甲萘威膠體金試紙條的制備及使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于食品安全檢測領(lǐng)域，具體涉及食品中甲萘威藥物殘留的一種快速膠體金試紙條的制備及使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002]甲萘威又名西維因，一種氨基甲酸酯殺蟲劑。工業(yè)產(chǎn)品為白色固體，純品熔點142°C，在水中溶解度極小，在多數(shù)有機溶劑中溶解度不大，易溶于極性有機溶劑，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，但遇堿易分解。毒性較低，急性毒性LD50值:對大白鼠經(jīng)口為500?850mg/kg。用于稻、棉、果林茶桑等作物上的螟蟲、稻縱卷葉螟、稻苞蟲、棉鈴蟲、紅鈴蟲、斜紋夜蛾、棉卷葉蟲、桃小食心蟲、蘋果刺蛾、茶小綠葉蟬、茶毛蟲、桑尺蠖、大豆食心蟲等。
[0003]甲萘威的檢測方法有薄層色譜法，氣-質(zhì)聯(lián)機和高效液相色譜法，由于以上諸分析法樣品前處理比較復(fù)雜，操作時需專門的技術(shù)人員、檢測費用昂貴，不利于推廣應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種特異性強，靈敏度高，且操作簡單方便，對樣品經(jīng)過簡單處理即可檢測的甲萘威快速試紙半定量檢測方法。
[0005]本發(fā)明的目的可通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)
甲萘威膠體金試紙條檢測方法其技術(shù)要點是:試紙的背襯上依次貼有樣品墊和金標(biāo)墊和硝酸纖維素膜和吸水吸水紙，金標(biāo)墊上被標(biāo)記的物質(zhì)為第二種屬動物蛋白與甲萘威抗原的混合物或第二種屬動物蛋白與甲萘威抗體的混合物；硝酸纖維素膜上包被有甲萘威抗體1條作為檢測線，同時還包被有抗第二種屬動物蛋白的IgG 1條作為參考線或包被有甲萘威抗原1條作為檢測線，同時還包被有抗第二種屬動物蛋白的工IgGl條作為參考線。在試紙制備時通過調(diào)節(jié)檢測線和參考線包被物的濃度，控制檢測時檢測線和參考線的顯色深淺，并將其顯色深淺與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度對應(yīng)起來，達到半定量檢測。
[0006]所述的檢測用抗原是指甲萘威與載體物質(zhì)明膠形成的偶合物，免疫用抗原是指甲萘威與載體物質(zhì)匙孔血藍蛋白(KLH)形成的偶合物。
[0007]所述的載體物質(zhì)也可以選用其他大分子物質(zhì)，如:脂蛋白、多聚氨基酸、葡聚糖、卵清白蛋白等，但要求檢測用抗原與免疫用抗原的載體無交叉免疫反應(yīng)。
[0008]所述的第二種屬動物蛋白指非抗體來源屬動物的蛋白，例如，抗體為兔源性，則第二種屬動物蛋白可以是卵清白蛋白、豬血清白蛋白等雞、鴨或其他非兔源性動物蛋白。
[0009]本發(fā)明所描述的試紙的各部分處理與功能如下:
背襯:為一面涂有不干膠的不吸水的韌性材料，如PVC板，起固定支持試紙其他組成部分的作用；
樣品墊制備:將濾紙或玻璃纖維紙浸入pH 7.0- 8.4的PBS中約莫2 min，取出，80°C烘干或其他方式干燥，即作為樣品墊，檢測時起吸收樣品溶液的作用，便于樣品溶液向上移動； 金標(biāo)墊的制備:該部分起固定膠體金標(biāo)記的抗原或抗體的作用；
制備步驟包括膠體金溶液的制備、膠體金標(biāo)記甲萘威抗原或甲萘威抗體。
[0010](1)膠體金溶液的制備:將氯金酸(HAuC14)用超純水配制成1%的母液，取1 mL的母液，用超純水定容至100 mL,配成0.01%的溶液，加熱至沸騰，加入1 - 5 mL 1%的朽1檬酸三鈉水溶液，繼續(xù)加熱至出現(xiàn)透明的橙紅色為止，即為膠體金溶液。
[0011](2)膠體金標(biāo)記甲萘威抗原:將甲萘威抗原和第二種屬動物蛋白分別用PBS (0.01mol/L,pH 7.0-7.5)溶解稀釋至2-4 mg/mL,每100 mL膠體金溶液加入1-3 mL的2-4 mg/mL的檢測用抗原1-1.5 mL 2-4 mg/mL第二種屬動物蛋白震蕩2 min,用0.2 mol/L的K2C03,調(diào)節(jié) pH 至 8.4，震蕩 5 min 加入 11% PEG-10000 2 mL，震蕩 5 min，6000-13000r/min 離心15 min，除去上清，將沉淀用 PBS (0.01 mol/L,pH 7.0_7.5)復(fù)溶，以 8000-15000 r/min 離心15 min,除去上清，將沉淀用PBS (0.01 mol/L,pH 7.0-7.5)釋500-2000倍產(chǎn)物作為金標(biāo)記甲萘威抗原。
[0012](3)膠體金標(biāo)記甲萘威抗體:將甲萘威單克隆抗體或多克隆抗體和第二種屬蛋白分別用PBS (0.01 mol/L,pH 7.0-7.5)溶解稀釋至2-4 mg/mL，每100 mL膠體金溶液加入l-3mL 2-4 mg/mL的甲萘威抗體和1-1.5 mL 2-4 mg/mL第二種屬動物蛋白，震蕩2 min，用
0.2 mol/L 的 K2C03，調(diào)節(jié) pH 至 8.4，震蕩 5 min，加入 11% PEG-10000 2 mL，震蕩 5 min,6000-13000r/min 離心 15 min,除去上清，將沉淀用 PBS (0.01 mol/L, pH 7.0-7.5)復(fù)溶，以 8000-15000r/min 離心 15 min,除去上清，將沉淀用 PBS (0.01 mol/L, pH 7.0-7.5)稀釋500-2000倍，產(chǎn)物作為金標(biāo)甲萘威抗體。
[0013](4)金標(biāo)墊處理:將甲萘威抗原或甲萘威抗體倒入一槽中，將玻璃纖維或濾紙浸入1 min,取出，室溫干燥后，即作金標(biāo)墊。
[0014]硝酸纖維素膜制備:用0.8%的戊二醛溶液或0.2%的碳二亞胺溶液浸泡硝酸纖維膜或醋酸纖維膜或尼龍膜30 min，取出，37°C烘干，上邊包被1條不同濃度的甲萘威抗原線或甲萘威抗體線作為檢測線，同時包被1條抗第二種屬動物蛋白的工IgG線作為參考線。當(dāng)膠體金標(biāo)記部分標(biāo)記對象為甲萘威檢測用抗原和第二種屬蛋白時，檢測線則包被甲萘威抗體。此即為硝酸纖維素膜，該部分主要作用是將反應(yīng)結(jié)果以肉眼可見的顏色表征出來。
[0015]吸水紙制備:將玻璃纖維紙或濾紙或吸水紙室溫干燥后，即作為吸水部分。該部分主要作用在于將移動上來的多余的樣品溶液吸收。
[0016]試紙組裝:在背襯上依次粘貼有樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜和樣品吸收墊，即成甲萘威檢測試紙。
[0017]檢測原理:檢測原理因膠體金標(biāo)記的對象不同，而稍有差異。
[0018]當(dāng)膠體金標(biāo)記部分標(biāo)記對象為甲萘威檢測用抗原和第二種屬動物蛋白時，如果樣品中含有甲萘威，樣品