一種檢測小分子G蛋白Ras活性的方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物領(lǐng)域，特別是一種檢測小分子G蛋白Ras活性的方法及試劑合
ΙΤΓΤ.Ο
【背景技術(shù)】
[0002]ras基因一種原癌基因，因首先發(fā)現(xiàn)于大鼠肉瘤病毒而得名，其編碼蛋白為小分子G蛋白Ras。細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中，在鳥苷酸置換因子作用下，無活性的Ras-GDP可轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘腞as-GTP，通過啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的MAP激酶途徑，參與細(xì)胞增殖、分化。該基因在人類癌細(xì)胞中常發(fā)生突變。
[0003]ras基因家族與人類腫瘤相關(guān)的特征性基因有三種，S卩H-ras，K_ras和N-ras，它們分別定位于人類11、12、1號染色體上，所編碼的Ras蛋白由188或189個氨基酸組成，分子量為21 kDa。Ras蛋白具有高度特異性和同源性，尤其在氨基酸序列的前80個氨基酸殘基中，幾乎無種屬間差別，具有高度保守性。在細(xì)胞中，小分子G蛋白Ras起著分子開關(guān)的作用。在多種細(xì)胞跨膜受體傳導(dǎo)的信號通路中，活化的跨膜受體能夠引起鳥甘酸交換因子的激活，能使Ras-GDP轉(zhuǎn)換為Ras-GTP，Ras_GTP會與下游效應(yīng)因子相互作用，從而產(chǎn)生細(xì)胞應(yīng)答。GTPase活化蛋白能夠促進(jìn)GTP的水解，使Ras失活，以維持細(xì)胞自穩(wěn)狀態(tài)。因此通過GTP和⑶P的相互轉(zhuǎn)化可以有節(jié)制地調(diào)節(jié)Ras蛋白對細(xì)胞信號系統(tǒng)的開啟和關(guān)閉，以完成生長分化信號傳入細(xì)胞內(nèi)的過程。
[0004]當(dāng)ras基因發(fā)生突變成為癌基因后，其表達(dá)產(chǎn)物Ras蛋白便失去了GTP與⑶P之間轉(zhuǎn)換的控制，而變成具有組成型活性的Ras-GTP，Ras-GTP的持續(xù)激活往往導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。在膀胱癌、乳腺癥、結(jié)腸癌、腎癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、及造血系統(tǒng)腫瘤中，均檢測出了ras癌基因的異?；罨?。突變ras癌基因的種類與某些腫瘤類型密切相關(guān)，即有優(yōu)勢激活現(xiàn)象。如胰腺癌、結(jié)腸癌、肺癌等以K-ras突變?yōu)橹?，在造血系統(tǒng)腫瘤中多發(fā)現(xiàn)N-ras的突變，泌尿系腫瘤則以H-ras突變?yōu)橹?。目前的臨床數(shù)據(jù)表明，H-ras和K-ras的表達(dá)與膀胱癌、腎盂癌、肺癌、結(jié)腸癌、膽囊癌、胰腺癌、腎母細(xì)胞癌、慢性淋巴細(xì)胞白血病，黑色素瘤形成密切相關(guān)，N-ras表達(dá)水平上升主要發(fā)生在造血系統(tǒng)的惡性腫瘤中，如急性早幼粒細(xì)胞白血病、急性髓系白血病、淋巴瘤，在神經(jīng)母細(xì)胞瘤、纖維肉瘤，橫紋肌肉瘤中的表達(dá)也有一定的上升，并認(rèn)為是這些腫瘤形成的主要原因。因此，檢測ras突變后，其表達(dá)產(chǎn)物Ras蛋白(H-ras，K-ras和N-ras三種亞型)的活性對于了解腫瘤的發(fā)生發(fā)展，以及監(jiān)測惡性腫瘤的治療效果具有重大意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的發(fā)明目的之一在于提供一種小分子G蛋白活Ras活性檢測的方法，該方法能檢測病理組織或體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞系中Ras (H-ras，K_ras和N-ras)的活性水平。。
[0006]本發(fā)明的目的之二在于提供一種利用上述檢測方法檢測小分子G蛋白活Ras活性的試劑盒。
[0007]其技術(shù)解決方案如下:一種小分子G蛋白活Ras活性檢測的方法，其是根據(jù)人Rafl基因的Ras結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RBD)能夠特異結(jié)合Ras-GTP的特性，構(gòu)建GST-Rafl-RBD原核表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)誘導(dǎo)純化得到GST-Raf 1-RBD蛋白，并利用GST 口1111-(10￥11和￥6 8丨61'11-13101:方法檢測小分子G蛋白Ras活性，具體包括如下步驟:
