即完成雙層凝膠的制備。其它步驟及參數(shù)與【具體實施方式】一至六之一相同。
[0029]【具體實施方式】八:本實施方式與【具體實施方式】一至七之一不同的是:步驟三中電泳緩沖液的配制:lmmol/L Na2EDTA和300mmol/L NaOH。其它步驟及參數(shù)與【具體實施方式】一至七之一相同。
[0030]【具體實施方式】九:本實施方式與【具體實施方式】一至八之一不同的是:步驟四中EB染液的濃度為2 μ g/mlo其它步驟及參數(shù)與【具體實施方式】一至八之一相同。
[0031]采用以下實施例驗證本發(fā)明的有益效果:
[0032]實施例:
[0033]魚類肌肉組織細胞基因損傷檢測的彗星實驗方法，按以下步驟實現(xiàn):
[0034]一、稱取魚肌肉組織0.8mg，放入離心管中，加入400 μ L 4°C預(yù)冷的PBS，用科彎剪剪成糜狀，然后用勻漿器研磨，過100目篩網(wǎng)，再用2mL的PBS沖洗并濾去碎組織，取400 μ L濾液，置于離心管待用，獲得細胞懸液；步驟一的操作全程于0°C下進行；
[0035]二、彗星實驗采用雙層凝膠結(jié)構(gòu)，雙層凝膠制備好后，將載玻片放置在4°C冰箱中l(wèi)h，然后放入4°C預(yù)冷的新配制細胞裂解液中，4°C下避光裂解1.5h ;
[0036]三、裂解后將載玻片取出，用雙蒸水沖洗，然后放入盛有4°C的新配制電泳緩沖液的水平電泳槽中靜止30min，再在4°C，300mA，0.7V/cm的條件下電泳20min ；
[0037]四、電泳結(jié)束后將載玻片用去離子水沖洗3次，晾干后移去蓋玻片，將載玻片用50 μ I EB染液染色15min，然后用雙蒸水清洗，蓋上蓋玻片，用熒光顯微鏡觀察彗星圖像，在100倍熒光顯微鏡下隨機選取8?12個清晰細胞核圖像進行觀察并用CCD拍攝彗星圖像，然后用casp軟件分析圖像，再使用spss統(tǒng)計軟件分析結(jié)果，即完成魚類肌肉組織細胞基因損傷檢測的彗星實驗。
[0038]采用上述實施例的方法，選取黑龍江、吉林境內(nèi)的松花江全流域部分江段進行檢測。主要采集吉林省(長春市白山斷面，長春市松林?jǐn)嗝?、黑龍江省(哈爾濱市大頂子山斷面，齊齊哈爾市尼爾基水庫，佳木斯市佳木斯斷面，佳木斯市名山斷面，佳木斯市撫遠斷面)等地松花江流域水樣及春季開江底棲性鯉科魚類作為實驗對象。
[0039]圖1所示實驗結(jié)果為松花江干流哈爾濱江段鯉魚肌肉彗星結(jié)果圖，如圖所示，可明顯觀測到11個明顯的細胞核，通過casp軟件分析這些細胞核均不具有彗尾，即并未發(fā)現(xiàn)明顯DNA損傷細胞，DNA受損率為0%，表明該流域鯉魚無膳食攝入風(fēng)險，具有食用安全性。
[0040]圖2所示實驗結(jié)果為松花江干流哈爾濱江段鯽魚肌肉彗星結(jié)果圖，如圖所示，可明顯觀測到13個明顯的細胞核，通過casp軟件分析這些細胞核均不具有彗尾，即并未發(fā)現(xiàn)明顯DNA損傷細胞，DNA受損率為0%，表明該流域鯽魚無膳食攝入風(fēng)險，具有食用安全性。
【主權(quán)項】
1.一種魚類肌肉組織細胞基因損傷檢測的彗星實驗方法，其特征在于它按以下步驟實現(xiàn): 一、稱取魚肌肉組織0.8mg，放入離心管中，加入400 μ L 4°C預(yù)冷的PBS，用科彎剪剪成糜狀，然后用勻漿器研磨，過100目篩網(wǎng)，再用2mL的PBS沖洗并濾去碎組織，取400 μ L濾液，置于離心管待用，獲得細胞懸液；步驟一的操作全程于O?4°C下進行； 二、彗星實驗采用雙層凝膠結(jié)構(gòu)，雙層凝膠制備好后，將載玻片放置在4°C冰箱中0.8?1.2h，然后放入4°C預(yù)冷的新配制細胞裂解液中，4°C下避光裂解1.5h ; 三、裂解后將載玻片取出，用雙蒸水沖洗，然后放入盛有4°C的新配制電泳緩沖液的水平電泳槽中靜止30min，再在4°C，300mA，0.7V/cm的條件下電泳20min ； 四、電泳結(jié)束后將載玻片用去離子水沖洗3次，晾干后移去蓋玻片，將載玻片用50μ IEB染液染色15?20min，然后用雙蒸水清洗，蓋上蓋玻片，用熒光顯微鏡觀察彗星圖像，在100倍熒光顯微鏡下隨機選取8?12個清晰細胞核圖像進行觀察并用CCD拍攝彗星圖像，然后計算細胞受損率或用casp軟件分析圖像，再使用spss統(tǒng)計軟件分析結(jié)果，即完成魚類肌肉組織細胞基因損傷檢測的彗星實驗。