用于受激拉曼檢測的設(shè)備和方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于檢測樣本中的受激拉曼散射(SRS)類型的共振非線性光學(xué)信號的設(shè)備和方法。本發(fā)明尤其適用于顯微鏡學(xué)成像、光譜學(xué)、以及散射介質(zhì)(諸如生物介質(zhì))中的高光譜成像。
【背景技術(shù)】
[0002]每一個化學(xué)鍵都擁有特定于它的振動頻率。旨在使用光和物質(zhì)之間的相互作用來獲得關(guān)于這些分子振動的信息的方法被稱為振動光學(xué)技術(shù)。這些技術(shù)中最著名的是紅外(IR)光譜學(xué)，在IR光譜學(xué)中，觀察存在于樣本中的化學(xué)鍵的特定吸收線。在1928年發(fā)現(xiàn)，拉曼散射(以發(fā)現(xiàn)該效應(yīng)的物理學(xué)家Chandrasekhara Venkata Raman命名)使得可見光可被用于獲得與光束相互作用的分子的振動光譜。在拉曼散射過程中，入射在分子上的角頻率ωρ的栗波非彈性地散射成為所謂的角頻率ω s的斯托克斯波以及所謂的角頻率ω As的反斯托克斯波。所產(chǎn)生的波和栗波之間的頻率差取決于(角頻率0,的)分子拉曼躍迀，以使得ωρ-ω5= ω Α5-ωρ= Ω RO從該過程的光子學(xué)觀點來講，斯托克斯波和反斯托克斯波分別對應(yīng)于來自基本或激發(fā)振動能級的吸收。從激發(fā)振動能級產(chǎn)生反斯托克斯波的過程的可能性比產(chǎn)生斯托克斯波的過程小得多，斯托克斯波是在自發(fā)拉曼光譜學(xué)中在實踐中觀察到的唯一的波。斯托克斯波的光譜分布的嚴密研究提供關(guān)于存在于樣本中的化學(xué)鍵的密度的信息。該自發(fā)非彈性散射過程與熒光相比是非常無效的(拉曼有效截面約為103°cm2/分子，與熒光團的1-光子有效吸收截面(其達到10 16cm2/分子)相比較)。
[0003]稱之為相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)和受激拉曼散射(SRS)的受激拉曼技術(shù)是相對于自發(fā)拉曼散射過程而言提供大約107的放大的相干拉曼散射過程。在這些技術(shù)(參見圖1A)中，角頻率ωρ和ω s(或頻率vp和v s)的兩個激光脈沖(其角頻率差被設(shè)置為等于期望探測到的振動能級的角頻率Ωκ)被注入到將被分析的介質(zhì)中。分別被表示為栗脈沖和斯托克斯脈沖的這些脈沖創(chuàng)建使角頻率Ωκ的振動模式進入共振的頻率跳動。在CARS過程中，該共振用栗束探測，栗束誘導(dǎo)角頻率coAS的反斯托克斯散射。受激拉曼散射(SRS)是使用由于由栗場和斯托克斯場誘導(dǎo)的非線性場與激發(fā)(栗)場的相互作用而導(dǎo)致的非線性響應(yīng)的過程，因此，與CARS過程相反，它在與栗脈沖和斯托克斯脈沖相同的頻率上被觀察到。它導(dǎo)致從栗束到斯托克斯束的能量轉(zhuǎn)移。因此，受激拉曼散射涵蓋兩個過程，SRL (指受激拉曼損耗)過程和SRG (指受激拉曼增益)過程，這兩個過程分別在栗束中引起強度損耗ΑΙι以及在斯托克斯束中引起強度增益AISR(；(參見圖1Β)。例如在Ν.Bloembergen 的綜述文章(“The stimulated Raman effect，，，American Journal ofPhysics，35:989-1023, 1967年)中描述了 SRS過程。已經(jīng)表明，栗束的強度的降低Δ ISRL和斯托克斯束的強度的增益Δ ISR(；與三階非線性磁化率的虛部(Im(x R?))成比例。這些量的測量因此使得拉曼光譜的嚴謹計算變成可能。最近，振動光學(xué)技術(shù)更多地集中于SRS技術(shù)，與CARS技術(shù)相反，SRS技術(shù)不受總是存在于CARS中的非共振背景制約，并且與化學(xué)物種濃度是線性關(guān)系。
[0004]SRS顯微鏡學(xué)是利用飛秒SRS光譜學(xué)領(lǐng)域中的新進展的新技術(shù)。在2007年，Ploetz 等人(“Femtosecond Stimulated Raman Microscopy”，Applied PhysicsB, 87(3):389-393, 2007)開發(fā)了第一臺基于遞送飛秒脈沖和皮秒脈沖的放大激光系統(tǒng)的SRS顯微鏡。該類型的系統(tǒng)誘發(fā)強SRS信號，但是卻不適合于生物成像。具體而言，所用的(大約nj的)高峰功率損壞樣本，并且低重復(fù)率(1kHz)與快速掃描顯微鏡學(xué)不兼容。
