不均勻，在全自動生化分析儀上測試易出現(xiàn) 異常值，且粘比色杯，導(dǎo)致比色杯污染。
[0012] 使用二甲基亞砜溶解鄰苯三酚紅，溶解前，在二甲亞砜中加入TritonX-305，再加 入鄰苯三酚紅，可有效消除試劑粘比色杯，且提高了試劑的靈敏度，具有更好的重復(fù)性，測 低值尿樣和腦脊液時，偏差小，適用于全自動生化分析儀。鄰苯三酚紅鉬法的優(yōu)點(diǎn)在于試劑 配制后穩(wěn)定，可以長期保存。本發(fā)明制備的試劑盒，在加入2-甲酰-1，1-二甲基肼后，鄰苯三 酚紅鉬與蛋白質(zhì)形成的藍(lán)紫色復(fù)合物顏色明顯變深，使得測值更加靈敏，線性較之前高出 30% 〇
【附圖說明】
[0013]圖1為實(shí)施例1至實(shí)施例3的線性測值散點(diǎn)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0014]通過以下實(shí)施例進(jìn)一步舉例描述本發(fā)明，并不以任何方式限制本發(fā)明，在不背離 本發(fā)明的技術(shù)解決方案的前提下，對本發(fā)明所作的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易實(shí)現(xiàn)的任何改 動或改變都將落入本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。
[0015] 實(shí)施例1: 稱取5.94g丁二酸加入到1L純化水中，攪拌溶解，再加入苯甲酸鈉0.5g，攪拌溶解，HC1 調(diào)節(jié)pH到2.0(25°C)作為丁二酸-苯甲酸鈉緩沖液備用。量取TritonX-305 5ml加入到20ml 二甲亞砜中，充分?jǐn)嚢杌靹颍偌尤隣.Olg鄰苯三酚紅，攪拌至完全溶解，加入到丁二酸-苯 甲酸鈉緩沖液中，再依次加入〇. 012g鉬酸鈉、1.39g草酸鈉、0.09g 2-甲酰-1，1-二甲基肼。 [0016] 實(shí)施例2 稱取5.94g丁二酸加入到1L純化水中，攪拌溶解，再加入苯甲酸鈉0.5g，攪拌溶解，HC1 調(diào)節(jié)pH到2.6(25°C)作為丁二酸-苯甲酸鈉緩沖液備用。量取TritonX-305 10ml加入到50ml 二甲亞砜中，充分?jǐn)嚢杌靹?，再加?.05g鄰苯三酚紅，攪拌至完全溶解，加入到丁二酸-苯 甲酸鈉緩沖液中，再依次加入〇. 〇24g鉬酸鈉、2.78g草酸鈉、0.27g 2-甲酰-1，1-二甲基肼。 [00Π ] 實(shí)施例3 稱取5.94g丁二酸加入到1L純化水中，攪拌溶解，再加入苯甲酸鈉0.5g，攪拌溶解，HC1 調(diào)節(jié)pH到3.5(25°C)作為丁二酸-苯甲酸鈉緩沖液備用。量取TritonX-305 20ml加入到 100ml二甲亞砜中，充分?jǐn)嚢杌靹?，再加? . lg鄰苯三酚紅，攪拌至完全溶解，加入到丁二 酸-苯甲酸鈉緩沖液中，再依次加入〇.〇484g鉬酸鈉、5.56g草酸鈉、0.54g 2-甲酰-1，1-二甲 基餅。
[0018] 通過以下比較例證明本發(fā)明的積極效果所在： 比較例1: 配制以下成分試劑，檢測參數(shù)同實(shí)施例1，配制步驟如下： 稱取5.94g丁二酸加入到1L純化水中，攪拌溶解，再加入苯甲酸鈉0.5g，攪拌溶解，HC1 調(diào)節(jié)pH到2.6(25°C)作為丁二酸-苯甲酸鈉緩沖液備用。在50ml二甲亞砜中，加入0.05g鄰苯 三酚紅，攪拌至完全溶解，加入到丁二酸-苯甲酸鈉緩沖液中，再依次加入!^七 〇11父-30510ml、0·024g鉬酸鈉、2·78g草酸鈉，0·27g 2-甲酰-1，1-二甲基肼。
[0019] 比較例2: 配制以下成分試劑，檢測參數(shù)同實(shí)施例1，配制步驟如下： 稱取5.94g丁二酸加入到1L純化水中，攪拌溶解，再加入苯甲酸鈉0.5g，攪拌溶解，HC1 調(diào)節(jié)pH到2.6(25°C)作為丁二酸-苯甲酸鈉緩沖液備用。量取TritonX-305 10ml加入到50ml 二甲亞砜中，充分?jǐn)嚢杌靹?，再加?.05g鄰苯三酚紅，攪拌至完全溶解，加入到丁二酸-苯 甲酸鈉緩沖液中，再依次加入〇. 〇24g鉬酸鈉、2.78g草酸鈉。
[0020] 有關(guān)腦脊液和尿蛋白液體單檢測試劑盒準(zhǔn)確度的實(shí)驗(yàn) 根據(jù)各實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3和比較例的要求設(shè)定自動生化儀參數(shù)，使用朗道校 準(zhǔn)品定標(biāo)，檢測朗道質(zhì)控品濃度，每個質(zhì)控品測3次。CSF濃度檢測結(jié)果見表1。
[0021] 表 1
從表1中可以看出，實(shí)施例測定值比比較例測定值更接近靶值，當(dāng)不加入2-甲酰-1，1-二甲基肼時，測值明顯偏低，而鄰苯三酚紅的溶解不當(dāng)會導(dǎo)致測值偏高，重復(fù)性差，說明本 試劑盒測定腦脊液和尿蛋白比現(xiàn)有試劑具有更好的精確度。
