電泳條碼測定裝置及其制造和使用方法
【專利說明】電泳條碼測定裝置及其制造和使用方法
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 根據(jù)35U.S.C. § 119(e)，本申請要求2012年11月12日提交的美國臨時專利申 請?zhí)?1/725,403和2013年3月14日提交的美國臨時申請?zhí)?1/783,942的申請日的優(yōu)先 權，各申請的公開內容以引用的方式并入本文。
【背景技術】
[0003] 驗證性診斷測定適用于消除假陽性篩選結果。舉例來說，在HCV或HIV診斷中，美 國疾病控制和預防中心（U. S. Center for Disease Control and Prevention ;CDC)推薦一 種篩選酶免疫測定，如酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA)，其中使用蛋白質印跡或免疫印跡進行陽 性結果的后續(xù)驗證。為了提供高于快速篩選測定的臨床靈敏性和特異性，驗證性印跡測定 單一樣品中的多種生物標志物。然而，即使在發(fā)達國家，公共衛(wèi)生中心也提出資金缺乏是可 能限制獲得HCV診斷法的因素。當考慮到欠發(fā)達國家時，獲得驗證性診斷學甚至具有更多 限制。驗證性印跡測定的獲得性限制可能部分地歸因于通常與這些類型的測定相關的高資 源消耗。在常規(guī)形式中，所述測定是費時、費力且成本高的，它們需要實驗室基礎設施和經(jīng) 過訓練的工作人員。舉例來說，驗證性診斷學目前由于繁重的、多階段方案而委托給集中實 驗室。執(zhí)行特異性生物標志物的存在的即時驗證的能力將積極地影響對于傳染性疾病如丙 型肝炎（HCV)和HIV的治療效力。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明提供了一種用于確定分析物是否存在于樣品中的微流體裝置。所述微流體 裝置包括具有聚合物介質的狹長流動通道，其中所述聚合物介質包括具有特異性結合于第 一分析物的第一固定捕捉成員的第一分析物檢測域和具有特異性結合于第二分析物的第 二固定捕捉成員的第二分析物檢測域。還提供其中可使用本發(fā)明微流體裝置的方法、系統(tǒng) 和試劑盒，以及其制造方法。
[0005] 本公開的多個方面包括微流體裝置。所述微流體裝置包括含有聚合物介質的狹長 流動通道，其中所述聚合物介質包括具有特異性結合于第一分析物的第一固定捕捉成員的 第一分析物檢測域和具有特異性結合于第二分析物的第二固定捕捉成員的第二分析物檢 測域。
[0006] 在一些實施方案中，所述聚合物介質包括聚合物凝膠。
[0007] 在一些實施方案中，所述第一固定捕捉成員在所述第一分析物檢測域中非共價結 合所述聚合物介質。在一些實施方案中，所述第一固定捕捉成員在所述第一分析物檢測域 中經(jīng)由特異性結合成員對非共價結合所述聚合物介質。在一些實施方案中，所述特異性結 合成員對包括生物素和抗生蛋白鏈菌素。在一些實施方案中，所述第一固定捕捉成員包括 結合所述聚合物介質的抗生蛋白鏈菌素和結合所述第一分析物的配體的生物素。
[0008] 在一些實施方案中，所述第二固定捕捉成員在所述第二分析物檢測域中非共價結 合所述聚合物介質。在一些實施方案中，所述第二固定捕捉成員在所述第二分析物檢測域 中經(jīng)由特異性結合成員對非共價結合所述聚合物介質。在一些實施方案中，所述特異性結 合成員對包括生物素和抗生蛋白鏈菌素。在一些實施方案中，所述第二固定捕捉成員包括 結合所述聚合物介質的抗生蛋白鏈菌素和結合所述第二分析物的配體的生物素。
