專利名稱：：向試劑表面上壓電分配診斷液體的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及用于測量生物樣品中分析物數(shù)量的試劑和儀器，其通過所述分析物與試劑反應以產(chǎn)生可#:測的響應來實現(xiàn)。
背景技術：
：在含有試劑的基材上分配液體已經(jīng)開發(fā)出許多儀器來測量生物樣品中分析物的數(shù)量，所述生物樣品例如為尿液、血液、唾液或者粘液或組織提取物。通常，樣品液體被施加到含有與所述分析物反應的試劑的表面上。所述試劑產(chǎn)生可檢測的響應，測量該響應并將其與所述分析物的量相關聯(lián)。所述表面性質(zhì)上通常為親水性的或者疏水性的，例如濾紙對比于聚苯乙烯。一些裝置采用了多個表面的組合，例如尿液分析條試驗，其在疏水性的聚笨乙烯手柄頂端使用了親水性的濾紙墊。在典型的試驗中，將含有未反應試劑的條浸蘸，即完全浸入液體樣品中，然后測量所迷樣品中分析物與試劑之間的反應，所述測量通常是通過光學方法實現(xiàn)。所述未反應的試劑本身可以是水溶性或非水溶性的。它們在多孔基材內(nèi)沉積或固定并干燥。所述基材連接或者放置在承載表面上。另外，可以在測定過程中使用含有或不含試劑的液體。所述液體試劑可以在與分析物的反應之前、之后或過程中施加到已含有干燥試劑的基材表面上，通常是在樣品施加之后添加。顯然，為了成本和方便等的原因起見，樣品和試劑的體積應當盡可能的小。較不明顯的是，當施加少量液體試劑或生物樣品到含有試劑的表面上時，通常難以得到均勻而準確的響應。在反應區(qū)域較小且存在較少的分析物時，分析物與試劑的反應降低。所述基材可用來放大所述反應的響應。膜，例如薄膜，可以用親和性試劑固定以便閱讀區(qū)中反應物的捕獲和濃縮。在合意的方向(例如橫向而非縱向)引導液體流動由于增加了液體樣品或試劑與反應區(qū)之間流體交換的數(shù)量而能夠提高效率。每次交換使得分析物發(fā)生進一步的反應，從而放大了所述信號。所述基材表面的改性使得試劑能夠在反應區(qū)被分離。此外，所述表面本身的性質(zhì)也可用于提高分析物的反應4性，例如通過增加試劑的溶解性或者促進在所述表面上與試劑的反應來實現(xiàn)。大多數(shù)生物樣品和液體試劑具有顯著的水含量，因此相容于親水性基材而不容于疏水性表面。當所述樣品和試劑液體分配時會快速散布在親水性基材上而被疏水性基材所排斥。在所述表面上分配液體與試劑之間的接觸通過直接分配到反應區(qū)域或部分反應區(qū)域上而實現(xiàn)。然而，當基材相對疏水時，所分配的液體會在所述基材表面上形成液珠以試圖最小化其與所述表面的接觸，從而其不會均勻散布在所述試劑上。與分配液體有關的另一難題是干燥試劑在性質(zhì)上可能是水溶性的或非水溶性的。非水溶性的干燥試劑可能不容易被所述液體樣品達到，而水溶性的試劑可能溶解并隨液體在所述基材上一起移動。理想的是所述試劑應當均勻接觸樣品，因為所述試劑與樣品的可測量的響應，例如顯色，應當均勻以便獲得所述樣品中分析物數(shù)量的準確讀數(shù)。與獲得在表面上被分配的液體與試劑之間的良好接觸有關的另一問題涉及所述樣品的物理性質(zhì)。其物理性質(zhì)如表面張力、粘度、總固體含量、顆粒大小和附著力是有所變化的。因此，其不容易以一致的體積均勻地沉積在被試劑覆蓋的基材上。同樣，隨著液體樣品量的減少，將一致量的具有變化性質(zhì)的樣品施加到試劑上變得越來越困難。相反，噴墨打印等等就依賴于為這種用途開發(fā)出的且具有一致物理性質(zhì)的液體。液滴的沉積是常見的操作。實例包括噴墨打印機，壓電或氣泡致動的，所述噴墨打印機由包含幾飛升(femtoliter)到幾十納升的直徑大約2到300pm(通常為50|tim)的多個小液滴的受控沉積來形成印跡。已經(jīng)提出了沉積小液滴的其它方法，盡管其與典型的噴墨打印機有所不同，但通常采用壓電原理來形成液滴。