步驟1構(gòu)建GST-Raf 1-RK)原核表達(dá)質(zhì)粒
Rafl是Ras下游的效應(yīng)因子，含有Ras結(jié)合結(jié)構(gòu)域(位于其1-140位氨基酸殘基)，可以直接結(jié)合Ras-GTP。查詢NCBI數(shù)據(jù)庫中人Rafl基因?qū)?yīng)1-140位氨基酸殘基的編碼序列，對照原核表達(dá)載體PGEX-6P-1的多克隆位點(diǎn)(圖1所示)，選擇其中的BamH I和Xho I位點(diǎn)作為酶切位點(diǎn)設(shè)計上游引物(5, -CGCGGATCCGAGCACATACAGGGAGCTTG-3,)和下游引物(5'-CCGCTCGAGGTTGTGTGTTGTGAGGGGAAC-37 )，以人肝文庫為模版，PCR擴(kuò)增得到目的片段。經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳分離后用凝膠回收試劑盒回收，回收的目的片段和PGEX-6P-1空載體分別經(jīng)BamH I和Xho I雙酶切后，再次經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳分離回收，回收的目的片段和載體以5:1的比例混合。然后用T4 DNA連接酶于16°C連接過夜，隨后用該體系轉(zhuǎn)化DH5a大腸桿菌，涂平板并挑選其中的陽性克隆，所選的陽性克隆經(jīng)過限制性內(nèi)切酶切后得到大約450bp的目的片段(圖2所示)AST-Rafl-RBD原核表達(dá)質(zhì)粒測序得到的目的片段和NCBI數(shù)據(jù)庫上的編碼序列完全一致(圖3所示)。這表明GST-Rafl-RBD原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。
[0008]步驟2GST_Raf 1-RBD融合蛋白的原核表達(dá)和純化
用上述構(gòu)建的GST-Rafl-RBD質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21大腸桿菌，按1%轉(zhuǎn)接于100 mL LB培養(yǎng)基中，37°C 180 r/min振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期(D6(x)nm=0.6);隨后按100 μΜ/L終濃度加入IPTG，20°C 180 r/min振蕩誘導(dǎo)過夜;次日4°C 4000 rpm lOmin離心收集菌液，將得到的大腸桿菌用30 mL緩沖液PB[30 mL PBS中含0.5 mM/L DTT、2 yg /ml Aprotimin、2 yg /mlLeupeptin、l mM/L PMSF、1 mM/L Na3V04、10 mM/L NaF]重懸，然后高壓破碎，隨后超聲波進(jìn)一步破碎。4°C 13000 rpm lOmin離心裂解產(chǎn)物，取上清，將預(yù)先經(jīng)過平衡的300 yL谷胱甘肽瓊脂糖凝膠珠與離心后得到的上清混合，4°C混旋轉(zhuǎn)2h，然后預(yù)冷的PB緩沖液洗滌谷胱甘肽瓊脂糖凝膠珠，利用洗脫緩沖液[5ml配方:250 yL 1M/L Tris-Cl，ph7.6、4.75mL超純水、0.0154g還原型谷胱甘肽]把GST-Rafl-RBD從凝膠珠上洗滌下來。最后利用SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)染色方法檢測純化的GST-Rafl-RBD融合蛋白(圖4所示)。
[0009]步驟3使用GST pull-down和Western-Blot方法檢測Ras的活性水平
將HEK293細(xì)胞接種于100 cm2培養(yǎng)皿，待細(xì)胞長到80%密度時，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染質(zhì)粒H-RasV12 (ras基因組成型活性形式，表達(dá)產(chǎn)物相當(dāng)于H-Ras-GTP)^^后收集細(xì)胞，先用PBS洗一次，然后用IP buffer裂解液冰上裂解細(xì)胞，12000 rpm離心10 min，取上清，留取其中20%作為對照。轉(zhuǎn)染H-RasV12的細(xì)胞上清均分為兩份，分別與偶聯(lián)了 GST空載體和GST-Rafl-RBD的谷胱甘肽瓊脂糖凝膠珠混合，置搖床上4°C混旋轉(zhuǎn)lh，4°C 6000 rpm離心，用IP裂解液洗滌三次，最后用微量進(jìn)樣器吸干Ep管內(nèi)所有剩余液體，加入30 μ? SDS-PAGE loadingbuffer，煮沸10 min，最后通過western-blot檢測目標(biāo)Ras蛋白。結(jié)果如圖5所示，其中以GST空載體作為陰性對照，GST-Raf 1-RBD能夠與HEK293細(xì)胞中表達(dá)的H-Ras-GTP發(fā)生相互作用，并且這種相互作用具有很強(qiáng)的特異性。
