一種檢測(cè)飼料中抗生素殘留的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種檢測(cè)飼料中抗生素殘留的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 在動(dòng)物飼料中添加少量的抗生素能夠有效預(yù)防動(dòng)物疾病，并且，某些抗生素還能 夠促進(jìn)動(dòng)物生長。但如果食用過量的抗生素就會(huì)容易在動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生殘留，從而影響到動(dòng) 物食品的安全性。因此，目前很多國家都嚴(yán)格規(guī)定了飼料中抗生素的使用劑量，同時(shí)還對(duì)使 用抗生素的種類作了限制。我國農(nóng)業(yè)部發(fā)布了《允許作飼料藥物添加劑獸藥品種及使用規(guī) 定》，允許用作飼料添加劑的抗生素品種有15種，并分別對(duì)適用動(dòng)物、最低用量、最高用量及 停藥期作了嚴(yán)格規(guī)定，但由于獸藥管理工作跟不上，實(shí)際生產(chǎn)中抗生素的使用品種比規(guī)定 要多，使用量普遍也較大，而且基本沒有執(zhí)行停藥期，特別在蛋雞的產(chǎn)蛋期，按要求是嚴(yán)格 限制使用抗生素的，但據(jù)了解，在產(chǎn)蛋期使用抗生素是普遍存在的。因此，對(duì)飼料進(jìn)行抗生 素殘留檢測(cè)對(duì)保證食品安全具有重要意義。
[0003] 目前，對(duì)抗生素殘留檢測(cè)主要有酶聯(lián)免疫法和高效液相色譜法。運(yùn)些檢測(cè)方法都 設(shè)及到樣品前處理步驟，需要從飼料中提取出抗生素。由于，飼料中含有膳食纖維、脂肪、糖 類等成分，萃取時(shí)有機(jī)相與水相的界面不清，乳化狀態(tài)很嚴(yán)重。采用常規(guī)的化學(xué)試劑并不能 完全萃取出其中的抗生素成分，從而造成檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度不高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是針對(duì)上述【背景技術(shù)】中存在的某些和某個(gè)問題，提供一種檢測(cè)飼料 中抗生素殘留的方法。
[0005] 根據(jù)本發(fā)明的檢測(cè)飼料中抗生素殘留的方法，包括W下步驟：
[0006] (1)利用粉碎機(jī)將飼料加水制成勻漿液，稱取3-5g勻漿液于離屯、管中，加入0.3-〇.5g的破乳劑，超聲振蕩15-30分鐘后，加入10-20mL甲醇，分散均勻后，加入10-30mL的憐酸 鹽緩沖溶液，超聲提取10-20分鐘，離屯、后，移取5mL上清液，加5mL憐酸鹽緩沖溶液混勻后， 待凈化；
[0007] (2)將步驟（1)中的待凈化液轉(zhuǎn)移至固相萃取柱中，依次用5mL水，5mL甲醇水溶液 淋洗，棄去流出液，減壓抽干后，用5mL甲醇洗脫，收集洗脫液。在50°C水浴中用氮?dú)獯抵两?干，加入5mL乙臘水溶液，在滿旋混合器上混合后，過微孔濾膜后濾液待測(cè)；
[000引（3)用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定和確證，外標(biāo)法定量。
[0009] 破乳劑是一種表面活性物質(zhì)，它能使乳化狀的液體結(jié)構(gòu)破壞，W達(dá)到乳化液中各 相分離開來的目的。破乳劑可W是化學(xué)破乳劑，例如聚氧乙締聚氧丙締聚酸或聚氧乙締聚 氧丙締十八醇酸；也可W是生物破乳劑，例如含芽抱桿菌的生物破乳劑?；瘜W(xué)破乳劑成本 低、保質(zhì)期長。生物破乳劑需冷凍保存，但破乳效果通常要優(yōu)于化學(xué)破乳劑。
[0010] 在本發(fā)明的檢測(cè)方法中，在樣品前處理步驟中，加入一定量的破乳劑來消除乳化 現(xiàn)象，促使飼料中的膳食纖維、脂肪、糖類與抗生素有效分離，提高樣品中抗生素的溶出率。 再與合適的萃取劑配合，在合適的pH值條件下，提取出飼料中的抗生素。從而在源頭上保證 了最終檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的檢測(cè)飼料中抗生素殘留的方法，能夠有效提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性， 為食品安全提供有益保障。
【具體實(shí)施方式】
