液體向液體的生物粒子分級和濃縮的制作方法
【專利說明】液體向液體的生物粒子分級和濃縮
[0001]本專利申請要求2012年10月18日提交的美國臨時專利申請系列號61/715，451的優(yōu)先權(quán)，所述臨時專利申請的內(nèi)容在此整體通過參考并入本公開。
[0002]政府利益
[0003]本公開的主題內(nèi)容在美國國土安全部(Department of Homeland Security)(DHS)授予的資助號為D12PC00287的美國政府支持下做出。美國政府在本公開的主題內(nèi)容中具有一定權(quán)利。
技術(shù)領(lǐng)域
[0004]本公開的主題內(nèi)容總的來說涉及樣品制備領(lǐng)域。更具體來說，本公開的主題內(nèi)容涉及用于分級(fract1nate)和濃縮流體樣品內(nèi)的物質(zhì)的裝置、系統(tǒng)和方法。
【背景技術(shù)】
[0005]檢測和定量空氣和液體中的粒子的困難是眾所周知的。當(dāng)濃度下降時，現(xiàn)有的系統(tǒng)都開始趨向失敗，直至隨著被分析物濃度減小，最終完全不能檢測。這對國家安全造成嚴(yán)重問題，例如2001年的郵件炭疽病襲擊和隨后的反恐戰(zhàn)爭已揭示出在生物威脅物的取樣和檢測方面的不足之處。醫(yī)學(xué)領(lǐng)域同樣受到現(xiàn)有的檢測限的影響，環(huán)境科學(xué)也是如此。
[0006]在生物防御和氣溶膠研宄領(lǐng)域中，通常使用濕式旋風(fēng)分離器或類似的裝置將氣溶膠收集在液體樣品中。將氣溶膠收集在水性樣品中，以便可以使用主要要求樣品被包含在液體中的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來進(jìn)行隨后的生物粒子分析。這些“濕式”收集器具有許多缺點(diǎn)，包括:難以維持設(shè)定的流體體積，與粒子物質(zhì)在裝置中積累相伴的難題，以及對在變化的環(huán)境條件下儲存流體的要求。
[0007]長期以來，干式濾器已被用于收集氣溶膠以及從液體收集粒子。然而，干式濾器主要不能用于鑒定生物粒子，因?yàn)闄z測器通常要求液體樣品，并且將粒子移除到液體中是極為困難的。用于從平板式濾器移除粒子的方法是常見的，但也是繁瑣、低效的，且需要大量液體。
[0008]從液體濃縮粒子傳統(tǒng)上使用離心來進(jìn)行。使用離心力按照混合物中存在的各個組分的密度差來分離混合物。這種力分離混合物，在管的底部形成相對致密的材料球粒。然后可以將被稱為上層清液或上清液的剩余溶液小心地從管中傾倒出來而不擾動所述球粒，或使用巴氏(Pasteur)吸管吸出。離心速率由施加到樣品的加速度指定，并且通常用每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)(RPM)或離心力度量。在離心中的粒子沉降速度是粒子的尺寸和形狀、離心加速度、存在的固體的體積分?jǐn)?shù)、粒子與液體之間的密度差和液體的粘度的函數(shù)。
[0009]與離心技術(shù)相伴的問題限制了它的適用性。微米尺寸范圍內(nèi)的粒子的沉降速度相當(dāng)?shù)?。因此，這些粒子的離心濃縮花費(fèi)數(shù)分鐘至數(shù)小時。實(shí)際時間隨著樣品的體積、所使用的設(shè)備和操作人員的技能而變。
[0010]離心技術(shù)是繁瑣的，因?yàn)樗鼈兺ǔＳ纱罅坎襟E構(gòu)成，每個步驟要求操作人員進(jìn)行高度濃縮。大多數(shù)微生物實(shí)驗(yàn)室每天通過離心處理大量樣品。由于繁瑣性，人為誤差的可能性高，并且這些技術(shù)的自動化是困難且高成本的。離心通常還需要供電設(shè)備。因此，許多情況例如緊急響應(yīng)阻礙了它們的使用。