其實例見于美國專利US5063396,5518179，6394363和6656432中。通過注射器型移液管沉積較大的液滴(3-100|liL)已知可在診斷系統(tǒng)中再現(xiàn)。這種移液管產(chǎn)生約2至6mm的單個液滴直徑。這種移液管系統(tǒng)的商用實例為CLINITEKALTAS⑧尿檢分析儀。液滴大小可以為大于或小于噴嘴的大小，這取決于噴嘴的形狀、泵的類型以及所施加的壓力。當液體樣品以液滴的形式被分配到包含試劑的墊上時，特別地觀察到了上面所討論的問題。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當樣品以液滴的形式添加而不是通過將試劑墊浸入(浸漬)到樣品液體中來完全覆蓋所述試劑墊時，所述墊的表面與試劑間的相互作用會形成不準確的響應。當基材的疏水性過強時，3至lOO)aL數(shù)量級的大液滴不會轉(zhuǎn)移到試劑中而是在表面上形成氣泡。如果表面是親水性的，則其又會以過多的流體覆沒(overwhelm)所述試劑。幾飛升至幾十納升的4交小液滴當^皮沉積在疏水性過強的基材上時也會產(chǎn)生問題，這是因為其不具有完全覆蓋所述表面積的體積，而會以不均勻的圖案隨機聚集。小液滴還允許了使水溶性試劑遷移的開放空間。這些微小液滴還傾向于發(fā)生液體蒸發(fā)且形成氣溶膠，這被認為是具有生物危害性的，如果所述氣溶膠包括尿液或血液樣品的話。因此，如果液體以液滴的形式沉積在測試墊上而不是將墊浸漬在樣品中，則需要改進。在所分配的液體與試劑之間完全接觸后，可采用多種方法中的一種來讀取結果。通常采用光學方法，其依賴于光譜圖像以產(chǎn)生響應。為了成為有用結果，結果必須是可再現(xiàn)的。光學測量受到被觀察的試劑區(qū)域的影響且所允許的被分配液體與試劑發(fā)生反應的時間的影響。視野內(nèi)不均勻區(qū)域的形成和反應時間量的變化會增大誤差。例如，對不均勻地橫越基材散布的樣品或試劑進行的測量在每次讀取時會給出不同的結果。在作為U.S.2006/0263902A1公布的共同未決美國專利申請11/135928中，發(fā)明人報道了其以微小液滴形式沉積生物流體和試劑到載有試劑的基材上的方法，所述申請與本申請共同被轉(zhuǎn)讓。他們證明載有試劑的基材取決于所述試劑的水溶性和所述基材的表面能(即，取決于所述載有試劑的基材是親水性的或是疏水性的)而表現(xiàn)不同。相比于在載有試劑的表面上沉積大約50pL至1jxL的小液滴時，沉積大液滴，例如1.7-20.4|liL,表現(xiàn)出具有較不準確的結果。發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)小液滴被所述疏水性基材所吸收，而大液滴則不容易被吸收。當在載有試劑的表面上散布時，水溶性試劑表現(xiàn)出被溶解并與液體一起移動。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，這種移動所造成的不均勻的試劑響應會通過沉積小液滴所緩和。沉積小液滴可以通過具有許多小開口的噴嘴或者通過單個噴嘴來實現(xiàn)，所述噴嘴可以相對載有試劑的基材移動，或反之亦然，以覆蓋預定的區(qū)域。液體樣品與試劑在所述基材上的反應可以讀作為樣品覆蓋區(qū)域的平均值，或者優(yōu)選地通過一次一點地掃描反應區(qū)域再取結果的平均值。在對已公布申請2006/0263902A1中所描述的方法的進一步開發(fā)過程中，發(fā)現(xiàn)了一些問題，這導致了以下描述的改進方法的產(chǎn)生。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，即使在通過適當?shù)姆峙溲b置設計已克服了剛才所討論的問題之后，測量生物樣品中分析物的量可能也不會具有人們所需要的再現(xiàn)性。