一種實時監(jiān)測g-四聯(lián)體形成的單顆粒spr探針的制備和應(yīng)用
【專利說明】一種實時監(jiān)測G-四聯(lián)體形成的單顆粒SPR探針的制備和應(yīng) 用
[0001] 本發(fā)明具體涉及一種可高靈敏檢測鉀離子、并實時監(jiān)測G-四聯(lián)體形成過程的方 法，屬于納米材料生物應(yīng)用領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 貴金屬（金和銀等）納米顆粒在入射光照射下，界面的自由電子和光子發(fā)生共振 運(yùn)動形成等離子體共振效應(yīng)。當(dāng)金屬納米顆粒直徑大于或近似于自由電子的平均自由程 時，顆粒受激后將產(chǎn)生明顯的散射現(xiàn)象，由于該現(xiàn)象主要發(fā)生在表面，因此被稱為表面等離 子共振（surfaceplasmonresonance,SPR)散射。研究發(fā)現(xiàn)，其散射光譜主要依賴于納米 顆粒的形狀、大小以及顆粒和其周圍環(huán)境的介電常數(shù)。納米顆粒的形貌和尺寸的不同，將引 起表面自由電子密度、電子震蕩頻率的變化，從而造成包括吸收和散射光學(xué)性質(zhì)的變化。基 于的SPR散射本身獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)，對基于SPR散射的納米結(jié)構(gòu)體系的研究已成為迅猛發(fā) 展的熱點研究領(lǐng)域之一，即表面等離子體光子學(xué)。表面等離子體光子學(xué)包含非常廣泛的研 究內(nèi)容，例如表面電場增強(qiáng)光譜、表面增強(qiáng)拉曼光譜、表面等離子體納米波導(dǎo)、表面等離子 體光催化、表面增強(qiáng)的能量轉(zhuǎn)移及選擇性光吸收等，尤其是表面等離子共振生物傳感已經(jīng) 成為重要的分支之一，該方法是在單顆粒上實現(xiàn)單分子水平檢測的有效手段。目前基于納 米等離子體界面微環(huán)境的折射率變化、生物分子分布以及納米顆粒間或復(fù)合物顆粒核-殼 間強(qiáng)烈的耦合作用，并結(jié)合暗場顯微鏡與光譜儀的優(yōu)勢，可以在納米尺度開發(fā)出具有極高 靈敏度的單分子水平的生物探針、新型的生物成像試劑或治療試劑。
[0003] G-四聯(lián)體是一種特殊的核酸二級結(jié)構(gòu)，廣泛存在于人類基因組DNA以及RNA中，如 DNA的端粒序列、基因的啟動子序列、RNA的5'端非翻譯區(qū)（5'UTR)序列等。許多研究發(fā)現(xiàn)， G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)在基因的穩(wěn)定性、端粒合成過程、基因轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達(dá)調(diào)控、基因重組 等生命過程中起著至關(guān)重要的作用。富含鳥苷酸的DNA或者RNA在單價陽離子，如Na+、K+、 NH4+、Rb+等存在的條件下，均能形成穩(wěn)定的G-四聯(lián)體二級結(jié)構(gòu)。4個鳥嘌呤堿基通過氫鍵 的配對方式形成G-4平面，適當(dāng)?shù)年栯x子可以使多個G-4平面堆疊形成G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)。陽 離子中體積最適合嵌入G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)的是K+，K+對G-四聯(lián)體的穩(wěn)定作用最為顯著，而真核 細(xì)胞內(nèi)往往具有相對較高的鉀離子濃度，因而提示在細(xì)胞內(nèi)的鉀離子作用下，有利于G-四 聯(lián)體的形成，并發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。
[0004] 目前，檢測鉀離子的方法有很多，例如：熒光法、電化學(xué)法、比色法等，但是這些檢 測方法所依據(jù)的探針因為尺寸和靈敏度的問題，在應(yīng)用中有很大的局限性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了得到高靈敏的小尺寸鉀離子探針，本發(fā)明設(shè)計了基于單個貴金屬納米顆粒的 SPR探針，實現(xiàn)了高靈敏檢測鉀離子并實時監(jiān)測G-四聯(lián)體形成過程的功能，此SPR探針的測 定過程的實現(xiàn)了無標(biāo)記，檢測速度快，靈敏度高，檢測范圍寬等優(yōu)點。
[0006] 制備過程如下：
[0007] 1、一種實時監(jiān)測G-四聯(lián)體形成的單顆粒SPR探針的制備
[0008] 首先，用種子生長法合成~50nm的金納米顆粒，采用如下方法制備：
[0009] 步驟1.合成顆粒
[0010] ⑴種子合成
