通過耗盡白血細(xì)胞富集循環(huán)腫瘤細(xì)胞的制作方法
【專利說明】通過耗盡白血細(xì)胞富集循環(huán)腫瘤細(xì)胞
[0001] 相關(guān)專利申請
[0002] 本專利申請要求待審的臨時(shí)專利申請美國序列61/787611的優(yōu)先權(quán)，所述臨時(shí)專 利申請名稱為"ImprovedMolecularCharacterizationofCirculatingTumorCells(循 環(huán)腫瘤細(xì)胞的改善分子表征）"，于2013年3月15日提交。
【背景技術(shù)】
[0003] 上皮起源的循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC)以極低頻率（<10/ml血液）存在于癌患者的血液 中。循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞檢測可對于癌癥疾病管理具有重要性。低頻率細(xì)胞的檢測需要大量 血液體積用于處理。為了計(jì)數(shù)且表征來自大量血液體積的CTC，CTC的富集是必要的。
[0004] 幾種方法可用于基于大小、密度和抗原來富集CTC。充分建立的用于富集稀有細(xì)胞 的商業(yè)產(chǎn)品是VeridexCellSearchCTC測定。CellSearchCTC測定使用綴合至抗上皮細(xì) 胞粘附分子（EpCAM)的磁性顆粒，以捕獲來自7. 5ml血液的CTC。富集的樣品用DAPI(核酸 染料）進(jìn)行染色，以鑒定有核細(xì)胞，用綴合至藻紅蛋白的抗細(xì)胞角蛋白抗體進(jìn)行染色，以鑒 定上皮起源的細(xì)胞，且用綴合至別藻藍(lán)蛋白的抗白細(xì)胞抗體進(jìn)行染色，以鑒定所有白細(xì)胞。 樣品在CellTracks分析儀II上進(jìn)行分析，用于CTC計(jì)數(shù)。
[0005] 在富集后的最終樣品含有CTC和少量白血細(xì)胞（1000 - 5000個(gè)細(xì)胞）。富集方法 去除超過99%的白血細(xì)胞（WBC)。在稀有細(xì)胞計(jì)數(shù)期間的白血細(xì)胞的存在不是問題，不會(huì) 對過程有不利影響。。WBC可用白細(xì)胞標(biāo)記物（CD45)進(jìn)行標(biāo)記，從而使WBC與CTC區(qū)分。然 而，如果希望分子表征所枚舉的CTC，以通過擴(kuò)增此類CTC中存在的核酸來限定其基因型， 貝1J白細(xì)胞的存在不利地影響該表征。考慮到所枚舉級分中的白細(xì)胞比率與CTC數(shù)目相比較 很高，并且此類白細(xì)胞的核酸與CTC一起擴(kuò)增，測定核酸的來源，即CTC或白血細(xì)胞是困難 的。因此，進(jìn)一步純化富集樣品以去除白血細(xì)胞（減少白血細(xì)胞與CTC的比）將是開發(fā)可 靠的分子表征工具的主要里程碑。該需要通過以下發(fā)明得到滿足。
[0006] 不存在CTC富集后可用于去除白血細(xì)胞的方法。需要唯一的方法，因?yàn)閷⒉皇褂?用于富集CTC的相同原理。例如，如果第一步中的富集方法使用免疫磁性方法，則必須使用 除免疫磁性方法之外的另一種方法。
【附圖說明】
[0007] 圖1基于半抗原的白血細(xì)胞去除的描繪
[0008] 圖2在與抗FITC-起溫育前和溫育后的白血細(xì)胞分析 [0009]圖3白血細(xì)胞去除百分比
[0010]圖4耗盡和非耗盡樣品的分子測量
[0011] 圖5在⑶45耗盡后的檢測
[0012] 圖6伴隨白血細(xì)胞耗盡的摻料的Vcap細(xì)胞和培養(yǎng)的Vcap細(xì)胞之間的關(guān)聯(lián)
[0013] 圖7珠耗盡的效應(yīng)。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 本文描述的發(fā)明包含下述，基本上由下述組成或由下述組成：從包含富集的稀有 細(xì)胞和白血細(xì)胞的樣品中去除白血細(xì)胞的方法，此類方法包括：
[0015] (a)在用綴合至半抗原的此類白細(xì)胞標(biāo)記物標(biāo)記此類白血細(xì)胞的條件下，用綴合 至半抗原的白細(xì)胞標(biāo)記物處理此類樣品，
[0016] (b)用附著至此類標(biāo)記的白血細(xì)胞的第二介質(zhì)處理步驟（a)的組合物，并且使第 二介質(zhì)及其附著的標(biāo)記的白血細(xì)胞與步驟（b)的組合物分開。
[0017] 如本文所用，"白細(xì)胞標(biāo)記物"指標(biāo)記白血細(xì)胞而不是稀有細(xì)胞的物質(zhì)。白細(xì)胞標(biāo) 記物的例子包括但不限于針對⑶45、⑶19、⑶15、血型糖蛋白A、⑶2、⑶14、⑶16、CE38和CD66b的抗體。優(yōu)選的白細(xì)胞標(biāo)記物為抗CD45。半抗原包括但不限于熒光素染料（"FITC")、 藻紅蛋白（"PE"）、別藻藍(lán)蛋白（"APC"）和生物素。優(yōu)選的半抗原為FITC。如本文所用， 術(shù)語抗體包括單克隆和多克隆兩者的完整抗體、與某些半抗原結(jié)合的抗體片段、與某些半 抗原結(jié)合的雙特異性抗體。優(yōu)選的抗體為單克隆抗體。