小樣品體積從反應中產(chǎn)生的響應降低，而用液體試劑稀釋樣品放大了所述問題。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，這些問題可以被克服，使得結果的準確性和再現(xiàn)性顯著提高。特別地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過以定時的量和模式(pattern)來分配液滴可以獲得改進的結果。發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明一方面涉及用于測定包含在生物流體中的分析物量的改進方法。所述方法包括以直徑在0.05至lmm范圍的液滴的形式將生物流體樣品的兩個或更多個級分(fraction)分配到包含試劑的多孔基材上或其附近。所述樣品級分分配預定的時間段，其由不進行分配的時間段所隔開。這種過程使得生物流體與試劑之間發(fā)生反應，允許其他液體的分配，或者使得能夠讀取已經(jīng)發(fā)生的反應的結果。備選地，可以將生物流體分配到基材上，接著以小液滴的形式分配試劑預定的時間段，其由不進行分配的時間段所隔開。具體實施例方式定義本文所^使用的以下術語定義如下"光譜圖像"是指包含試劑的區(qū)域?qū)Τ练e在該包含試劑的區(qū)域上的生物樣品的光學響應的詳細視圖，例如利用顏色、反光度、透光度或吸光度或其它方面的變化，如拉曼光譜、熒光、化學發(fā)光、磷光或電化學獨立圖譜，所述詳細視圖使得能夠?qū)φ麄€包含試劑的區(qū)域的亞單位進行檢查。所述圖像可以是多維的，其中添加了光學響應的位點(即x-y)。"親水性"表面是在該表面與被置于其上的水滴之間具有小于90。的接觸角的那些表面。"疏水性"表面是在該表面與被置于其上的水滴之間具有90?；蚋蠼佑|角的那些表面。"品質(zhì)因數(shù)(FOM)，，是一種性能的計算量度，其中將從存在和不存在分析物的樣品中獲得的結果之間的平均差除以標準偏差平方和的平方根，所述結果對比了無分析物的樣品與含有可檢測的最低分析物濃度的樣品。"變異系數(shù)(CV)"是一種可能性分布的離散性的量度，其計算為一組數(shù)據(jù)的標準偏差除以所述數(shù)據(jù)的平均值的比例。液體與多孔基材的相互作用本發(fā)明提供了對在所述表面上和多孔基材("墊")內(nèi)發(fā)生的反應的改良控制，所述表面上和基材內(nèi)包含干燥的試劑。所述反應得自樣品液體與包含試劑的墊之間的相互作用。當含有未知量的分析物的液體樣品接觸包含試劑的墊時，所迷液體必須溶解所述試劑以使與分析物的反應能夠發(fā)生，其產(chǎn)生了可檢測的結果，例如獨特的光學信號如顏色，這可通過光i普學手段測得。反應發(fā)生的速度和結果可檢測的程度受到多種因素的影響。這些因素包括試劑的可達性、其在液體中的溶解度、以及液體所放置的區(qū)域中試劑和液體的相對量。例如，如果單滴的液體局限在小區(qū)域的話，其可能是有效的，這樣其就能夠溶解所需量的試劑并獲得可檢測的結果。然而，如果所述液滴跨大的區(qū)域散布，所述試劑則可能不會有效的溶解，而反應可能不會產(chǎn)生可檢測的結果。因此，如果想獲得一致而準確的結果的話，在多孔墊上均勻和足夠地沉積液體十分重要。同樣，墊的性質(zhì)，例如其疏水性/親水性、其孔隙度和毛細度、以及其厚度也是決定測定結果的因素。在實踐中，本領域技術人員發(fā)現(xiàn)設計實用的測定系統(tǒng)時，墊本身、試劑和樣品液體的物理性質(zhì)都必須考慮到。在本發(fā)明中，定時施加樣品液體，以及其它液體(如果使用的話)，提供了對液體與包含試劑的墊之間相互作用的改良控制，從而使得提高了準確度和結果的均勻性。