[0012] 下面通過具體實(shí)施例詳細(xì)描述檢測(cè)飼料中抗生素殘留的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng) 當(dāng)理解，下面描述的實(shí)施例僅是對(duì)本發(fā)明的示例性說明，而非用于對(duì)其作出任何限制。
[0013] W經(jīng)初步篩查（例如微生物抑制試紙法)含有抗生素的雞飼料為樣品，檢測(cè)其5種 橫胺類抗生素藥物(橫胺二甲基喀晚、橫胺喀晚、橫胺對(duì)甲基喀晚、橫胺甲基異嗯碰、橫胺哇 嗯嘟)殘留的具體含量，來介紹本發(fā)明的實(shí)施過程和效果。
[0014] 1.樣品液A制備
[001引1.1提取步驟
[0016] 利用粉碎機(jī)將雞飼料加水制成勻漿液，稱取5g勻漿液于離屯、管中，加入0.3g的聚 氧乙締聚氧丙締聚酸，超聲振蕩30分鐘后，加入20mL甲醇，分散均勻后，加入30mL的憐酸鹽 緩沖溶液，超聲提取20分鐘，經(jīng)7000r/min離屯、10分鐘后，移取5mL上清液，加5mL憐酸鹽緩沖 溶液混勻后，待凈化；
[0017] 1.2純化步驟
[001引將步驟1.1中的待凈化液轉(zhuǎn)移至化B固相萃取柱中，依次用5mL水，5mL甲醇水溶液 淋洗，棄去流出液，減壓抽干后，用5mL甲醇洗脫，收集洗脫液。在50°C水浴中用氮?dú)獯抵两?干，加入5. OmL乙臘水溶液，在滿旋混合器上混合后，過0.22微米的微孔濾膜后濾液待測(cè)。
[0019] 上述步驟中，憐酸鹽緩沖溶液濃度為O.lmol/L，制備過程為:溶解12.?憐酸二氨 鋼于950血水中，用0.1 mo 1/L氨氧化鋼溶液調(diào)節(jié)抑值至8.0，最后用水稀釋至IL。甲醇水溶液 中甲醇與水的體積比為3: 7。乙臘水溶液中乙氯與水體積比為2: 8。
[0020] 2.樣品液B制備
[0021] 為了對(duì)比，在上述制備樣品液A的步驟1.1中不加入聚氧乙締聚氧丙締聚酸，其它 步驟完全與樣品液A相同。
[0022] 3.標(biāo)準(zhǔn)液制備
[0023] 準(zhǔn)確稱取適量各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（橫胺二甲基喀晚、橫胺喀晚、橫胺對(duì)甲基喀晚、橫胺甲 基異嗯座、橫胺哇嗯嘟)分別置于50mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成濃度為lOmg/L 的儲(chǔ)備液。
[0024] 用乙臘水溶液將儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋得到橫胺二甲基喀晚、橫胺喀晚、橫胺對(duì)甲基喀 晚、橫胺甲基異嗯爐、橫胺哇嗯嘟為 l〇yg/L、20iig/L、50iig/L、100iig/L、200iig/L、400yg/L、 800iig/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。
[0025] 4.液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)
[0026] 4.1液相色譜的工作條件
[0027] a)色譜柱：Cl8柱，1 OOmm X 2. lmm(i .d.)，5皿。
[002引 b)流動(dòng)相:A:乙臘，B: 0.2%甲酸溶液，梯度洗脫，梯度條件見表1。
[0029](：)柱溫：30。(3。
[0030] d)進(jìn)樣量：10化。
[0031] 表1梯度洗脫程序表
[0033] 4.2串聯(lián)質(zhì)譜工作條件
[0034] a)電離方式:電噴霧電離，正離子模式；
[0035] b)噴霧電壓:3.0kV;
[0036] C)霧化溫度:300°C;
[0037] d)毛細(xì)管溫度:350°C;
[003引 e)銷氣壓力：SOArKlArb = Ipsi);
[0039] f)輔助氣壓力：20Arb( IArt = O.化/min);
[0040] g)碰撞氣、銷氣和輔助氣:氣氣(99.999%);
[0041] h)掃描模式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式，5種橫胺類抗生素的質(zhì)譜參數(shù)見表2。
[0042] 表2質(zhì)譜參數(shù)
[0044] *定量離子
[0045] 4.3測(cè)定步驟
[0046] 先對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液按濃度由低到高進(jìn)行檢測(cè)，W定量離子峰面積對(duì)質(zhì)量濃度作 圖，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。