[0011] 在反應(yīng)瓶中加入100mMCTAB(aq)和10mMHAuC14 (aq)，在磁力攪拌器上攪拌使其 混合均勻，將冰水浴過的現(xiàn)配10mM的NaBH4(aq)快速加到CTAB和HAuC14的混合溶液中， 溶液瞬間由黃色變成棕色；將得到的種子溶液在28°C水浴中保溫3h。
[0012] (2)30nm金球的合成
[0013] 在反應(yīng)瓶中加入200mMCTAC(aq)和0· 01M的HAuC14(aq)混合之后用磁力攪拌使 溶液均勻；l〇〇mM新配制的抗壞血酸溶液迅速加進(jìn)混合溶液，之后黃綠色的溶液瞬間變成 無色透明溶液；攪拌均勻后快速加入步驟1的棕色的金種子溶液，整個溶液慢慢變?yōu)榱良t 色透明膠體；在36°C水浴中保溫lh。
[0014] (3)合成AuOAg核殼納米立方體
[0015] 在反應(yīng)瓶中加入3mL的30nm金納米顆粒的溶液和0. 2MCTAC溶液，混合均勻 后加入抗壞血酸溶液，然后將反應(yīng)瓶中在60°C恒溫水浴中保溫，10mM的硝酸銀溶液以 0. 5mL/10min速度在加液栗輔助下滴加到恒溫60°C反應(yīng)瓶中，在水浴中恒溫靜置4h之后離 心處理。
[0016] 步驟2.制備納米探針：
[0017] 將ΙΤ0玻璃浸泡在大小約50nmAu@Ag核殼納米顆粒溶液中，通過物理吸附作用將 AuOAg核殼納米立方體固定在ΙΤ0基底上；然后將200yL的Aptamer(5'-TTTTTTTTTTGG GTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTTTTTTTTT-3' -(CH2)6-SH)滴在ΙΤ0 玻璃上，放在 37°C 的搖床中；分別固定不同時間，用超純水沖洗掉表面多余的Aptamer。如圖1所示是InM的 Aptamer修飾Au@Ag納米顆粒2. 5h的實時SPR光譜峰值移動圖。結(jié)果得到Aptamer的最佳 修飾濃度0. 5-10nM，最佳修飾時間l_4h。
[0018] 2、一種實時監(jiān)測G-四聯(lián)體形成的單顆粒SPR探針的應(yīng)用，對鉀離子的檢測：
[0019] 1)在制備的探針上分別滴加180μL不同濃度的鉀離子溶液，通過采集SPR散射光 譜數(shù)據(jù)，得到lh時探針在不同濃度的鉀離子作用下的SPR光譜的峰值與時間之間的關(guān)系曲 線如圖2所示，鉀離子10 7-10 2M不同濃度的作用下在lh動態(tài)平衡時的SPR光譜的峰值，分 別是 15. 3nm，14. 748nm，13. 98nm，10. 747nm，6. 67nm，2. 81nm。以及SPR光譜的峰移動量與 鉀離子濃度之間的關(guān)系如圖3所示。鉀離子溶液的濃度為10 9-10 2M是S型曲線；其中在 10 7-10 4M范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，最低檢測限達(dá)到InM。
[0020] 2)數(shù)據(jù)分析
[0021] 用公式（1):
，擬合該探針在不同濃度的鉀離子的影響下的 SPR光譜的峰值與時間之間的關(guān)系曲線，得到25°C時G-四聯(lián)體解離常數(shù)Kd;鉀離子的濃度 0.1以]?-0.11111，分別對應(yīng)的11值分別是0.89，1.27，1.37，1.49，1.87,2.01，6-四聯(lián)體形成 過程中可分為兩種結(jié)合位點形態(tài)；用公式（2)
=-RTlnKep，分析SPR光譜的峰移動量與鉀離子濃度之間的關(guān)系，得到不同濃度的鉀離子 與AG的線性關(guān)系如圖4所示，鉀離子濃度與AG具有良好的線性關(guān)系。用公式（5)AG= △GH2()-mCK+擬合圖4得到在形成穩(wěn)定G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)時候的吉布斯自由能△G。
[0022] 有益效果
[0023] 本次研究將AuOAg核殼結(jié)構(gòu)納米顆粒和Aptamer組裝成可高靈敏檢測鉀離子的生 物探針，并實時監(jiān)測G-四聯(lián)體形成過程。此探針對鉀離子的特異性結(jié)合的整個過程可以通 過暗場顯微鏡（DFM)和散射光譜儀聯(lián)用下的單個貴金屬納米顆粒的SPR光譜峰移動量來表 征。此探針具有實時檢測的功能，且檢測速度快，靈敏度高，檢測范圍寬等優(yōu)點。此外，可通 過數(shù)據(jù)擬合分析得到形成G-四聯(lián)體的解離常數(shù)心和吉布斯自由能AG，以及在形成過程中 的兩種結(jié)合位點形態(tài)。
【附圖說明】
[0024] 圖1是本發(fā)明中本發(fā)明中Aptamer修飾AuOAg納米顆粒的實時SPR光譜峰值移動 圖。
[0025] 圖2是本發(fā)明中不同濃度的鉀離子作用下的SPR光譜的峰值與時間之間的關(guān)系曲 線圖。
[0026] 圖3是本發(fā)明中SPR光譜的峰移動量與鉀離子濃度之間的關(guān)系圖。
[0027] 圖4是本發(fā)明中不同濃度的鉀離子與AG的線性關(guān)系圖，鉀離子濃度與AG具有 良好的線性關(guān)系。
【具體實施方式】
[0028]-、制備性能優(yōu)異的SPR生物光學(xué)探針：
[0029] 實施例