沉積液體樣品在許多測定中，將試劑放置于多孔基材或"墊"中，并將所述條形的基材浸入被測試的生物流體中。盡管這種測定很實用，但其不能如人們所期望的那樣具有必要的準確度或再現(xiàn)性。之前證明沉積大的樣品液滴(即至20.4pL)不如將測試條浸入液體效果好。然而，小液滴(即50pL至lpL)在生物測試陣列中具有優(yōu)良的結果。之前已描述過兩類分配噴嘴。第一種采用了單個噴嘴來分配一系列單個液滴到包含試劑的基材上。所述噴嘴或基材將移動以在合意的區(qū)域提供均勻的覆蓋。第二類噴嘴采用了鉆有一連串孔的板，這樣一次可以分配多個系列的液滴。在兩種類型中，最小的液滴尺寸被認為有大約50pL，這與大約45-50nm的孔直徑有關。所述噴嘴可以通過來自各種來源的壓力所操控。采用壓電促動器是分配所述小液滴的一種優(yōu)選方法。分配問題盡管以小液滴的方式分配生物流體樣品改進了測定性能，但已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，所述墊上樣品液體和試劑之間的反應通常會產(chǎn)生與將所述墊浸入樣品的方式相比強烈程度較次的結果。通過沉積較大量的樣品可以克服上述問題，但這需要較長的分配時間并使用較大的面積。由于本方法的目的是獲得較好結果的同時以較短的時間和使用較少的試劑，故仍需尋找改進的方法。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在一些類型的測定中，以一系列小液滴的形式施加生物流體會影響反應動力學。也就是說，液體到達試劑受到了不利的影響，因此在分配所述樣品之后而能夠讀出結果之前的時間段加長了。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，成組地分配小的樣品液滴，間隔以不分配液滴的時間，提高了光學響應例如顏色的顯現(xiàn)，所述響應得自樣品液體中的分析物和多孔基材中的試劑之間的反應。該方法在以下實施例中說明。實施例1采用能夠測量過氧化性活性物質(zhì)的試劑來進行血紅蛋白的測定，如U.S.5318894中所記載，所述試劑沉積在作為基材的纖維素濾紙上。將含有0.045mg/dL血紅蛋白的尿液或磷酸鹽緩沖液的樣品通過毛細壓電分配器以500個100pL液滴一組按每秒85000滴的速率沉積，并間隔以0.75到3秒的短暫時間間隔。通過CCD相才幾測量顯色，通過適當?shù)能浖x取并以反射率(R)的形式報告。較低的反射率指示較強的顯色。所迷結果列于下表中。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>，指示劑或產(chǎn)生信號的試劑是非水溶性的四曱基聯(lián)苯胺，分析物在與其它成分的催化反應之后以mM的量測得。同樣，通常發(fā)現(xiàn)使用多孔壓電分配器會給出比利用單噴嘴分配器更好的結果。當以一系列液滴組的形式分配樣品液體時，在分配暫停的時間間隔期間讀取試劑-分析物反應成為了可能。這樣做提供了優(yōu)化讀取的機會。如以下實施例中所示，增加的讀取可提高結果的準確度，特別是當樣品流體中分析物的量很低時更是如此。實施例2用U.S.5424215中記載的試劑來進行磷酸鹽緩沖液或尿液中的蛋白質(zhì)的測定，所述試劑沉積在玻璃、纖維素、聚合物基材上。將含有0-1000mg/dL白蛋白作為所迷蛋白質(zhì)的磷酸鹽緩沖液或尿液樣品通過毛細壓電分配器以500個100pL液滴一組和每秒60000滴的速率沉積，并間隔以15-120秒的時間間隔。所述樣品流體含有在0-10mg/dL到300-1000mg/dL蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)的五種蛋白質(zhì)濃度。所述結果列于下表中，其中對每個讀取期間通過CCD相機測量值來計算和用適當軟件解讀品質(zhì)因數(shù)(FOM)。