[0047] 在對(duì)樣品液進(jìn)行檢測(cè)，得到的離子峰面積與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照得到各抗生素的濃度。 樣品液檢測(cè)次數(shù)為5次，取平均值為結(jié)果。
[004引如果樣品液中有組分的響應(yīng)值超過標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍，則稀釋后再進(jìn)樣測(cè)定。 [0049]測(cè)試結(jié)果如表3所示。
[0050]表3樣品液中5種橫胺類抗生素含量檢測(cè)結(jié)果
[0053] 上述結(jié)果顯示，樣品液B中檢測(cè)出的各種抗生素含量均大于樣品液A中的含量，特 別對(duì)于在樣品A中未檢出的橫胺對(duì)甲基喀晚和橫胺甲基異嗯經(jīng)，卻在樣品液B檢測(cè)出微小含 量。從而表明，在樣品液的提取過程中，加入一定量的破乳劑進(jìn)行破乳處理，抗生素的提取 率能夠提高20% W上，大大提高了飼料中抗生素殘留檢測(cè)的準(zhǔn)確度。
[0054] 上述實(shí)施例W經(jīng)初步篩查含有抗生素的雞飼料為樣品進(jìn)行檢測(cè)，僅為了更好地理 解本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，本發(fā)明的檢測(cè)方法可W適用于未經(jīng)初步篩查的各類 動(dòng)物飼料。檢測(cè)項(xiàng)目也不限于橫胺類抗生素，也可W是檢測(cè)其它種類的抗生素。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種檢測(cè)飼料中抗生素殘留的方法，包括以下步驟： (1) 利用粉碎機(jī)將飼料加水制成勻漿液，稱取3-5g勻漿液于離心管中，加入0.3-0.5g的 破乳劑，超聲振蕩15-30分鐘后，加入10-20mL甲醇，分散均勻后，加入10-30mL的磷酸鹽緩沖 溶液，超聲提取10-20分鐘，離心后，移取5mL上清液，加5mL磷酸鹽緩沖溶液混勻后，待凈化； (2) 將步驟（1)中的待凈化液轉(zhuǎn)移至固相萃取柱中，依次用5mL水，5mL甲醇水溶液淋洗， 棄去流出液，減壓抽干后，用5mL甲醇洗脫，收集洗脫液。在50°C水浴中用氮?dú)獯抵两?，?入5mL乙腈水溶液，在渦旋混合器上混合后，過微孔濾膜后濾液待測(cè)； (3) 用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定和確證，外標(biāo)法定量。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)飼料中抗生素殘留的方法，所述破乳劑聚氧乙烯聚氧丙 烯聚醚或聚氧乙烯聚氧丙烯十八醇醚。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)飼料中抗生素殘留的方法，所述固相萃取柱為HLB萃取 柱。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)飼料中抗生素殘留的方法，所述微孔濾膜規(guī)格為0.22μπι。
【專利摘要】一種檢測(cè)飼料中抗生素殘留的方法，包括以下步驟：(1)利用粉碎機(jī)將飼料加水制成勻漿液，稱取勻漿液于離心管中，依次加入破乳劑、甲醇、以及磷酸鹽緩沖溶液，超聲提取，離心后，得到待凈化液；(2)將待凈化液轉(zhuǎn)移至固相萃取柱中，進(jìn)行凈化，收集洗脫液。在水浴中用氮?dú)獯抵两桑尤胍译嫠芤?，在渦旋混合器上混合后，過微孔濾膜后濾液待測(cè)；(3)用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定和確證，外標(biāo)法定量。根據(jù)本發(fā)明的檢測(cè)飼料中抗生素殘留的方法，能夠有效提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，為食品安全提供有益保障。
【IPC分類】G01N30/88, G01N30/06
【公開號(hào)】CN105527366
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510867197
【發(fā)明人】趙林萍
【申請(qǐng)人】趙林萍
【公開日】2016年4月27日
【申請(qǐng)日】2015年12月1日