[0009] 本公開的多個方面包括一種確定分析物是否存在于樣品中的方法。所述方法包括 將樣品引入包括聚合物介質的狹長流動通道中，其中所述聚合物介質包括具有特異性結合 第一分析物的第一固定捕捉成員的第一分析物檢測域和具有特異性結合第二分析物的第 二固定捕捉成員的第二分析物檢測域。所述方法還包括以足以移動組分通過所述聚合物介 質的方式將定向電場施加于所述狹長流動通道，以及從所述第一分析物檢測域和所述第二 分析物檢測域獲得信號以確定所述第一分析物和所述第二分析物是否存在于所述樣品中。 [0010] 在一些實施方案中，所述方法包括在將所述樣品引入所述狹長流動通道中之前標 記所述樣品。
[0011] 在一些實施方案中，所述方法包括在所述樣品引入所述狹長流動通道中之后將標 記引入所述狹長流動通道中。在一些實施方案中，所述標記包括特異性結合分析物的抗體。 在一些實施方案中，所述標記包括焚光部分。
[0012] 在一些實施方案中，所述分析物包括抗體。
[0013] 在一些實施方案中，所述樣品為生物樣品。在一些實施方案中，所述樣品包括血 液、血液制品、尿液或唾液。
[0014] 本公開的多個方面包括一種用于測定流體樣品中兩種或更多種分析物的存在的 系統(tǒng)。所述系統(tǒng)包括根據(jù)本公開實施方案的微流體裝置和檢測器。
[0015] 在一些實施方案中，所述系統(tǒng)還包括配置為引導流體通過所述微流體裝置的微流 體組件。
[0016] 本公開的多個方面包括一種試劑盒，其包括根據(jù)本公開實施方案的微流體裝置和 配置為容納所述微流體裝置的包裝。
[0017] 本公開的多個方面包括一種制造微流體測定裝置的方法。所述方法包括在狹長流 動通道中制造前體聚合物介質，其中所述前體聚合物介質包括特異性結合對的第一成員。 所述方法還包括以足以制造包括特異性結合所述狹長流動通道中的第一分析物的第一固 定捕捉成員的第一分析物檢測域的方式，將規(guī)定量的具有結合所述特異性結合對的第二成 員的第一抗原的第一捕捉成員引入所述狹長流動通道中。所述方法還包括以足以制造間隔 域的方式將規(guī)定量的所述特異性結合對的所述第二成員引入所述狹長流動通道中，以及以 足以制造包括特異性結合所述狹長流動通道中的第二分析物的第二固定捕捉成員的第二 分析物檢測域的方式將規(guī)定量的具有結合所述特異性結合對的所述第二成員的第二抗原 的第二捕捉成員引入所述狹長流動通道中，以制造微流體測定裝置。
【附圖說明】
[0018] 圖1(a)示出根據(jù)本公開的實施方案在玻璃芯片中的微通道和在通道中的具有生 物素阻斷的間隔區(qū)的4個抗原條帶（生物素和AF-488標記的clOOp)的圖像。圖I (b)示 出圖案化步驟的詳情：（1)注射和固定；（2)孵育；（3)過量材料的反洗滌；(4)針對下一個 試劑（例如生物素）重復以上步驟。圖1(c)示出clOOp抗原和抗體信號（10分鐘測定， 2 μ g/ml，13nM HCV-clOOp人類AB)的圖像。圖I (d)示出由NS3和ClOOp抗原捕捉的HCV 人類AB(2μg/ml，13nM于2%血清中）的測定結果的示意圖和曲線圖。用AF-568標記的 二次抗體進行檢測（5min負載和5min洗絳）。所述曲線圖比較了 2μg/ml HCV AB信號與 2%健康血清信號（陰性對照）。多階段測定總時間為30分鐘。除了圖1(a)中的芯片圖 像，比例尺均為100 μ m長。
