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用于檢測(cè)磷含量的試劑盒及測(cè)定磷含量的方法與流程

文檔序號(hào):11131729閱讀:1078來(lái)源:國(guó)知局

本發(fā)明涉及食品領(lǐng)域。具體地,本發(fā)明涉及用于檢測(cè)磷含量的試劑盒及測(cè)定磷含量的方法。



背景技術(shù):

乳及乳制品中磷含量的測(cè)定主要依據(jù)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5413.22-2010《嬰幼兒食品和乳品中磷的測(cè)定》,其原理為:試樣經(jīng)酸氧化,使磷在硝酸溶液中與釩鉬酸銨生成黃色絡(luò)合物。用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)440nm處測(cè)定吸光度,其顏色的深淺與磷的含量成正比。

然而,目前測(cè)定磷含量的方法仍有待改進(jìn)。



技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問(wèn)題之一。為此,本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供用于檢測(cè)磷含量的試劑盒及測(cè)定磷含量的方法,由此,能夠準(zhǔn)確地測(cè)定磷含量,且能夠?qū)崿F(xiàn)快速、批量檢測(cè)。

在本發(fā)明的第一方面,本發(fā)明提出了一種用于檢測(cè)磷含量的試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例,所述試劑盒包括:指示劑,所述指示劑為0.2體積%的對(duì)硝基酚溶液;顯色劑,所述顯色劑包括鉬酸銨、偏釩酸銨、硝酸及水;以及調(diào)解液,所述調(diào)解液包括0.2mol/L硝酸溶液、6mol/L第一氫氧化鈉溶液以及0.1mol/L第二氫氧化鈉溶液。由此,根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的用于檢測(cè)磷含量的試劑盒能夠準(zhǔn)確地測(cè)定磷含量,且能夠?qū)崿F(xiàn)快速、批量檢測(cè)。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例,上述用于檢測(cè)磷含量的試劑盒還可以具有下列附加技術(shù)特征:

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例,所述試劑盒進(jìn)一步包括:磷標(biāo)準(zhǔn)品溶液;以及多孔板。由此,根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的用于檢測(cè)磷含量的試劑盒能夠準(zhǔn)確地測(cè)定磷含量,且能夠?qū)崿F(xiàn)快速、批量檢測(cè)。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例,基于20mL所述顯色劑,所述顯色劑包括0.5g鉬酸銨、0.025g偏釩酸銨、5mL硝酸以及15mL蒸餾水。由此,根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的用于檢測(cè)磷含量的試劑盒能夠準(zhǔn)確地測(cè)定磷含量,且能夠?qū)崿F(xiàn)快速、批量檢測(cè)。

需要說(shuō)明的是,對(duì)于顯色劑的提供形式不作嚴(yán)格限定,既可以將每種成分以獨(dú)立的包裝提供,需要使用時(shí)按照上述配比配置得到,也可以以混合液的形式提供,無(wú)需自行配置,直接使用即可。

還需要說(shuō)明的是,調(diào)解液中各種溶液是分別以獨(dú)立包裝的形式提供的。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例,所述多孔板包括6孔板、24孔板或96孔板。由此,根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的用于檢測(cè)磷含量的試劑盒能夠準(zhǔn)確地測(cè)定磷含量,且能夠?qū)崿F(xiàn)快速、批量檢測(cè)。

發(fā)明人發(fā)現(xiàn),國(guó)標(biāo)GB5413.22-2010測(cè)定磷含量時(shí),由于利用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度,導(dǎo)致每批只能檢測(cè)少量樣品,無(wú)法完成樣品的批量處理,效率低。此外,反應(yīng)體系的體積較大,所需試劑量較多,造成浪費(fèi)。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的試劑盒包括多孔板,進(jìn)而能夠批量處理樣品,節(jié)省時(shí)間和成本,提高效率。

發(fā)明人進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),對(duì)于不同體積的反應(yīng)體系,各反應(yīng)物之間的相互作用并不完全相同,進(jìn)而,并不能直接保持國(guó)標(biāo)方法中各試劑濃度,僅將體積等比例縮小后直接用于本申請(qǐng),否則將導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。發(fā)明人經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得到試劑的濃度及比例關(guān)系,從而使得檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性較高。

