一種魚(yú)類肌肉組織細(xì)胞基因損傷檢測(cè)的彗星實(shí)驗(yàn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于環(huán)境對(duì)魚(yú)體遺傳毒理學(xué)評(píng)價(jià)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)水體中魚(yú)類肌肉組織細(xì)胞基因損傷程度的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]重金屬是污染水體及危害魚(yú)類食用安全性的重要因素。魚(yú)體過(guò)多富集重金屬，會(huì)導(dǎo)致機(jī)體的DNA損傷。檢測(cè)其中魚(yú)體DNA損傷，判斷其遺傳毒理對(duì)其食用安全性評(píng)價(jià)具有重要意義。彗星實(shí)驗(yàn)(Comet assay)又稱單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，是一種靈敏性高的遺傳毒性研究方法，已被用作檢測(cè)諸如DNA單鏈和雙鏈斷裂、堿性位點(diǎn)、不完全修復(fù)位點(diǎn)、DNA交聯(lián)等多種類型的DNA損傷。
[0003]鯉科魚(yú)類是中國(guó)居民的主要膳食魚(yú)肉來(lái)源，因此，檢測(cè)分析鯉科魚(yú)肉遺傳毒性程度對(duì)評(píng)價(jià)鯉科魚(yú)肉重金屬殘留、膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)、食用安全性及確保人類健康具有極其重要的應(yīng)用意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供一種魚(yú)類肌肉組織細(xì)胞基因損傷檢測(cè)的彗星實(shí)驗(yàn)方法，目的是檢測(cè)魚(yú)類食用安全性。
[0005]魚(yú)類肌肉組織細(xì)胞基因損傷檢測(cè)的彗星實(shí)驗(yàn)方法，按以下步驟實(shí)現(xiàn):
[0006]一、稱取魚(yú)肌肉組織0.8mg，放入離心管中，加入400 μ L 4°C預(yù)冷的PBS，用科彎剪剪成糜狀，然后用勻漿器研磨，過(guò)100目篩網(wǎng)，再用2mL的PBS沖洗并濾去碎組織，取400 μ L濾液，置于離心管待用，獲得細(xì)胞懸液；步驟一的操作全程于O?4°C下進(jìn)行；
[0007]二、彗星實(shí)驗(yàn)采用雙層凝膠結(jié)構(gòu)，雙層凝膠制備好后，將載玻片放置在4°C冰箱中
0.8?1.2h，然后放入4°C預(yù)冷的新配制細(xì)胞裂解液中，4°C下避光裂解1.5h ;
[0008]三、裂解后將載玻片取出，用雙蒸水沖洗，然后放入盛有4°C的新配制電泳緩沖液的水平電泳槽中靜止30min，再在4°C，300mA，0.7V/cm的條件下電泳20min ；
[0009]四、電泳結(jié)束后將載玻片用去離子水沖洗3次，晾干后移去蓋玻片，將載玻片用50 μ I EB染液染色15?20min，然后用雙蒸水清洗，蓋上蓋玻片，用熒光顯微鏡觀察彗星圖像，在100倍熒光顯微鏡下隨機(jī)選取8?12個(gè)清晰細(xì)胞核圖像進(jìn)行觀察并用CCD拍攝彗星圖像，然后計(jì)算細(xì)胞受損率或用casp軟件分析圖像，再使用spss統(tǒng)計(jì)軟件分析結(jié)果，即完成魚(yú)類肌肉組織細(xì)胞基因損傷檢測(cè)的彗星實(shí)驗(yàn)。
[0010]本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于具有高靈敏性，無(wú)需放射性示蹤，并且這種技術(shù)只需要少量細(xì)胞，操作簡(jiǎn)單、直觀、檢測(cè)快速和具有良好經(jīng)濟(jì)性，相比試劑盒更為廉價(jià)。在評(píng)價(jià)復(fù)合污染毒性時(shí)，可充分考慮污染物之間的相互作用，是評(píng)價(jià)復(fù)合污染的有效生物監(jiān)測(cè)手段。相對(duì)其他DNA損傷檢測(cè)方法，節(jié)約了時(shí)間和成本，可以檢測(cè)的魚(yú)類DNA損傷，為判斷是否具有毒理學(xué)安全，是否具有人體食用安全性提供依據(jù)。此外本發(fā)明還為魚(yú)體遺傳毒性進(jìn)行定性、定量化評(píng)價(jià)提供支持，了解其江河水產(chǎn)質(zhì)量、水質(zhì)情況及其魚(yú)體遺傳毒理現(xiàn)狀，可為進(jìn)一步的江河流域魚(yú)類食用安全性評(píng)價(jià)打下基礎(chǔ)。
[0011]本發(fā)明方法利用魚(yú)類，取其肌肉組織細(xì)胞進(jìn)行彗星實(shí)驗(yàn)，使用casp軟件可計(jì)算出細(xì)胞的TM值。當(dāng)TM〉I時(shí)就可認(rèn)為發(fā)生了 DNA損傷。通過(guò)視野內(nèi)計(jì)數(shù)觀察受損細(xì)胞所占比例數(shù)，判斷DNA損傷情況。根據(jù)受損率，為該流域魚(yú)類的毒理學(xué)安全評(píng)價(jià)提供理論基礎(chǔ)。
【附圖說(shuō)明】