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種魚類肌肉組織細胞基因損傷檢測的彗星實驗方法，其特征在于步驟一中魚肌肉取自鯉科魚類胸腔背部、側(cè)線與背鰭間肌肉。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種魚類肌肉組織細胞基因損傷檢測的彗星實驗方法，其特征在于步驟一中的操作全程于2°C下進行。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種魚類肌肉組織細胞基因損傷檢測的彗星實驗方法，其特征在于步驟一中PBS的濃度為0.01mol/L，pH為7.2?7。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種魚類肌肉組織細胞基因損傷檢測的彗星實驗方法，其特征在于步驟二中細胞裂解液的配制:2.5mol/L NaClU00mmol/L Na2EDTA、1mmoI/L Tris、臨用前加 10% DMSO 和 1% Triton X-1OO06.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種魚類肌肉組織細胞基因損傷檢測的彗星實驗方法，其特征在于步驟二中將載玻片放置在4°C冰箱中l(wèi)h。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種魚類肌肉組織細胞基因損傷檢測的彗星實驗方法，其特征在于步驟二中雙層凝膠的制備方法如下: (1)取45mg正常熔點瓊脂糖溶于6mLPBS，微波爐加熱使其充分溶解，制備成0.75%正常熔點瓊脂糖溶液，然后澆注到磨砂載玻片上，蓋上蓋玻片并于室溫下貯存至瓊脂糖凝固，移去蓋玻片，獲得第一層瓊脂糖； (2)取1mg低熔點瓊脂糖溶于2mLPBS，微波爐稍加熱使其充分溶解，制備成0.5%低熔點瓊脂糖溶液，待溫度降至35?38°C，取400 μ L細胞懸液與其混勻，然后將所得混合液加到第一層瓊脂糖上，蓋上蓋玻片，即完成雙層凝膠的制備。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種魚類肌肉組織細胞基因損傷檢測的彗星實驗方法，其特征在于步驟三中電泳緩沖液的配制:lmmol/L Na2EDTA和300mmol/L NaOH。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種魚類肌肉組織細胞基因損傷檢測的彗星實驗方法，其特征在于步驟四中EB染液的濃度為2 μ g/mlo
【專利摘要】一種魚類肌肉組織細胞基因損傷檢測的彗星實驗方法，它屬于環(huán)境對魚體遺傳毒理學(xué)評價領(lǐng)域。方法：一、制備魚肌肉組織的細胞懸液；二、彗星實驗采用雙層凝膠結(jié)構(gòu)，進行裂解；三、裂解后沖洗，放入電泳緩沖液中電泳；四、電泳結(jié)束后載玻片經(jīng)沖洗、晾干后移去蓋玻片，染色后清洗，蓋上蓋玻片，用熒光顯微鏡觀察彗星圖像，然后計算細胞受損率或分析圖像，再分析結(jié)果，即完成。本發(fā)明優(yōu)點在于具有高靈敏性，無需放射性示蹤，并且這種技術(shù)只需要少量細胞，操作簡單、直觀、檢測快速和具有良好經(jīng)濟性，相比試劑盒更為廉價；還為魚體遺傳毒性進行定性、定量化評價提供支持，了解其江河水產(chǎn)質(zhì)量、水質(zhì)情況及其魚體遺傳毒理現(xiàn)狀。
【IPC分類】G01N27/447, G01N21/84
【公開號】CN105044191
【申請?zhí)枴緾N201510443579
【發(fā)明人】楊林, 劉燁, 蔡繼翔, 梁明才, 李慧, 王正旋
【申請人】哈爾濱工業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年11月11日
【申請日】2015年7月24日