需要說(shuō)明的是,本發(fā)明對(duì)磷標(biāo)準(zhǔn)品溶液的提供形式不作嚴(yán)格限定,既可以提供多個(gè)不同濃度的磷標(biāo)準(zhǔn)品溶液,直接將其應(yīng)用于檢測(cè),以繪制濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體地,不同濃度的磷標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別以獨(dú)立包裝形式提供。還可以僅提供一個(gè)高濃度的磷標(biāo)準(zhǔn)品溶液,然后根據(jù)使用者的需要對(duì)其進(jìn)行稀釋,以便于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例,所述用于檢測(cè)磷含量的試劑盒進(jìn)一步包括:高氯酸和硝酸。高氯酸和硝酸用于將樣品進(jìn)行消解。

在本發(fā)明的第二方面,本發(fā)明提出了一種利用前面所描述的試劑盒測(cè)定磷含量的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例,所述方法包括:采用已知的方法對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行消解處理,并將所得到的消解產(chǎn)物冷卻,得到預(yù)測(cè)液;將所述預(yù)測(cè)液轉(zhuǎn)移至容量瓶中,向所述容量瓶中加入所述指示劑,用所述第一氫氧化鈉溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)至溶液為黃色,再用所述硝酸溶液調(diào)節(jié)至溶液為無(wú)色,最后用所述第二氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至溶液為微黃色,并定容,得到待測(cè)液;分別將所述磷標(biāo)準(zhǔn)品溶液和待測(cè)液置于所述孔板中,向所述孔板中加入所述顯色劑,混勻后靜置,并將所述孔板置于酶標(biāo)儀中進(jìn)行檢測(cè);以及基于檢測(cè)結(jié)果確定所述待測(cè)樣品中磷含量。由此,根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的方法能夠準(zhǔn)確地測(cè)定磷含量,且能夠?qū)崿F(xiàn)快速、批量檢測(cè)。

需要說(shuō)明的是,對(duì)于待測(cè)樣品的種類及來(lái)源不作嚴(yán)格限定,可以根據(jù)實(shí)際情況而定,既可以是固態(tài)樣品,也可以是液態(tài)樣品。具體地,可以為食品類物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例,待測(cè)樣品可以為乳制品。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例,基于1μL所述顯色劑,所述磷標(biāo)準(zhǔn)品溶液及待測(cè)液的添加量均為0.5μL。由此,根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的方法能夠準(zhǔn)確地測(cè)定磷含量,且能夠?qū)崿F(xiàn)快速、批量檢測(cè)。

發(fā)明人發(fā)現(xiàn),本發(fā)明是在孔板中進(jìn)行的,反應(yīng)體積遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于國(guó)標(biāo)方法的反應(yīng)體積。對(duì)于不同體積的反應(yīng)體系,各反應(yīng)物之間的相互作用并不完全相同,進(jìn)而,并不能直接將國(guó)標(biāo)方法的反應(yīng)體積比(即待測(cè)液/標(biāo)準(zhǔn)品與顯色劑的體積比)應(yīng)用于本申請(qǐng),否則將導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性低。由此,發(fā)明人經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得到上述最優(yōu)磷標(biāo)準(zhǔn)品溶液、待測(cè)液及顯色劑的添加量。添加量過(guò)高或者過(guò)低都將影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

此外,國(guó)標(biāo)方法中將冷卻的消解產(chǎn)物進(jìn)行定容,再取10mL定容后的溶液于50mL容量瓶中調(diào)節(jié)pH值,而本發(fā)明的方法中直接將冷卻的消解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至容量瓶中,進(jìn)行調(diào)節(jié)pH值,減少了定容步驟,進(jìn)一步縮短了檢測(cè)時(shí)間。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例,所述方法包括:

采用已知的方法對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行消解處理,并將所得到的消解產(chǎn)物冷卻,得到預(yù)測(cè)液;

將所述預(yù)測(cè)液轉(zhuǎn)移至容量瓶中,向所述容量瓶中加入0.10~0.15mL所述指示劑,用所述第一氫氧化鈉溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)至溶液為黃色,再用所述硝酸溶液調(diào)節(jié)至溶液為無(wú)色,最后用所述第二氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至溶液為微黃色,并用水定容至100mL,得到待測(cè)液;

分別將100μL所述磷標(biāo)準(zhǔn)品溶液和100μL待測(cè)液置于所述96孔板中,向所述96孔板中加入200μL所述顯色劑,混勻后靜置10~15min,將所述96孔板置于酶標(biāo)儀中,在440nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度;以及