[0011]已經(jīng)探索了其他的濃縮技術(shù)，它們主要分成三種技術(shù)類別一一基于微流體/電泳、基于過濾和基于捕獲的技術(shù)。然而，這些技術(shù)各自具有阻礙它們在某些情況下使用的缺點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]鑒于常規(guī)技術(shù)的限制，需要的是用于將流體樣品分級和濃縮成數(shù)種組分濃度的單
——盤罟
目.ο
[0013]在這樣做時，本公開的主題內(nèi)容提出了新的、快速、高效的、單程的基于膜濾器的分級和濃縮裝置、系統(tǒng)和方法，其將懸浮在來自于稀進(jìn)料懸液(“進(jìn)料”)的液體中的粒子、特別是生物粒子分級并濃縮成經(jīng)尺寸分級并濃縮的樣品懸液(阻留物)，在獨(dú)立的液流中排除分離的流體(透過物)。本公開的主題內(nèi)容對于直徑為約0.001微米至20微米的尺寸范圍內(nèi)的懸浮生物粒子例如蛋白質(zhì)/毒素、病毒、DNA和細(xì)菌的分級和濃縮來說是特別有用的。這些粒子的濃縮對于檢測稀懸液中的目標(biāo)粒子來說是有利的，因?yàn)閷⑺鼈儩饪s到小體積中使它們更容易檢測。分級以“級聯(lián)”方式進(jìn)行，以便將殘留在分離的流體中的低于每個前一級的截留尺寸的粒子濃縮在濃縮的樣品懸液中。這一過程也可用于產(chǎn)生“帶通”濃縮，用于濃縮狹窄范圍內(nèi)的特定目標(biāo)尺寸的粒子。所述裝置使用進(jìn)料側(cè)上的壓力、透過物側(cè)上的真空和/或機(jī)械剪切來加速分離過程，并且可以包括添加的表面活性劑以提高效率。集成的氣動閥、液壓閥或機(jī)械閥和新的真空啟動程序允許濕濾膜啟動并同時減小裝置中的液體滯留體積。該級聯(lián)濾器堆疊體的獨(dú)特之處在于所述樣品流垂直于包封在外殼中的串聯(lián)的濾器堆疊體的表面，每個濾器之間僅具有小的開放間隙空間，并且所述濾器的洗脫通過平行于阻留物濾器表面或與所述表面相切進(jìn)行的同時的濕泡沫洗脫，通過所述小的間隙空間來進(jìn)行。泡沫洗脫在每個濾器級上同時進(jìn)行，使得在洗脫期間橫跨每個膜的跨膜壓力保持基本為零或接近于零。通過這種方式，洗脫流體通過膜的流動被消除或顯著減小，使得切向流速和洗脫效率被最大化。提取泡沫可以從加壓氣體和溶解在收集流體中的表面活性劑制備得到。
[0014]在一種示例性實(shí)施方式中，本公開的主題內(nèi)容是一種用于從流體樣品分級和濃縮粒子的裝置。所述裝置包括含有分級式濾器(staged filters)的濾筒，所述濾器具有多孔表面且按遞減的孔眼尺寸排列，用于從流體樣品捕獲粒子；以及與所述濾筒流體連通的滲透壓力源；其中將所述粒子從所述多孔表面洗脫并分發(fā)到減小的流體體積中。
[0015]在另一種示例性實(shí)施方式中，本公開的主題內(nèi)容是一種用于從流體樣品分級和濃縮粒子的系統(tǒng)。所述系統(tǒng)包括容納流體樣品的儲存器；包括兩個或更多個分級式濾器的分級和濃縮濾筒；與所述濾筒流體連通的滲透壓力裝置；濃縮單元，其包括驅(qū)動集成閥，以將樣品移動通過所述濾筒；以及流體分發(fā)器源，用于從濾筒分級式濾器收集濃縮的樣品；其中將所述流體樣品移動通過所述濃縮單元，然后將所述濃縮的樣品從所述濾器洗脫并分發(fā)。
[0016]在又一種示例性實(shí)施方式中，本公開的主題內(nèi)容是一種用于從流體樣品快速分級和濃縮粒子的系統(tǒng)。所述系統(tǒng)包括將樣品導(dǎo)入到樣品儲存器中；啟動分級和濃縮循環(huán)；將所述流體樣品通過一系列濾器；從每個濾器級洗脫粒徑逐漸減小的大量粒子；以及從每個濾器級提取濃縮的樣品。