[0018] 如本文所用，"第二介質(zhì)"意指包含除白細(xì)胞標(biāo)記物外的第二標(biāo)記物的任何表面。 此類第二標(biāo)記物與綴合至白細(xì)胞標(biāo)記物的半抗原結(jié)合。第二標(biāo)記物的例子包括但不限于針 對FITC、PE、APC的抗體，優(yōu)選的第二標(biāo)記物為針對FITC的抗體。可使用的表面的例子是微 量滴定板。
[0019] 如本文所用，"稀有細(xì)胞"是在血液中具有低頻率的細(xì)胞。稀有細(xì)胞的例子包括但 不限于循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC)、循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞（CEC)、循環(huán)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞（CMMC)和循環(huán)黑 素瘤細(xì)胞（CMC)。優(yōu)選的稀有細(xì)胞為CTC和CEC，特別優(yōu)選的稀有細(xì)胞為CTC。這些稀有細(xì) 胞的富集級分可通過已知方法由全血產(chǎn)生。此類方法包括但不限于下述專利和專利申請 中公開的方法和試劑：美國專利7, 901，950 ;6, 365, 362,美國專利公開US2009/0136946;US 2013/0189675;US2014/0011685,所述專利據(jù)此全文以引用方式并入。獲得富集的CTC的 優(yōu)選方法是通過參考文獻(xiàn)諸如美國專利6, 365, 362中公開的免疫磁性方法和CELLSEARCH 產(chǎn)品系列的方法。
[0020] 從CTC的富集級分中耗盡白血細(xì)胞的原理。如圖1中所示，CTC和白血細(xì)胞用抗 EpCAM鐵磁流體進(jìn)行標(biāo)記，并且白血細(xì)胞用白細(xì)胞綴合的半抗原進(jìn)行標(biāo)記。
[0021 ] 此外，本發(fā)明包括用于從包含富集的稀有細(xì)胞和白血細(xì)胞的樣品中去除白血細(xì)胞 的試劑盒，其中此類試劑盒包含綴合至半抗原的白細(xì)胞標(biāo)記物，以及除白細(xì)胞標(biāo)記物外的 第二標(biāo)記物，其中所述第二標(biāo)記物包含針對此類半抗原的抗體。
[0022] 所有限定的術(shù)語均具有與上文所述相同的定義和優(yōu)選例子。
[0023] 再進(jìn)一步地，本發(fā)明包括用于從包含富集的稀有細(xì)胞和白血細(xì)胞的樣品中去除白 血細(xì)胞的試劑盒，其中此類試劑盒包含用于免疫磁性標(biāo)記稀有細(xì)胞和白血細(xì)胞的試劑，綴 合至半抗原的白細(xì)胞標(biāo)記物，以及除白細(xì)胞標(biāo)記物外的第二標(biāo)記物，其中所述第二標(biāo)記物 包含針對此類半抗原的抗體。
[0024] 所有限定的術(shù)語均具有與上文所述相同的定義和優(yōu)選例子。
[0025] 本發(fā)明通過下述實(shí)例進(jìn)行舉例說明，所述實(shí)例不意在限制本發(fā)明的范圍。
[0026] 實(shí)您1
[0027]實(shí)例1 :伸用在微量滴宙板h涂布的抗CD45耗盡白血細(xì)朐
[0028] 本實(shí)例顯示了使用抗⑶45耗盡白血細(xì)胞。⑶45是白血細(xì)胞上存在的共同白細(xì)胞 標(biāo)記物，并且預(yù)期所有白血細(xì)胞均與抗CD45結(jié)合。我們使用抗CD45來結(jié)合白血細(xì)胞，并且 使用涂布有抗CD45的固相，從白血細(xì)胞和CTC的混合物中特異性去除白血細(xì)胞?？笴D45 如下涂布至固相：
[0029] 將抗CD45 (Veridex)在50mM碳酸氫鈉緩沖液pH8. 5中稀釋至50ug/ml。隨后將 0. 8ml抗⑶45抗體溶液加入6孔微量滴定板，在室溫（RT)下溫育3小時(shí)，隨后在2-8°C下 過夜。在過夜溫育后，抽吸抗⑶45抗體，并且將孔用lmlPBS/1 %BSA在RT下封閉4小時(shí)。 抽吸緩沖液，并且將孔用2mlPBS沖洗2次。在沖洗后，抽吸整個(gè)緩沖液，并且使板干燥1 小時(shí)。板在密封的塑料袋中在2-8°C下干燥貯存直至使用。
[0030] 在本實(shí)例中，完成兩個(gè)實(shí)驗(yàn)以測試使白血細(xì)胞與非白血細(xì)胞分開的原理。在一項(xiàng) 研究中，在使用BD裂解試劑裂解紅血細(xì)胞后，由全血制備純白血細(xì)胞。該樣品用作陽性對 照。在另一項(xiàng)研究中，使用CellSearchCTCProfile試劑盒，在CellTracksAutoPrep系統(tǒng) 上處理7. 5ml血液。CTCProfile試劑盒含有綴合至鐵磁流體磁性顆粒的抗上皮細(xì)胞粘附 分子（EpCAM)，用于捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞。在靶細(xì)胞富集后，將樣品重懸浮于900ulPBS/1% BSA緩沖液中。富集