根據(jù)所述磷標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度和吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并將所述待測(cè)液的吸光度代入所述標(biāo)準(zhǔn)曲線中,計(jì)算得到所述待測(cè)樣品中的磷含量。

發(fā)明人經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),采用96孔板進(jìn)行反應(yīng),能夠同時(shí)檢測(cè)大量的待測(cè)物質(zhì),極大地提高了檢測(cè)效率。進(jìn)一步地,發(fā)明人發(fā)現(xiàn),在96孔板的檢測(cè)條件下,所需的磷標(biāo)準(zhǔn)品溶液、待測(cè)液及顯色劑添加量分別為100μL、100μL、200μL。在此條件下能夠準(zhǔn)確地測(cè)定磷含量。添加量過(guò)多或者過(guò)少都將影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

此外,發(fā)明人發(fā)現(xiàn),采用量程為100mL的容量瓶進(jìn)行定容,更有利于檢測(cè)。具體地,由于直接將消解產(chǎn)物進(jìn)行定容,使得后續(xù)調(diào)節(jié)pH值所需要的調(diào)解液量偏多。若采用50mL量程的容量瓶,不容易混勻,且用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)時(shí)需要加入較多體積溶液,容易超出量程。進(jìn)而,發(fā)明人經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),采用100mL量程的容量瓶,不僅能夠快速地混勻調(diào)解液與消解產(chǎn)物,便于滴定,且不會(huì)超出量程,使得檢測(cè)過(guò)程操作簡(jiǎn)便、快速。

由此,根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的方法能夠準(zhǔn)確地測(cè)定磷含量,且能夠?qū)崿F(xiàn)快速、批量檢測(cè)。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例,“采用已知的方法對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行消解處理”的具體步驟如下:

稱取0.5g固體試樣或2.5g液體試樣(精確至0.1mg)于125mL三角瓶中,放入幾粒玻璃球,加10mL硝酸,然后放在電熱板上加熱。待劇烈反應(yīng)結(jié)束后取下,稍冷卻,再加入10mL高氯酸,重新放于電熱板上加熱。若消化液變黑,需取下再加入5mL硝酸繼續(xù)消化,直到消化液變成無(wú)色或淡黃色,且冒出白煙,在消化液剩下3mL~5mL時(shí)停止消解處理。

需要說(shuō)明的是,對(duì)于高氯酸和硝酸的來(lái)源不作嚴(yán)格限定,既可以通過(guò)市售獲得,也可以由前面所描述的試劑盒提供。

本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出,部分將從下面的描述中變得明顯,或通過(guò)本發(fā)明的實(shí)踐了解到。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的方案進(jìn)行解釋。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解,下面的實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明,而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件的,按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者,均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1

在該實(shí)施例中,按照下列方法測(cè)定樣品中磷含量。

1.1樣品測(cè)定

1.1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確吸取100μL磷標(biāo)準(zhǔn)品溶液于標(biāo)準(zhǔn)板孔內(nèi),再加入顯色劑200μL,混勻,25~30℃下顯色15分鐘,于酶標(biāo)儀上在440nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光值,以吸光值為縱坐標(biāo),磷含量為橫坐標(biāo)繪制曲線。

表1:100μL標(biāo)準(zhǔn)品+200μL顯色劑檢測(cè)數(shù)據(jù)

備注:每個(gè)濃度點(diǎn)平行檢測(cè),取吸光度平均值;凈吸光值為各濃度點(diǎn)檢測(cè)值減去零點(diǎn)吸光值的檢測(cè)值。

結(jié)果如表1所示。以凈吸光值為縱坐標(biāo),磷標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)繪制曲線,曲線方程為y=0.008x+0.002(R2=0.997),曲線線性好,符合方法要求的R2≥0.99。

1.1.2樣品測(cè)定

(1)稱取牛奶2.5g(精確至0.1mg),于125mL三角瓶中,放入幾粒玻璃球,加10mL硝酸,然后放在電熱板上,在200~300攝氏度下加熱。待劇烈反應(yīng)結(jié)束后取下,稍冷卻,再加入10mL高氯酸,重新放于電熱板上,在200~300攝氏度下加熱。在消化液剩下3mL~5mL時(shí)取下,冷卻,轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中;

