一種高靈敏度長(zhǎng)春新堿分子印跡傳感器及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及的是一種分子印跡傳感器的制備方法及快速檢測(cè)應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種檢測(cè)高靈敏度長(zhǎng)春新堿分子印跡傳感器及其制備方法，具體是基于分子印跡特異性識(shí)別作用，用于檢測(cè)藥品、生物樣品中的長(zhǎng)春新堿。
【背景技術(shù)】
[0002]長(zhǎng)春新堿能抗癌，療效比長(zhǎng)春堿約高10倍，可用于治療急性淋巴細(xì)胞性白血病，療效較好，對(duì)其他急性白血病、何杰金氏病、淋巴肉瘤、網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤和乳腺癌也有療效。與長(zhǎng)春花堿(vinblastine)、泛洛洛新及泛洛洗汀等一起含在蔓長(zhǎng)春花(Vincamajor)中的生物堿。具有使細(xì)胞分裂(有絲分裂)在中期停止的作用，這與秋水仙素相似，但其作用比秋水仙素更強(qiáng)。與秋水仙素一樣可以與微管蛋白結(jié)合而抑制其生物活性，但結(jié)合部位不同。另外它與秋水仙素不同的是對(duì)微管蛋白以外的蛋白質(zhì)如肌動(dòng)蛋白及10納米細(xì)絲蛋白等也起作用。在臨床醫(yī)學(xué)上作為抗癌劑之一而被應(yīng)用，特別是對(duì)造血器官的腫瘤比較有效。長(zhǎng)春堿硫酸鹽可用于治療何杰金氏病和絨毛膜上皮癌，療效較好;對(duì)淋巴肉瘤、網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤、急性白血病(VP，VDLP方案中的〃 V 〃為長(zhǎng)春新堿，D為柔紅霉素，〃 L 〃為門冬酰胺酶，〃 P 〃為潑尼松)、乳腺癌、腎母細(xì)胞瘤、卵巢癌、睪丸癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤和惡性黑色素瘤等也有一定療效。長(zhǎng)春新喊是一種雙Π引噪型生物喊。分子式C46H56N4O1Q，分子量為824.96。存在于夾竹桃科植物長(zhǎng)春花中。甲醇中重結(jié)晶時(shí)為針狀結(jié)晶。熔點(diǎn)211?216°C。由于夾竹桃科植物除了長(zhǎng)春新堿以外還含有其它多種組分，如長(zhǎng)春堿、次長(zhǎng)春堿，而它們的性質(zhì)相似，導(dǎo)致長(zhǎng)春新堿提取分離、測(cè)定的困難，因此，找到一種選擇性好、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便使用的檢測(cè)長(zhǎng)春新堿的方法十分重要。傳統(tǒng)檢測(cè)長(zhǎng)春新堿的方法主要有高效液相色譜、液相色譜-質(zhì)譜法，色譜法的準(zhǔn)確度受到一定限制、而且儀器比較貴需要專業(yè)人員操作，也限制了其應(yīng)用。分子印跡技術(shù)是當(dāng)前開(kāi)發(fā)具有分子識(shí)別功能的高選擇性材料的主要方法之一，它是通過(guò)在模板分子周圍形成一個(gè)高度交聯(lián)的剛性高分子，除去模板分子后在分子印跡聚合物的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中留下具有結(jié)合能力的識(shí)別位點(diǎn)，對(duì)模板分子表現(xiàn)出高選擇識(shí)別性能的一種技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)以其構(gòu)效預(yù)定性和特異識(shí)別性越來(lái)越受到人們的關(guān)注，已經(jīng)成功用于固相萃取或微固相萃取，親和色譜或毛細(xì)管電泳及傳感器等領(lǐng)域。依據(jù)此技術(shù)制備的分子印跡傳感器，應(yīng)用于藥物分析、環(huán)境保護(hù)及生命科學(xué)研究中起著十分重要的作用。