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>所述FOM值指示了在被測試分析物(蛋白質(zhì))濃度下的結果的相對準確度。較高的FOM是更合意的。從這些數(shù)據(jù)可以推出，當分析物濃度為低到中時，分配期間之間有較長的時間間隔會提供更準確的結果。然而，當分析物濃度高時，延長分配期間之間的間隔效果并不好，較短的時間間隔就能令人滿意。在共同受讓的專利申請US2006/0263902A1中，表明在對葡萄糖含量的尿液分析中，當尿樣后接著分配等體積的pH6.5的磷酸鹽緩沖液時品質(zhì)因數(shù)有所提高。所述提高據(jù)認為與樣品的稀釋有關，因為氯化物成分抑制了葡萄糖試劑的反應。該結果在以下實施例所報道的實驗中加以進一步檢驗。實施例3用U.S.3814668中所記載的試劑來進行尿液中葡萄糖的測定，所述試劑沉積在纖維素紙上。將含有0-2000mg/dL葡萄糖的尿液樣品以僅只是250個液滴(50pL)的形式或者伴隨以50pL水滴的形式按每秒85000滴的速率分配。通過CCD相機測量結果，通過適當?shù)能浖x取。結果列于下表中。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>從這些結果可以推出，尿樣用水稀釋給出了與單獨用水作為葡萄糖的載體所獲得的相比實質(zhì)上相同的結果。然而，在尿樣之間比重的影響很大。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在先分配尿樣接著是稀釋液的其它實驗中，給出了比先分配稀釋液再是樣品更好的結果。實施例4用U.S.5424215中記載的試劑來實施磷酸鹽緩沖液或尿液中的蛋白質(zhì)的干燥試劑墊，只不過省略了所述白蛋白指示劑染料。通過將3mM的白蛋白指示劑染料溶解在80%的乙醇-水來制備液體染料溶液。將所述干燥試劑墊樣品浸入含有0-1000mg/dL白蛋白的尿樣中，用尿樣覆蓋整個墊區(qū)域。將所述墊放進讀取裝置中，并將所述液體染料溶液通過毛細壓電分配器以四組500滴100pL—組的液滴按每秒60000滴的速率沉積，并間隔以15秒的時間間隔。用一個新墊進行第二次測試，不過所述染料溶液通過毛細壓電分配器以2000個100pL液滴一組按每秒60000滴的速率沉積，之間沒有間隔不分配溶液的時間。所述結果列于下表中，其中對每個讀數(shù)期間通過用CCD相機測量值來計算和適當軟件來解讀品質(zhì)因數(shù)(FOM)。FOM<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>所述FOM值指示了在被測試分析物(蛋白質(zhì))濃度下的結果的相對準確度。較高的FOM是更合意的。從這些數(shù)據(jù)可以推出，使用間隔時間提高了數(shù)據(jù)并且所述樣品可以被放在墊上而只有液體試劑被分配。如該實施例中所示，以增量的方式分配生物樣品，間隔以不分配樣品的時間，允許了與所述試劑在所迷基材上的反應時間，從而造成了顏色或其它可檢測結果生成的提高。也就是說，一次性分配所有的生物樣品的效率較低?？梢酝普?，提高的結果與使用非常小的液滴(即0.1至lmm直徑)有關，其與包含試劑的基材的反應看上去與更常規(guī)的大液滴或?qū)⒒慕肷飿悠分械姆绞讲煌?。這種信號生成的增加對于分析物濃度很低的情況來說很重要。同時發(fā)現(xiàn)，沉積'j、液滴使液體樣品局限在所述基材的表面上從而可以看到可區(qū)分的點，并用不反應的區(qū)域隔開。這并不需要對于肉眼來說可見，而是通過在這些實施例中用來提供所述基材表面的光語圖像的CCD相機可以看見。發(fā)現(xiàn)所述不反應的區(qū)域具有預料不到的優(yōu)點。他們提供了參比顏色，這被CCD相機所檢測到并使得對可檢測結果的更準確讀取成為可能，因為與未反應區(qū)域的對比在光譜圖像中可即刻獲<曰付。