[0019] 圖2示出根據(jù)本公開的實施方案的用于多重蛋白檢測的微流體條碼測定。圖2(A) 示出具有6條簡單筆直（2. 5_長）微通道的17. 5_ X 17. 5_玻璃芯片的圖像，各微通道 容納抗生蛋白鏈菌素-PA凝膠。圖2(B)示出四個c100 p-AF488抗原條帶和交錯的生物素間 隔區(qū)的熒光顯微照片。圖2(C)示出電泳圖案化工藝的示意圖，所述工藝包括：（步驟1-3) 生物素阻斷以經(jīng)由電泳負載創(chuàng)建入口區(qū)域間隔區(qū)、孵育以及反極性場以去除未結合的生物 素；以及（步驟4-6)在經(jīng)由電泳引入創(chuàng)建間隔區(qū)后圖案化生物素化抗原、1分鐘孵育以及 反極性電泳去除未結合的生物素化抗原。針對各后續(xù)試劑-間隔區(qū)對圖案，重復步驟1-6。
[0020] 圖3示出抗體夾心測定的示意圖：血清樣品通過其中捕捉對應靶標抗體的涂抹 過的抗原區(qū)域以電泳方式遞送到通道篩中。在下一個步驟中，用以電泳方式負載的熒光標 記的抗人類二次抗體進行檢測。底部圖像示出根據(jù)本公開的實施方案，來自加入1 μ g/ml HCV-clOOp抗體的2%人類血清樣品的抗體信號。使用AF-568標記的抗人類山羊抗體進行 熒光檢測。
[0021] 圖4示出根據(jù)本公開的實施方案的電泳條碼圖案化工藝的表征和優(yōu)化。圖4(A)示 出用于生物素化clOOp抗原（AF-488標記）的圖案化工藝的慢速拍攝熒光顯微照片（IOs/ 幀）。區(qū)域（i)先前用生物素阻斷（間隔區(qū)）。區(qū)域（ii)為用生物素化clOOp圖案化的區(qū) 域。在t = 140s時，去除電場并且開始孵育。在反極性電泳洗滌后，區(qū)域ii已經(jīng)用clOOp 圖案化并且區(qū)域iii中的開放抗生蛋白鏈菌素-PA凝膠位點可用于后續(xù)用生物素間隔區(qū)或 生物素化抗原圖案化。圖4(B)示出如通過軸向熒光強度的突破等溫線所觀察到的圖案化 過程的曲線圖（生物素化c100 p，AF-488標記）；從t = 0時起采用5s增量的前11個曲線。 圖4(C)示出熒光顯微照片，所述照片示出在各種Da數(shù)值下的抗原固定。移動邊界的熒光 強度曲線和一階導數(shù)示出在圖4(C)中的熒光顯微照片下方。圖4(D)示出在各種Da數(shù)值 下用于圖案化的移動邊界的寬度（4 〇)的曲線圖。
[0022] 圖5示出移動邊界的速度的曲線圖，其隨電場呈線性增加（Vi= μ iE/n)，其中斜 率2. 2χ10-5αιι2ν?是迀移率（μ J與增強因子（η)的比率。在30V/cm下，800 μπι長的區(qū) 域的圖案化耗時160秒，而在1180V/cm下，圖案化耗時約3秒。
[0023] 圖6示出根據(jù)本公開的實施方案，交叉反應性和固定抗原的純度。圖6(a)示出 的圖像展示HCV clOOp固定于3個不同通道中并且注射HCV NS3、clOOp和Core人類抗體 (AF568標記）（6. 65nM，lug/ml)。僅捕捉到clOOp抗體并且其產(chǎn)生信號。圖6 (b)示出三種 HCV抗體抗原對的交叉反應性基質。Core抗原展示所預期的一些非特異性捕捉，而NS3和 clOOp對未展現(xiàn)任何交叉反應性。圖6(c)示出的圖像和曲線圖展示，NS3和clOOp抗原分 別固定于同一通道中。注射至所述通道中的NS3抗體通過clOOp抗原區(qū)而未被捕捉并且僅 在NS3區(qū)中被捕捉。注射至同一通道中的clOOp抗體在clOOp區(qū)中被捕捉。圖6(d)示出 的圖像和曲線圖類似于圖6(c)，其中固定抗原的順序和抗體注射順序顛倒，其中在NS3抗 原區(qū)中未觀察到clOOp抗體捕捉。各抗體均在其對應抗原區(qū)中被捕捉，而與固定順序無關。