將功能分子以適當(dāng)方式修飾到電極上，制備選擇性好、靈敏度高、有一定使用壽命可再生的電化學(xué)傳感器成為分析科學(xué)工作者努力探索的課題。但是傳統(tǒng)的印跡方法所制備的印跡膜厚度難以控制，高交聯(lián)度使得電子傳遞速度和響應(yīng)慢、檢測(cè)下限高而且再生和可逆性差，影響分子印跡技術(shù)在電化學(xué)傳感器中的應(yīng)用。因此，建立一種靈敏、快速、簡(jiǎn)便、特異性高、重復(fù)性好經(jīng)濟(jì)使用的檢測(cè)方法，對(duì)研究人員、生產(chǎn)企業(yè)、質(zhì)控人員、進(jìn)出口商檢、政府管理部門等的迫切需要的，對(duì)食品、藥品、環(huán)境安全中的長(zhǎng)春新堿含量準(zhǔn)確定量測(cè)定十分必要，對(duì)于長(zhǎng)春新堿生產(chǎn)和藥理研究也具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是將分子印跡與電化學(xué)傳感器相結(jié)合，提供了一種檢測(cè)高靈敏度長(zhǎng)春新堿分子印跡傳感器的制備方法，主要是以長(zhǎng)春新堿為模板，在玻碳電極表面通過(guò)3-巰丙基三乙氧基硅烷、石墨烯及納米金粒子之間的電化學(xué)作用而制備的分子印跡傳感器。
[0004]所用儀器:
CHI660B電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)，實(shí)驗(yàn)采用三電極體系:鉑絲電極為輔助電極，Ag/AgCl為參比電極(SCE)，玻碳電極(GCE)為工作電極;KQ-250E型超聲波清洗器(坤峰超聲儀器有限公司)。
[0005]所用試劑:
石墨烯;3-巰丙基三乙氧基硅烷、無(wú)水乙醇;衣康酸，N，N-二甲基甲酰胺(DMF);氯金酸；長(zhǎng)春新堿;丙烯酸甲酯;過(guò)硫酸銨，磷酸緩沖溶液。
[0006]本發(fā)明的目的通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。
[0007]一種高靈敏度長(zhǎng)春新堿分子印跡傳感器的制備方法，其特征在于，該方法具有以下工藝步驟:
步驟1:在反應(yīng)器中，按如下組成質(zhì)量百分濃度加入，濃硫酸:50?60%，石墨烯:3?8%，高猛酸鉀:1.0?5%，超聲分散20?30min，再加入32?42%去離子水，各組分含量之和為百分之百，溫度升至65±2°C攪拌反應(yīng)8 -10 h，冷卻至室溫，過(guò)濾，用去離子水反復(fù)洗滌至濾液為中性，真空干燥，得到氧化石墨烯；
步驟2:將玻碳電極依次用0.30μπι和0.05μπιΑ1203粉末懸濁液進(jìn)行表面拋光，然后依次用無(wú)水乙醇和高純水超聲清洗，用氮?dú)獯蹈?，將玻碳電極放入含3-巰丙基三乙氧基硅烷質(zhì)量百分濃度為18?23%的乙醇溶液中，溫度升至50±2°C，浸泡6?8 h，取出用無(wú)水乙醇充分洗滌，用氮?dú)獯蹈桑瑢⒉Ｌ茧姌O浸泡在0.1?0.2 mol/L氯酸金溶液中，浸泡時(shí)間為4?6 h，再放入質(zhì)量百分濃度為20%的水合肼溶液中浸泡10 min，取出用無(wú)水乙醇充分洗滌，用氮?dú)獯蹈?，即得納米金修飾玻碳電極；
步驟3:在反應(yīng)器中，按如下組成質(zhì)量百分濃度加入，乙醇:62?72%，步驟1得到的氧化石墨烯:5~8%，丙烯酸甲酯:10?18%，衣康酸:5?10%，過(guò)硫酸銨:2?6%，攪拌10 min，再加入長(zhǎng)春新堿:1.0?3.0%，各組分含量之和為百分之百，溫度升至65±2°C攪拌反應(yīng)6?8 h，即得印跡溶膠；
步驟4:取步驟3的印跡溶膠于12yL滴加到步驟2制備的納米金修飾玻碳電極上，置于紅外燈下，揮發(fā)干溶劑后，將其用乙醇與硫酸混合溶液浸泡8?9h，除去電極上的模板分子，SP得高靈敏度長(zhǎng)春新堿分子印跡傳感器。
[0008]進(jìn)一步的，步驟3所述的丙烯酸甲酯與衣康酸質(zhì)量比為2:1-3:2。
[0009]進(jìn)一步的，步驟4所述的乙醇與硫酸混合溶液的體積比為乙醇:硫酸=18:1-20:1。[°01°] 進(jìn)一步的，步驟2所述的無(wú)水乙醇和高純水超聲清洗的時(shí)間分別是5min和lOmin。