[0005]當時提出了基于與生物樣本的圖像形成兼容的高重復(fù)率(80MHz)皮秒激光系統(tǒng)的使用的SRS顯微鏡(參見例如C.ff.Freudiger等人的文章'Label-freeb1medical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scatteringmicroscopy”，Science, 322 (5909): 1857-1861，2008 年；P.Nandakumar 等人的文章:“Vibrat1nal imaging based on stimulated Raman scattering microscopy，，，NewJournal of Physics, 11 (3):033026 (9pp)，2009 年；Y.0zeki 等人的文章'Analysis andexperimental assessment of the sensitivity of stimulated Raman scatteringmicroscopy”，Optics Express, 17 (5): 3651-3658，2009 年 3 月)。在 CARS 顯微鏡學(xué)中，在與激發(fā)束不同的頻率產(chǎn)生有用信號，即，反斯托克斯信號。反斯托克斯信號可被極其敏感的檢測器(諸如雪崩光電二極管或光電倍增管)檢測到。在SRS顯微鏡學(xué)中，檢測帶來了不同的問題，因為有用信號是在與激發(fā)束相同的頻率產(chǎn)生的。它因此是檢測栗束的能量A 1.損耗或者檢測斯托克斯束中的能量A〗.增益的問題。在實踐中，栗束的能量損耗大約為A ISRL/IP^ 10 5-10 80在以上引用的文章中，建議以頻率圪調(diào)制斯托克斯信號并且通過同步檢測以頻率匕提取栗信號的損耗以便提高檢測靈敏度。
[0006]因此，圖2示出現(xiàn)有技術(shù)的SRG配置(即，適于從斯托克斯束提取增益的配置)的SRS顯微鏡的示意圖。在圖2中被引用為102和104的、角頻率分別為ωρ和ω 5的栗脈沖序列和斯托克斯脈沖序列被注入到樣本S中，樣本S被定位在布置在顯微鏡120的本體中的顯微鏡物鏡122的焦點處。以角頻率差等于期望在樣本中探測到的振動能級的角頻率Ωκ的這樣的方式選擇角頻率ω。和ω s。通過組合器114將栗脈沖序列和斯托克斯脈沖序列在空間上疊加，并且提供可變延遲線(未示出)來確保樣本中的脈沖的時間疊加。通過調(diào)制設(shè)備112以調(diào)制頻率匕對栗脈沖序列102進行振幅調(diào)制，以便形成調(diào)制脈沖序列106。為了降低電子噪聲和激光器的噪聲，調(diào)制頻率被選為高于1MHz。因此，在圖2中，曲線101和103分別示出調(diào)制栗脈沖序列106和(未調(diào)制)斯托克斯脈沖序列104的光強度IP和Is的時間波形。聚光物鏡124使得由樣本中的栗脈沖和斯托克斯脈沖的相互作用導(dǎo)致的光學(xué)信號可被收集。在所選配置中，濾光器126使得角頻率為cos的脈沖序列108可被選擇，該序列然后被發(fā)送到光學(xué)檢測器128，例如，光電二極管。作為時間的函數(shù)測量的光學(xué)強度用曲線107示意性地示出。調(diào)制頻率匕的同步檢測130使得表征角頻率Ω R的分子振動的尋求信號ΑΙι可被提取。例如通過包括兩個電流計鏡的掃描系統(tǒng)116在樣本上方掃描激發(fā)束104、106然后使得樣本的感興趣區(qū)域的圖像可被形成。
[0007]然而，SRS顯微鏡學(xué)容易有若干個偽像，因為這些偽像引入可被解釋為SRS信號的信號，所以它們限制了化學(xué)特異性。具體而言，SRS顯微鏡學(xué)對交叉克爾效應(yīng)(或用于指“交叉相位調(diào)制”的XPM)敏感，交叉克爾效應(yīng)不是特定于目標化學(xué)鍵的，并且在SRS信號中表現(xiàn)為正或負偏移。SRS顯微鏡學(xué)也對雙光子吸收(或用于指“雙光子吸收”的TPA)敏感，雙光子吸收在SRS信號中表現(xiàn)為正(在SRL配置中)或負(在SRG配置中)偏移。
[0008]雙光子吸收是僅當栗束存在時才(在諸如圖2中所示的SRG配置中)誘導(dǎo)斯托克斯束耗盡的瞬間非線性過程。在斯托克斯束中誘導(dǎo)的調(diào)制因此被檢測到并且被解釋為SRS信號。在SRG檢測模式下，通過TPA耗盡斯托克斯束相對于SRG增益測量而言表現(xiàn)為副偏移。在SRL檢測模式下，通過TPA耗盡栗束相對于SRL損耗測量而言表現(xiàn)為正偏移。