[0022] 通過校準(zhǔn)后，測定同一尿液樣本，測10次，通過檢測10次的濃度結(jié)果求得平均值、 SD值，算出CV值。結(jié)果見表2。
[0023] 表 2
從表2數(shù)據(jù)可看出，實(shí)施例1-3對同一樣本的測定結(jié)果，重復(fù)性明顯好于比較例1-2,當(dāng) 不加入2-甲酰-1，1-二甲基肼時，CV值達(dá)到19.73%，說明本試劑測定樣本比現(xiàn)有試劑具有更 好的精確度，且結(jié)合表1和表2可看出，TritonX-305加入量在10ml時試劑精確度最高。
[0024]測定自配的線性樣本，將3g/L的牛血清白蛋白稀釋為8個濃度，每個濃度測定結(jié)見 表3〇
[0025] 表 3
表3的數(shù)據(jù)和圖1的結(jié)果可看出，實(shí)施例線性上線的測定值高于比較例，達(dá)到300mg/dl 以上，相關(guān)系數(shù)均在0.9999以上，線性提高了30%，明顯優(yōu)于比較例。
[0026] 雖然本發(fā)明已以實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明的保護(hù)范圍，任何熟 悉該項(xiàng)技術(shù)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的構(gòu)思和范圍內(nèi)所做的更動和潤飾，均應(yīng)屬于本 發(fā)明的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種腦脊液和尿蛋白液體單試劑，其特征在于，所述的試劑盒由單試劑組成： 緩沖液： 30-100mmol/L; 鉬酸鈉 0.012-0.0484g ; 鄰苯三酚紅 0.01g-0.1g ; 二甲亞砜 20-100 ml; TritonX-305 5-20 ml ； 草酸鈉 1.39-5.56 g; 2-甲酰-1，1_ 二甲基肼 0.09-0.54g。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種腦脊液與尿總蛋白檢測試劑盒，其特征在于，所述的緩沖 液，選自丁二酸-苯甲酸鈉緩沖液。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種腦脊液與尿總蛋白檢測試劑盒，其特征在于，所述的緩沖 液，pH 為 2.0-3.5。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種腦脊液與尿總蛋白檢測試劑盒的制備方法，其特征在于， 包括： 1、 在反應(yīng)容器中先加入純水，然后依次加入丁二酸，苯甲酸鈉，調(diào)節(jié)pH到2.0-3.5作為 緩沖液； 2、 量取TritonX-305加入到溶劑中，充分?jǐn)嚢杌靹颍偌尤豚彵饺蛹t，攪拌至完全溶 解； 3、 將步驟2得到的混合溶液加入到步驟1得到的混合溶液中，再依次加入鉬酸鈉、草酸 鈉、2-甲酰-1，1-二甲基肼，攪拌均勻即得。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種腦脊液與尿總蛋白檢測試劑盒的制備方法，其特征在于， 所述的試劑的制備中，用HC1調(diào)節(jié)溶液pH值。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種腦脊液與尿總蛋白檢測試劑盒的制備方法，其特征在于， 所述的HC1的濃度為4M。7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種腦脊液與尿總蛋白檢測試劑盒的制備方法，其特征在于， 所述的溶劑為二甲基亞砜。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種腦脊液和尿蛋白液體單試劑檢測試劑盒及其制備方法，屬于體外診斷試劑領(lǐng)域。解決現(xiàn)有的腦脊液和尿蛋白液體單試劑檢測試劑盒精密度和穩(wěn)定性低,試劑污染儀器等的問題。所述的試劑盒由單試劑組成。本發(fā)明還提供一種腦脊液和尿蛋白液體單試劑檢測試劑盒的制備方法。所述試劑中使用二甲基亞砜溶解鄰苯三酚紅，溶解前，在二甲亞砜中加入TritonX-305，再加入鄰苯三酚紅，可有效消除試劑粘比色杯，避免比色杯污染，且使鄰苯三酚紅分散均勻，提高了試劑的靈敏度和精密度。所述試劑中加入2-甲酰-1，1-二甲基肼，使鄰苯三酚紅鉬與蛋白質(zhì)形成的藍(lán)紫色復(fù)合物顏色明顯變深，提高試劑靈敏度。
【IPC分類】G01N21/78
【公開號】CN105548171
【申請?zhí)枴緾N201610014684
【發(fā)明人】蘇恩本, 徐李鵬, 劉玲, 陳元安, ?，摤?
【申請人】吉林基蛋生物科技有限公司
【公開日】2016年5月4日
【申請日】2016年1月11日