[0012]圖1為實(shí)施例中鯉魚(yú)肌肉彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；
[0013]圖2為實(shí)施例中鯽魚(yú)肌肉彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0014]本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉【具體實(shí)施方式】，還包括各【具體實(shí)施方式】間的任意組合。
[0015]【具體實(shí)施方式】一:本實(shí)施方式魚(yú)類肌肉組織細(xì)胞基因損傷檢測(cè)的彗星實(shí)驗(yàn)方法，按以下步驟實(shí)現(xiàn):
[0016]一、稱取魚(yú)肌肉組織0.8mg，放入離心管中，加入400 μ L 4°C預(yù)冷的PBS，用科彎剪剪成糜狀，然后用勻漿器研磨，過(guò)100目篩網(wǎng)，再用2mL的PBS沖洗并濾去碎組織，取400 μ L濾液，置于離心管待用，獲得細(xì)胞懸液；步驟一的操作全程于O?4°C下進(jìn)行；
[0017]二、彗星實(shí)驗(yàn)采用雙層凝膠結(jié)構(gòu)，雙層凝膠制備好后，將載玻片放置在4°C冰箱中
0.8?1.2h，然后放入4°C預(yù)冷的新配制細(xì)胞裂解液中，4°C下避光裂解1.5h ;
[0018]三、裂解后將載玻片取出，用雙蒸水沖洗，然后放入盛有4°C的新配制電泳緩沖液的水平電泳槽中靜止30min，再在4°C，300mA，0.7V/cm的條件下電泳20min ；
[0019]四、電泳結(jié)束后將載玻片用去離子水沖洗3次，晾干后移去蓋玻片，將載玻片用50 μ I EB染液染色15?20min，然后用雙蒸水清洗，蓋上蓋玻片，用熒光顯微鏡觀察彗星圖像，在100倍熒光顯微鏡下隨機(jī)選取8?12個(gè)清晰細(xì)胞核圖像進(jìn)行觀察并用CCD拍攝彗星圖像，然后計(jì)算細(xì)胞受損率或用casp軟件分析圖像，再使用spss統(tǒng)計(jì)軟件分析結(jié)果，即完成魚(yú)類肌肉組織細(xì)胞基因損傷檢測(cè)的彗星實(shí)驗(yàn)。
[0020]本實(shí)施方式中使用casp軟件可計(jì)算出細(xì)胞的TM值；當(dāng)TM>1時(shí)就可認(rèn)為發(fā)生了DNA損傷。通過(guò)視野內(nèi)計(jì)數(shù)觀察受損細(xì)胞所占比例數(shù)，判斷DNA損傷情況。根據(jù)受損率，為該流域魚(yú)類的毒理學(xué)安全評(píng)價(jià)提供理論基礎(chǔ)。
[0021]【具體實(shí)施方式】二:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一不同的是:步驟一中魚(yú)肌肉取自鯉科魚(yú)類胸腔背部、側(cè)線與背鰭間肌肉。其它步驟及參數(shù)與【具體實(shí)施方式】一相同。
[0022]【具體實(shí)施方式】三:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】二不同的是:步驟一中的操作全程于2°C下進(jìn)行。其它步驟及參數(shù)與【具體實(shí)施方式】一相同。
[0023]【具體實(shí)施方式】四:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一至三之一不同的是:步驟一中PBS的濃度為0.01mol/L, pH為7.2?7。其它步驟及參數(shù)與【具體實(shí)施方式】一至三之一相同。
[0024]【具體實(shí)施方式】五:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一至四之一不同的是:步驟二中細(xì)胞裂解液的配制:2.5mol/L NaCU100mmol/L Na2EDTA、1mmoI/L Tris、臨用前加 10% DMSO和1% Triton X-100。其它步驟及參數(shù)與【具體實(shí)施方式】一至四之一相同。
[0025]【具體實(shí)施方式】六:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一至五之一不同的是:步驟二中將載玻片放置在4°C冰箱中l(wèi)h。其它步驟及參數(shù)與【具體實(shí)施方式】一至五之一相同。
[0026]【具體實(shí)施方式】七:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一至六之一不同的是:步驟二中雙層凝膠的制備方法如下:
[0027](I)取45mg正常熔點(diǎn)瓊脂糖溶于6mL PBS，微波爐加熱使其充分溶解，制備成
0.75%正常熔點(diǎn)瓊脂糖溶液，然后澆注到磨砂載玻片上，蓋上蓋玻片并于室溫下貯存至瓊脂糖凝固，移去蓋玻片，獲得第一層瓊脂糖；
[0028](2)取1mg低熔點(diǎn)瓊脂糖溶于2mL PBS，微波爐稍加熱使其充分溶解，制備成
0.5%低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液，待溫度降至35?38°C，取400 μ L細(xì)胞懸液與其混勻，然后將所得混合液加到第一層瓊脂糖上，蓋上蓋玻片，