【附圖說明】
[0017]圖1A示出了本公開主題內(nèi)容的示例性實(shí)施方式的五級流體裝置的歧管部分。
[0018]圖1B示出了本公開主題內(nèi)容的示例性實(shí)施方式的五級流體裝置的夾持部分。
[0019]圖1C示出了本公開主題內(nèi)容的示例性實(shí)施方式的五級流體裝置的分解視圖。
[0020]圖2示出了本公開主題內(nèi)容的示例性實(shí)施方式的五級流體裝置的內(nèi)部流體體積視圖。
[0021]圖3示出了本公開主題內(nèi)容的示例性實(shí)施方式的二級流體裝置的內(nèi)部流體體積視圖。
[0022]圖4示出了本公開主題內(nèi)容的示例性實(shí)施方式的三級流體裝置的內(nèi)部流體體積視圖。
[0023]圖5示出了本公開主題內(nèi)容的示例性實(shí)施方式的分級和濃縮的流程圖。
[0024]圖6示出了本公開主題內(nèi)容的示例性實(shí)施方式的雙濾筒系統(tǒng)。
[0025]圖7A示出了本公開主題內(nèi)容的示例性實(shí)施方式的具有集成的濾器支承物的二級濾器堆疊體的橫截面視圖。
[0026]圖7B示出了本公開主題內(nèi)容的示例性實(shí)施方式的不具有濾器支承物的二級濾器堆疊體的橫截面視圖。
[0027]圖8A-8X示出了本公開主題內(nèi)容的示例性實(shí)施方式的用于分級和濃縮的方法的流程圖和詳細(xì)步驟。
【具體實(shí)施方式】
[0028]本公開的主題內(nèi)容總的來說涉及生物恐怖主義安保、醫(yī)學(xué)和環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域?？諝鈹y帶的生物威脅物的快速可靠的檢測是保護(hù)平民和軍人免于流行病大爆發(fā)和生物恐怖主義事件的顯著需求。一流的生物威脅物檢測系統(tǒng)使用氣溶膠收集器將粒子捕獲在2至12mL范圍內(nèi)的液體體積中。然后使用多種樣品制備技術(shù)對樣品進(jìn)行處理，并通過快速微生物學(xué)方法(包括實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)和超高通量測序(UHTS)和/或基于培養(yǎng)的金標(biāo)準(zhǔn)方法)進(jìn)行分析。盡管快速檢測器、收集器和鑒定器的技術(shù)水平在近年來已取得巨大進(jìn)步，但樣品制備技術(shù)的發(fā)展顯著落后，在這些技術(shù)中需要相當(dāng)大的改進(jìn)。
[0029]用于空氣攜帶的生物威脅物的檢測/收集/鑒定系統(tǒng)必須在所有類型的戶內(nèi)和戶外環(huán)境中恰當(dāng)?shù)剡\(yùn)行。城市、工業(yè)和鄉(xiāng)村的戶外環(huán)境和戶內(nèi)環(huán)境包括從非常低到非常高的粒子濃度。在這些變化的環(huán)境中，威脅物的檢測通常依賴于系統(tǒng)在可能是有機(jī)和無機(jī)碎片粒子、無害微生物、花粉、真菌孢子和哺乳動物細(xì)胞的高度變化的復(fù)雜混合物中捕獲和識別稀少的威脅物粒子的能力。