[0024] 圖7示出根據(jù)本公開的實施方案，條碼測定抗體檢測條件的優(yōu)化。圖7(A)示出 引入12種不同的條碼測定（在一系列Da數(shù)值下操作）中的抗體的熒光顯微照片，其展示 檢測依賴于Da數(shù)值。將AF-568標記的clOOp抗體的溶液（13. 5nM)使用一個范圍的電壓 (10-450V，10min)電泳至容納固定的生物素化clOOp抗原的通道中。圖7(B)示出來自用于 圖7(A)中的測定的標記的抗體的終點熒光讀數(shù)的曲線圖。圖7(C)示出加入2%人類血清 中的未標記的HCV-clOOp人類抗體的劑量反應曲線。使用AF-568標記的山羊抗人類抗體 進行夾心檢測。檢測的下限是25ng/ml或165pM，其中SNR = 10。
[0025] 圖8示出根據(jù)本公開的實施方案，固定條件對抗體捕捉的作用。其中抗原在不同 電場（17V/cm和1180V/cm)下固定的通道用來自正確方向的clOOp (AF-568)抗體負載進行 測試。圖8(底部）示出在兩種指定的負載條件下固定的兩個不同通道的抗體捕捉輪廓。 在兩個通道中，抗體負載參數(shù)相同（25V)并且捕捉僅發(fā)生在抗原固定區(qū)（ii)中，證實區(qū)域 (iii)在所有情況下均保持抗原游離。類似于固定抗原分布，在其中在1180V/cm下進行抗 原固定的通道中觀察到抗體信號的較平滑邊界，其中在邊界處的橫向信號變化增加。
[0026] 圖9示出在高電場下凝膠變形的圖像。在450V(1800V/cm)下針對clOOp抗原條 帶負載AF-568標記的clOOp抗體。在所述負載的最初幾分鐘內，變形是沿負載方向（凸起 至左側）。隨著左側孔中緩沖液的損失，變形朝向右側改變方向。在左側孔中緩沖液的損失 可歸因于在施加高電壓后流體從左側孔通過凝膠基質或凝膠-玻璃壁界面內的變形電滲 泵送至右側孔中。當關閉所施加的電壓時，凝膠輪廓恢復其最初形式。
[0027] 圖10示出根據(jù)本公開的實施方案，用于對血清抗體檢測HIV和HCV的多重微流體 條碼測定。圖1〇(頂部）示出通道1中的蛋白L、HCV-c100 p和HIV-p24抗原分布。通道1 針對加入2 μ g/ml (13. 5nM)HCV-c100 p人類和HVI-24p小鼠抗體的2%血清樣品進行測定。 類似圖案化的通道2針對作為對照的非免疫2%血清進行測定。使用AF-568標記的抗人類 抗小鼠抗體的混合物進行檢測。蛋白L區(qū)在兩個通道中展示飽和信號，其證實血清中捕捉 高度可用的IgG，從而驗證測定成功。HCV-clOOp和HIV-24抗體在通道1中產(chǎn)生高信號，如 熒光強度輪廓所示?？贵w顯微照片的曝光時間為100ms。
【具體實施方式】
[0028] 提供一種用于確定分析物是否存在于樣品中的微流體裝置。所述微流體裝置包括 具有聚合物介質的狹長流動通道，其中所述聚合物介質包括具有特異性結合第一分析物的 第一固定捕捉成員的第一分析物檢測域和具有特異性結合第二分析物的第二固定捕捉成 員的第二分析物檢測域。還提供其中可使用本發(fā)明微流體裝置的方法、系統(tǒng)和試劑盒，以及 其制造方法。
[0029] 在下文中，首先更詳細地描述本發(fā)明微流體裝置。還公開了檢測流體樣品中的分 析物的方法，其中可使用本發(fā)明微流體裝置。另外，還描述了包括本發(fā)明微流體裝置的系統(tǒng) 和試劑盒。