[0011]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及效果是:
本發(fā)明將溶膠-凝膠印跡技術(shù)、石墨烯、納米金粒子、層層自組裝法和滴涂法相結(jié)合，在玻碳電極表面成功地研制了一種具有特異選擇性的印跡電化學(xué)傳感器。通過(guò)與無(wú)石墨烯和納米金修飾的分子印跡電極那個(gè)的響應(yīng)進(jìn)行比較，本申請(qǐng)制備的高靈敏度長(zhǎng)春新堿分子印跡傳感器的響應(yīng)大大提高。該印跡傳感器對(duì)長(zhǎng)春新堿表現(xiàn)出較高的親和性和選擇性，響應(yīng)電流與長(zhǎng)春新堿的濃度在1.0 X 10—7?9.0 X 10—5mo 1 /L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢測(cè)限為
1.38X10—Vol/L將本發(fā)明制備的高靈敏度長(zhǎng)春新堿分子印跡傳感器成功用于藥品、生物樣品中長(zhǎng)春新堿的檢測(cè)中，回收率在95.82-104.6%之間，因此本發(fā)明制備的分子印跡傳感器可廣泛應(yīng)用于化工、生物醫(yī)藥、食品、環(huán)保檢測(cè)等相關(guān)領(lǐng)域。
【具體實(shí)施方式】
[0012]首先進(jìn)行氧化石墨烯的制備:在反應(yīng)器中，按如下組成質(zhì)量百分濃度加入，濃硫酸:50-60%，石墨烯:3-8%，高錳酸鉀:1.0-5%，超聲分散20?30min，再加入32?42%去離子水，各組分含量之和為百分之百，溫度升至65±2°C攪拌反應(yīng)8 -10 h，冷卻至室溫，過(guò)濾，用去離子水反復(fù)洗滌至濾液為中性，真空干燥，得到氧化石墨烯。得到氧化石墨烯進(jìn)行以下具體的實(shí)施例步驟:
實(shí)施例1
(1)納米金修飾玻碳電極:將玻碳電極依次用0.3μπι、0.05μπι粉末懸濁液進(jìn)行表面拋光，然后依次用無(wú)水乙醇和高純水超聲清洗，超聲清洗的時(shí)間分別是5min和lOmin，用氮?dú)獯蹈桑瑢⒉Ｌ茧姌O放入含3-巰丙基三乙氧基硅烷質(zhì)量百分濃度為20%的乙醇溶液中，溫度升至50±2°C，浸泡7 h，取出用無(wú)水乙醇充分洗滌，用氮?dú)獯蹈桑瑢⒉Ｌ茧姌O浸泡在0.15 mol/L氯酸金溶液中，浸泡時(shí)間為5 h，再放入質(zhì)量百分濃度為20%的水合肼溶液中浸泡10 min，取出用無(wú)水乙醇充分洗滌，用氮?dú)獯蹈桑吹眉{米金修飾玻碳電極；
(2)印跡溶膠的制備:在反應(yīng)器中，分別加入，乙醇:9.0mL，氧化石墨烯:0.6g，丙烯酸甲酯:1.3g，衣康酸:0.8g，過(guò)硫酸錢:0.3g，攪拌10 min，再加入長(zhǎng)春新堿:0.2g，溫度升至65±2°C攪拌反應(yīng)7 h，即得印跡溶膠；
(3)高靈敏度長(zhǎng)春新堿分子印跡傳感器的制備方法:取步驟(2)的印跡溶膠于12yL滴加到步驟(1)制備的納米金修飾玻碳電極上，置于紅外燈下，揮發(fā)干溶劑后，將其用乙醇與硫酸(體積比為乙醇:硫酸為18:1)混合溶液浸泡8h，除去電極上的模板分子，即得高靈敏度長(zhǎng)春新堿分子印跡傳感器。
[0013]實(shí)施例2
(1)納米金修飾玻碳電極:將玻碳電極依次用0.3μπι、0.05μπι粉末懸濁液進(jìn)行表面拋光，然后依次用無(wú)水乙醇和高純水超聲清洗，超聲清洗的時(shí)間分別是5min和lOmin，用氮?dú)獯蹈?，將玻碳電極放入含3-巰丙基三乙氧基硅烷質(zhì)量百分濃度為18%的乙醇溶液中，溫度升至50±2°C，浸泡8 h，取出用無(wú)水乙醇充分洗滌，用氮?dú)獯蹈?，將玻碳電極浸泡在0.1 mol/L氯酸金溶液中，浸泡時(shí)間為6 h，再放入質(zhì)量百分濃度為20%的水合肼溶液中浸泡10 min，取出用無(wú)水乙醇充分洗滌，用氮?dú)獯蹈桑吹眉{米金修飾玻碳電極；
(2)印跡溶膠的制備:在反應(yīng)器中，分別加入，乙醇:7.8mL，氧化石墨烯:0.8g，丙