[0010]利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染質(zhì)粒H_RasV12(ras基因組成型活性形式，表達(dá)產(chǎn)物相當(dāng)于H_Ras-GTP)或H-RasNl 7 (ras基因組成型失活形式，表達(dá)產(chǎn)物相當(dāng)于H-Ras-GDP)到HEK293細(xì)胞中。24h后收集細(xì)胞，先用PBS洗一次，然后用IP裂解液冰上裂解細(xì)胞，12000 rpm離心10min，取上清，留取其中20%作為對照。偶聯(lián)了GST-Rafl-RBD的谷胱甘肽瓊脂糖凝膠珠分別與轉(zhuǎn)染H-RasV12的細(xì)胞上清和轉(zhuǎn)染H-RasN17的細(xì)胞上清混合，置搖床上4°C混旋轉(zhuǎn)lh，4°C6000 rpm離心，用IP裂解液洗滌三次，最后用微量進(jìn)樣器吸干Ep管內(nèi)所有剩余液體，加入30μ? SDS-PAGE loading buffer，煮沸 10 min，最后通過western-blot檢測目標(biāo)Ras蛋白。結(jié)果如圖6所示，GST-Rafl-RBD能夠與HEK293細(xì)胞中表達(dá)的H-Ras-GTP發(fā)生相互作用，但不和HEK293細(xì)胞中表達(dá)的H-Ras-GDP結(jié)合。
[0011]本發(fā)明的基本原理
小分子G蛋白Ras活性檢測試劑盒基于谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(glutath1ne S-transferase，GST)親和層析和GST pul 1-down方法。首先利用重組技術(shù)將谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶與含有Ras結(jié)合區(qū)域(Ras binding domain, RBD)的Rafl-RBD融合。GST-Rafl-RBD融合蛋白能通過GST與固相化在載體上的谷胱甘肽(Glutath1ne, GTH)親和結(jié)合，也可以通過Ras結(jié)合區(qū)域結(jié)合Ras-GTP。當(dāng)GST-Rafl-RBD融合蛋白親和結(jié)合在谷胱甘肽固化瓊脂糖凝膠珠時，該固相載體能把Ras-GTP從細(xì)胞或組織裂解液中pul 1-down下來。IP裂解液洗去未與固相載體結(jié)合的蛋白后，然后制成供SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白樣品。利用Western Blot的檢測方法，使用3種Ras亞型(H-ras，K-ras和N-ras)抗體，即可特異性檢測病理組織或細(xì)胞中3種Ras亞型的活性水平。
[0012]本發(fā)明采用的檢測方法優(yōu)點(diǎn):
1.本發(fā)明采用的檢測方法操作簡單，易于標(biāo)準(zhǔn)化。
[0013]2.本發(fā)明采用的GST-Rafl-RBD融合蛋白純度高，特異性好。
[0014]3.本發(fā)明采用的磷酸酶抑制劑混合物能很好地抑制Ras-GTP降解，從而保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性。
[0015]本發(fā)明的試劑盒包括:
1.GST-Rafl-RK)融合蛋白
規(guī)格:600 yg，可供30次pulΙ-down實(shí)驗(yàn)，蛋白純化濃度>70% (圖4所示)。
[0016]保存條件:溶解于50 mM Tris-HCl，10%甘油，0.02% NaN3中，保存在_80°C。用途:GST-Rafl-RBD融合蛋白能通過GST與固相化在載體上的谷胱甘肽親和結(jié)合，也可以通過Ras結(jié)合區(qū)域結(jié)合Ras-GTP。
[0017]2.1P buffer規(guī)格:200 ml
用途:1P buffer用于病理組織或細(xì)胞裂解，保存在4°C。
[0018]注:使用時加蛋白酶抑制劑cocktail (1:500)以及磷酸酶抑制劑。
[0019]1.Washing buffer
washing buffer用于洗滌谷胱甘肽瓊脂糖凝膠珠，保存在4°C。
[0020]注:使用時加蛋白酶抑制劑cocktail (1:500)以及磷酸酶抑制劑。
[0021 ] 2.谷胱甘肽瓊脂糖凝膠珠
規(guī)格:450 μ?,保存在4°C。
[0022]用途:作為固相載體，用于結(jié)合GST-Rafl-RBD融合蛋白。
[0023]3.SDS-PAGE loading buffer 規(guī)格:1 ml,室溫保存。
[0024]用途:含有4% SDS (w/v),2% glycerol和0.05%溴酚藍(lán)，用于蛋白制樣，保存在4?C。
[0025]4.Ras各亞型抗體
規(guī)格:ant1-N-Ras (50 μ?),ant1-H-Ras (50 μ?), ant1-K-Ras (50 μ?)注:可選擇一種或多種抗體(本試劑盒附帶ant1-H-Ras抗體兔子多克隆抗體(Sc-520))。
[002