[0030] 微流體裝置
[0031] 本公開的實施方案包括微流體裝置。在某些實施方案中，所述微流體裝置被配置 用于確定分析物是否存在于樣品中。"微流體裝置"是配置為控制并操縱流體在幾何學上限 定于小標度（例如，亞毫米）的裝置。微流體裝置的實施方案包括狹長流動通道和在所述 狹長流動通道中的聚合物介質。所述聚合物介質包括具有特異性結合第一分析物的第一固 定捕捉成員的第一分析物檢測域和具有特異性結合第二分析物的第二固定捕捉成員的第 二分析物檢測域。隨后可檢測到一種或多種特異性結合的分析物。下文討論了關于聚合物 介質的其它細節(jié)。
[0032] 聚合物介質
[0033] 在某些實施方案中，所述微流體裝置包括聚合物介質。所述聚合物介質可包括一 個或多個分析物檢測域，各檢測域具有特異性結合樣品中感興趣的分析物的對應固定分析 物捕捉成員。例如，所述聚合物介質可包括具有特異性結合第一分析物的第一固定分析物 捕捉成員的第一分析物檢測域和具有特異性結合第二分析物的第二固定分析物捕捉成員 的第二分析物檢測域。必要時可包括額外分析物檢測域和捕捉成員。
[0034] 所述聚合物介質可配置為具有針對各分析物捕捉成員的獨立區(qū)域或條帶。"條帶" 意指獨特的可檢測區(qū)域，其中成分的濃度顯著高于周圍的區(qū)域。分析物捕捉成員的各條帶 可包括單一類型的分析物捕捉成員。
[0035] 在某些實施方案中，所述聚合物介質被配置為當樣品穿過所述聚合物介質時，結 合所述樣品中的一種或多種成分。在一些情況下，聚合物介質的分析物捕捉成員被配置為 當樣品流動通過如上文所述的聚合物介質時，特異性結合所述樣品中的成分。聚合物介質 的多個方面包括，所述聚合物介質具有定向軸。在一些情況下，所述定向軸在當樣品穿過所 述聚合物介質時所述樣品行進的方向中定向。在一些實施方案中，聚合物介質的定向軸與 聚合物介質的長度對準。在這些實施方案中，樣品沿聚合物介質的長度穿過聚合物介質。 在一些情況下，聚合物介質的長度大于聚合物介質的寬度，如為聚合物介質的寬度的2倍、 3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、75倍、100倍、125倍、150倍、175倍或200倍或更多倍。
[0036] 在一些情況下，聚合物介質由微流體裝置中包括所述聚合物介質的區(qū)域界定。舉 例來說，微流體裝置可包括如上文所述的狹長流動通道。所述狹長流動通道可包括聚合物 介質。例如，微流體裝置可包括通道（例如，微流體通道或毛細管通道）。所述通道可包括 聚合物介質。聚合物介質可包括于通道中，以使得當樣品流動通過所述通道時，樣品穿過所 述聚合物介質。在一些情況下，狹長流動通道的長度大于狹長流動通道的寬度，如為狹長流 動通道的寬度的2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、75倍、100倍、125倍、150倍、175 倍或200倍或更多倍。
[0037] 在某些實施方案中，所述聚合物介質包括聚合物，如聚合物凝膠。所述聚合物凝膠 可為適用于凝膠電泳的凝膠。所述聚合物凝膠可包括但不限于聚丙烯酰胺凝膠（例如甲 基丙烯酰胺凝膠）、瓊脂糖凝膠等。所述聚合物介質可基于多種因素進行表征，例如但不限 于孔徑、總聚合物含量（例如，總丙烯酰胺含量）、交聯(lián)劑濃度等。例如，聚合物介質的孔徑 可取決于聚合物介質的總聚合物含量和/或聚合物介質中的交聯(lián)劑濃度。在一些情況下， 聚合物介質可包括聚丙烯酰胺凝膠，其具有范圍為1 %至20%、如1 %至15%、包括1 %至 10 %或1 %至5%的總丙烯酰胺含量T (T =丙烯酰胺和雙丙烯酰胺單體的總濃度）。在一些 情況下，聚合物介質具有3%的總丙烯酰胺含量。