[0009]光學(xué)克爾效應(yīng)是非線性(瞬間)過程，該過程誘導(dǎo)折射率變化(該折射率變化與產(chǎn)生它的波的強度成比例)，并且引起導(dǎo)致產(chǎn)生它的束聚焦或散焦的透鏡效應(yīng)。在SRS顯微鏡學(xué)中，當克爾效應(yīng)僅影響栗光子或者僅影響斯托克斯光子時，克爾效應(yīng)不是問題。具體而言，例如在SRG配置(諸如圖2中所示)中，當只有栗光子受到影響時，克爾效應(yīng)誘導(dǎo)只有栗束看到的變化；然而，后者未被檢測到，因此其聚焦不影響測量。當只有斯托克斯光子受到影響時，克爾效應(yīng)誘導(dǎo)只有斯托克斯束看到的變化；因為后者未被調(diào)制，所以其聚焦和在檢測器處誘導(dǎo)的能量變化隨著時間保持不變，因此不影響調(diào)制頻率圪的SRS測量。然而，例如在SRG配置中，在斯托克斯束的角頻率ω s處的折射率中觀察到變化，該變化是由角頻率ωρ的栗束誘導(dǎo)的；這是交叉克爾效應(yīng)，該交叉克爾效應(yīng)在這種情況下以與被測SRS信號的調(diào)制相同的調(diào)制使斯托克斯束聚焦或散焦。導(dǎo)致測量偏移。為了降低交叉克爾效應(yīng)的影響，重要的是當在測量束與樣本相互作用之后收集測量束(在SRL中為栗，在SRG中為斯托克斯)時不引入光闌。由于這個原因，已知使用其數(shù)值孔徑大于激發(fā)物鏡的數(shù)值孔徑的聚光物鏡。
[0010]這些偽像因散射介質(zhì)(尤其是生物組織)而加劇，并且阻礙了 SRS顯微鏡學(xué)對于檢查其有效拉曼截面很小的振動鍵的使用。具體而言，即使當使用其數(shù)值孔徑大于激發(fā)物鏡的數(shù)值孔徑的聚光物鏡時，散射也將導(dǎo)致聚光物鏡的阻隔(diaphragming)，該阻隔加劇偽像(尤其是交叉克爾效應(yīng))的影響。
[0011]因此，圖3B至3D例示說明在由人的皮膚形成的組織中在各種光譜區(qū)域中通過CARS、SRS和拉曼顯微光譜學(xué)獲得的光譜，該組織的拉曼光譜在圖3A中示出。圖3A中所示的從Huang等人的文章(Optics Express, 19，23 (2011年))復(fù)制的光譜包括用于拉曼成像的三個感興趣光譜區(qū)域。被稱為“脂類和蛋白質(zhì)”區(qū)域的區(qū)域?qū)?yīng)于2750cm1和3050cm 1之間的角頻率，并且包含高強度分子振動，被稱為“酰胺”區(qū)域的區(qū)域?qū)?yīng)于1350cm 1和1750cm 1之間的角頻率，被稱為“指紋”區(qū)域的區(qū)域?qū)?yīng)于850cm1和1150cm 1之間的角頻率。圖3B至3D示出在這些區(qū)域中的每個中分別通過CARS、SRS和拉曼顯微光譜學(xué)執(zhí)行的光譜測量。在分子振動的強度高的區(qū)域(圖3B)中，可以看到SRS測量203很好地對應(yīng)于拉曼光譜201，而CARS測量202表現(xiàn)出與連續(xù)的非共振背景相關(guān)的偏移。CARS測量中的連續(xù)的非共振背景效應(yīng)在兩個其它區(qū)域(圖3C和3D中的曲線212和222)中也是可見的。而且，在分子振動的強度較低的區(qū)域中的SRS測量中也觀察到偏移(連續(xù)背景)出現(xiàn)。因此，由SRS測量導(dǎo)致的曲線(圖3C和3D中的213和223)不再疊加在拉曼光譜(211和221)上。這些實驗曲線例示說明分子振動的強度低的區(qū)域中的SRS測量偽像的影響。
[0012]本發(fā)明提供一種用于檢測在樣本中誘導(dǎo)的SRS類型的共振非線性光學(xué)信號的獨創(chuàng)方法，該方法使得尋求的有用的SRS信號可被增大并且偽像(尤其是由交叉克爾效應(yīng)導(dǎo)致的偽像)可被移除，包括在由散射生物介質(zhì)形成的樣本中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]根據(jù)第一方面，本發(fā)明涉及一種用于檢測在樣本中誘導(dǎo)的受激拉曼散射(SRS)類型的共振非線性光學(xué)信號的設(shè)備。該設(shè)備包括:
[0014]-電光裝置，其用于在樣本中使角頻率ω#Ρω 2的光脈沖序列以第一調(diào)制頻率相互作用并且使角頻率《2和ω 3的光脈沖序列以第二調(diào)制頻率相互作用，以使得ω 2-ω1 =ω3-ω2= Ω R，其中，Ωκ是樣本的分子振動共振角頻率；
[0015]-用于以第一調(diào)制頻率和第二調(diào)制頻率對由樣本中的光脈沖的相互作用導(dǎo)致的非線性光學(xué)信號進行同步檢測的裝置；以及
[0016]-電子處理裝置，其使得可從由同步檢測導(dǎo)致的電子信號獲得表