(2)向容量瓶中加入50mL水,加入0.10~0.15mL二硝基酚指示劑,用6mol/LNaOH調(diào)至黃色,用0.2mol/LHNO3調(diào)至無(wú)色,用0.1mol/LNaOH調(diào)至微黃色,定容至100mL作為待測(cè)液,每個(gè)樣品設(shè)置兩個(gè)平行試驗(yàn)。同時(shí)做空白試驗(yàn),作為對(duì)照品;

(3)分別吸取100μL待測(cè)液及對(duì)照品置于標(biāo)準(zhǔn)板孔內(nèi),再加入顯色劑200μL,25~30℃下顯色15分鐘,于酶標(biāo)儀上在440nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光值,并計(jì)算磷含量(參與曲線計(jì)算的樣品吸光值是通過(guò)實(shí)際測(cè)得的樣品吸光值減去空白吸光值)。

計(jì)算公式:

P(mg/100g)=(C×V)×100/(M×1000)

式中:

P---樣品中磷含量,mg/100g;

C---從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得的待測(cè)液中磷的濃度,μg/mL;

V---待測(cè)液體積,mL,100;

M---樣品的質(zhì)量,g。

對(duì)比例1

在該對(duì)比例中,按照上述實(shí)施例1中的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,其區(qū)別在于,標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入量為50μL,顯色劑加入量為150μL,具體檢測(cè)值如下:

表2:50μL標(biāo)準(zhǔn)品+150μL顯色劑檢測(cè)數(shù)據(jù)

根據(jù)表2數(shù)據(jù),以凈吸光值為縱坐標(biāo),磷標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)繪制曲線,曲線方程為y=0.004x+0.003(R2=0.969)曲線線性不符合方法要求的R2≥0.99。從而說(shuō)明當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品溶液與顯色劑的加入量為50μL和150μL時(shí),標(biāo)準(zhǔn)曲線不準(zhǔn)確,進(jìn)而將影響待測(cè)液中磷含量的確定,導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性偏低。

對(duì)比例2

在該對(duì)比例中,按照上述實(shí)施例1中的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,其區(qū)別在于,標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入量為200μL,顯色劑加入量為100μL,具體檢測(cè)值如下:

表3:200μL標(biāo)準(zhǔn)品+100μL顯色劑檢測(cè)數(shù)據(jù)

根據(jù)以上數(shù)據(jù),以凈吸光值為縱坐標(biāo),磷標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)繪制曲線,曲線方程為y=0.011x+0.004(R2=0.985)曲線線性不符合方法要求的R2≥0.99。從而說(shuō)明當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品溶液與顯色劑的加入量為200μL和100μL時(shí),標(biāo)準(zhǔn)曲線不準(zhǔn)確,進(jìn)而將影響待測(cè)液中磷含量的確定,導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性偏低。

綜上可知,標(biāo)準(zhǔn)品溶液與顯色劑的加入量顯著影響標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確性,進(jìn)而影響最終檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品溶液與顯色劑的添加量分別為100μL和200μL時(shí),標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確性較高。進(jìn)一步地,待測(cè)液與顯色劑反應(yīng)時(shí),待測(cè)液的加入量同樣為100μL時(shí),能夠準(zhǔn)確地測(cè)定出樣品中磷含量。

實(shí)施例2

分別按照國(guó)標(biāo)GB5413.22-2010測(cè)定磷含量的方法及實(shí)施例1的方法測(cè)定兒童牛奶及調(diào)制乳中磷含量,具體檢測(cè)數(shù)據(jù)如下:

表4:檢測(cè)方法比較結(jié)果

根據(jù)以上數(shù)據(jù),與實(shí)施例1檢測(cè)數(shù)據(jù)與國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)數(shù)據(jù)相對(duì)偏差可以滿足GB5413.22-2010中的方法要求的允許差。從而表明本發(fā)明的方法能夠準(zhǔn)確地測(cè)定磷含量。

在本說(shuō)明書的描述中,參考術(shù)語(yǔ)“一個(gè)實(shí)施例”、“一些實(shí)施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說(shuō)明書中,對(duì)上述術(shù)語(yǔ)的示意性表述不必須針對(duì)的是相同的實(shí)施例或示例。而且,描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。此外,在不相互矛盾的情況下,本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以將本說(shuō)明書中描述的不同實(shí)施例或示例以及不同實(shí)施例或示例的特征進(jìn)行結(jié)合和組合。

盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例,可以理解的是,上述實(shí)施例是示例性的,不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制,本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。

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