[0038] 在某些實施方案中，聚合物介質被配置為由前體部分形成。例如，聚合物介質可為 由凝膠前體（例如聚丙烯酰胺凝膠前體，如聚丙烯酰胺凝膠單體）形成的凝膠（例如聚丙 烯酰胺凝膠）。所述前體部分可被配置為反應形成所述聚合物介質。例如，凝膠前體可被 配置為彼此反應形成聚丙烯酰胺凝膠聚合物介質。凝膠前體之間的反應可通過任何合適的 方案進行活化，例如但不限于化學活化、光活化等。在一些實施方案中，凝膠前體被配置為 例如通過使凝膠前體與活化劑（如但不限于過氧化物）接觸而以化學方式活化。在一些實 施方案中，凝膠前體被配置為例如通過使凝膠前體與光接觸來通過光活化（即，光活化）。 光可具有適于活化聚合物介質的形成的任何波長，并且在一些情況下可具有與可見光譜中 的藍光有關的波長。例如，用于活化聚合物介質的形成的光可具有范圍為400nm至500nm、 如 410nm 至 490nm、包括 420nm 至 480nm、或 430nm 至 480nm、或 440nm 至 480nm、或 450nm 至 480nm、或460nm至480nm、或465nm至475nm的波長。在某些情況下，用于活化聚合物介質 的形成的光具有范圍為465nm至475nm的波長。在一些情況下，用于活化聚合物介質的形 成的光具有470nm波長。
[0039] 在某些實施方案中，所述聚合物介質包括緩沖液。所述緩沖液可為用于凝膠電泳 的任何常規(guī)緩沖液。在某些實施方案中，所述緩沖液為Tris緩沖液。在某些實施方案中， 所述聚合物介質包括緩沖液，如Tris-甘氨酸緩沖液（TG緩沖液）。例如，所述緩沖液可包 括Tris和甘氨酸的混合物。
[0040] 聚合物介質的至少一部分（例如，分析物檢測域）可包括穩(wěn)定地與其締合的捕捉 成員。"穩(wěn)定地締合"意指一個部分在標準條件下非共價結合另一部分或結構或以其它方式 與另一部分或結構締合。在某些情況下，支撐物是如上文所述的聚合物介質（例如，聚合物 凝膠）。在某些實施方案中，捕捉成員非共價結合聚合物介質。非共價相互作用可包括但不 限于離子鍵、疏水性相互作用、氫鍵、范德華力（例如，倫敦分散力）、偶極-偶極相互作用 等。在某些實施方案中，捕捉成員經(jīng)由特異性結合成員對非共價結合支撐物（例如，聚合物 介質）。合適的特異性結合對包括但不限于：受體/配體對的成員；受體的配體結合部分； 抗體/抗原對的成員；抗體的抗原結合片段；半抗原；凝集素/碳水化合物對的成員；酶/ 底物對的成員；生物素/抗生物素蛋白；生物素/抗生蛋白鏈菌素；地高辛/抗地高辛；DNA 或RNA適體結合對的成員；肽適體結合對的成員；等。
[0041] 在某些實施方案中，捕捉成員可通過特異性結合成員對非共價結合聚合物介質， 其中聚合物介質包括所述特異性結合成員對的一個成員并且捕捉成員包括所述特異性結 合成員對的互補成員。例如，聚合物介質可包括抗生蛋白鏈菌素。在一些情況下，抗生蛋白 鏈菌素可與聚合物介質的聚合物凝膠共聚合。另外，捕捉成員可包括特異性結合成員對的 互補成員，如生物素。在這些實施方案中，使生物素化捕捉成員與抗生蛋白鏈菌素-聚合物 介質接觸可通過所述捕捉成員的生物素與所述聚合物介質的抗生蛋白鏈菌素之間的特異 性結合相互作用來使所述捕捉成員非共價結合所述聚合物介質。捕捉成