盡管所使用的基材類型將依賴于所進行的測定，但顯然這種基材可用于各種形式，包括條、盒、卡片等等。所有這些形式都具有包含試劑的基材，其經(jīng)定位以接收以圖案形式直接分配到所述基材上的小液滴(O.l至lmm直徑)，該圖案提供反應表面的光譜圖像。權利要求1、在測定生物流體中分析物的量的方法中，其中從噴嘴中以直徑在大約0.05至1mm范圍的液滴的形式分配所述生物流體的樣品到包含試劑的多孔基材上或其附近，并讀取所述被分配的生物流體和所述試劑之間的反應結果，改進包括以所述生物流體樣品的兩個或更多個級分的形式分配所述生物流體樣品到所述包含試劑的基材上，所述級分以預定的量分配預定的時間段，所述預定的時間段由不分配所述生物流體樣品的時間間隔所隔開。2、權利要求1的方法，其中所述不分配所述生物樣品的時間間隔用于分配與所述生物流體樣品的所述級分不同的液體。3、權利要求2的方法，其中所述不分配所迷生物樣品的時間間隔用于分配液體稀釋劑。4、權利要求2的方法，其中所述不分散所述生物樣品的時間間隔用于讀取所述沉積的生物流體與所述試劑之間的反應結果。5、權利要求1的方法，其中所述生物流體樣品的所述兩個或更多個級分為三個或更多個級分。6、權利要求1的方法，進一步包括在步驟(a)之前分配液體稀釋劑或試劑的步驟。7、權利要求1的方法，其中所述不分配所述生物樣品的時間間隔用于分配其它試劑。8、權利要求l的方法，其中所述生物流體是尿液。9、權利要求9的方法，其中所述分析物是血紅蛋白或蛋白質(zhì)或葡萄糖。10、提高測定生物流體中分析物量的準確度和再現(xiàn)性的方法，包括(a)將所述生物流體的樣品以所述樣品的兩個或更多個級分的形式分配到包含試劑的多孔基材上，所述級分以預定的量作為小液滴分配預定的時間段，所述時間段由不分配所述生物流體樣品的時間間隔所隔開；以及(b)讀取所述被分配的生物流體和所述試劑之間的反應結果。11、權利要求10的方法，其中所述不分配所述生物樣品的時間間隔用于分配與所述生物流體樣品的所述級分不同的液體。12、權利要求11的方法，其中所述不分配所述生物樣品的時間間隔用于分配液體稀釋劑。13、權利要求11的方法，其中所述不分配所述生物樣品的時間間隔用于分配其它試劑。14、權利要求11的方法，其中所述不分配所述生物樣品的時間間隔用于讀取所述沉積的生物流體與所述試劑之間的反應結果。15、權利要求10的方法，其中所述生物流體樣品的所述兩個或更多個級分為三個或更多個級分。16、權利要求10的方法，進一步包括在步驟(a)之前分配液體稀釋劑或試劑的步驟。17、權利要求10的方法，其中所述小液滴具有大約0.05到lmm范圍的直徑。18、權利要求10的方法，其中所述生物流體是尿液。19、權利要求18的方法，其中所述分析物是血紅蛋白或蛋白質(zhì)或葡萄糖。20、提高測定生物流體中分析物量的準確度和再現(xiàn)性的方法，包括(a)將所述生物流體的樣品分配到多孔基材上；(b)以所述生物流體的兩個或更多個級分的形式分配與所述生物流體反應的試劑，所述級分以預定的量分配預定的時間段，所述預定的時間段由不分配所述試劑的時間間隔所隔開；(c)讀取所迷生物流體和所述試劑之間的反應結果。全文摘要一種測定，其中生物流體樣品被分配到包含試劑的多孔基材上，該測定通過以生物流體樣品的兩個或更多個級分的方式來分配所述生物流體，并由不分配生物流體的時間間隔所隔開，提高了所述測定的準確度和再現(xiàn)性。試劑和其它流體可以在所述不分配生物流體的時間間隔期間被分配。備選地，試劑和其它流體可以以類似的方式分配到已經(jīng)包含了生物流體的基材上。文檔編號G01N35/10GK101688876SQ200880014470公開日2010年3月31日申請日期2008年3月14日優(yōu)先權日2007年5月2日發(fā)明者J·A·普羅菲特,M·J·普日亞申請人:西門子醫(yī)療保健診斷公司