[0030]需要更好的自動樣品制備技術(shù)，以便可以克服目前與復(fù)雜環(huán)境樣品中稀少粒子的檢測相關(guān)的問題。由于粒子和化學(xué)抑制劑的變化的高度復(fù)雜的混合物，由環(huán)境碎片造成的鑒定技術(shù)的抑制是伴隨這些系統(tǒng)的常見問題。UHTS、qPCR和其他快速檢測技術(shù)也可能由于高水平的背景混雜物而失效。由高的背景混雜物水平造成的用于UHTS數(shù)據(jù)分析的生物信息學(xué)系統(tǒng)的故障，是在先進(jìn)測序技術(shù)可以被改造以適應(yīng)于自主生物威脅物檢測應(yīng)用之前必須克服的最大障礙之一。另外還存在的一個顯著要求是，能夠在來自于完整活細(xì)胞的目標(biāo)因子與作為游離DNA或游離蛋白質(zhì)存在的目標(biāo)因子之間做出區(qū)分。不能快速確定目標(biāo)粒子是完整活細(xì)胞還是僅僅作為游離DNA或蛋白質(zhì)特征物(signature)(這是當(dāng)前的生物威脅物檢測系統(tǒng)中的規(guī)范)存在，就不允許組織將可能的實(shí)際恐怖主義事件與潛在災(zāi)難性的與惡作劇或自然事件相關(guān)的假警報(bào)區(qū)分開。
[0031]氣溶膠樣品和其他重要樣品(例如表面、液體、臨床、食物等)通常含有顯著量和廣范圍的非靶碎片，包括有機(jī)和無機(jī)物質(zhì)以及生物材料。如上所述，這些非靶材料可以以常見的抑制副作用顯著影響樣品制備和因子鑒定技術(shù)的性能。對于除去這些抑制劑來說，存在常規(guī)樣品制備技術(shù)，但它們是緩慢的并且在處理體積僅為數(shù)百微升時性能最好一一顯示了收集的樣品量與可以通過可用技術(shù)處理和分析的體積之間的失配。這種失配將真實(shí)的系統(tǒng)檢測限升高到顯著高于所需檢測限的水平，并且在只存在痕量水平的特征物(真實(shí)情況往往如此)時產(chǎn)生假陰性結(jié)果的顯著可能性。
[0032]廣范圍的現(xiàn)有和正在開發(fā)的快速分析平臺是用于檢測和鑒定需求的潛在有用的技術(shù)。檢測和鑒定可以提供關(guān)于完整生物體、核酸或蛋白質(zhì)的線索?；谂囵B(yǎng)的分析、抗生素敏感性試驗(yàn)和功能測定法都要求活生物體樣品。常用的核酸技術(shù)包括qPCR、UHTS和雜交陣列。ELISA和其他免疫測定技術(shù)、質(zhì)譜術(shù)、層析技術(shù)以及其他技術(shù)可用于蛋白質(zhì)分析。在某些情況下偏好地選擇這些技術(shù)之一或者在某些情況下使用超過一種技術(shù)進(jìn)行分析，存在顯著的理由。此外，某些技術(shù)使其自身能夠在自主檢測平臺中使用，而某些技術(shù)只能在實(shí)驗(yàn)室背景中使用。此外，難以確定哪些技術(shù)在不久的將來由于成本下降或開發(fā)出新的改進(jìn)方法而獲得領(lǐng)先。在確定可以使用何種檢測和鑒定系統(tǒng)上的困難，確保了對能夠以濃縮形式為每種潛在的分析類型提供所需樣品級分的即插即用型(plug-and-play type)樣品制備系統(tǒng)的需求。
[0033]需要穩(wěn)健、快速和靈敏的檢測系統(tǒng)，但由于在樣品制備方面的缺陷，目前大多數(shù)系統(tǒng)不能滿足這些需求。樣品制備系統(tǒng)必須能夠自主運(yùn)行一個月或更長時間而不需維護(hù)。通常引起鑒定器出問題的同樣的環(huán)境粒子和抑制劑，也可以引起樣品制備系統(tǒng)故障，尤其是在長時期重復(fù)使用后。用于這些復(fù)雜樣品的樣品制備方法所需的時間占鑒定所需總時間的大部分，并且盡管如此，所述方法也只能處理非常小部分的可用樣品。
[0034]本公開的主題內(nèi)容提出了一種同時將多種組分分級的新技術(shù)。它可用于大量領(lǐng)域中，包括但不限于生物恐怖主義檢測。例如，示例性的具體應(yīng)用領(lǐng)域包括但不限于:
[0035]1.生物恐怖主義威脅因子的氣溶膠取樣
[0036]a.其中所述樣品產(chǎn)生用于分析的液體樣品
[0037]b.其中所述樣品可能含有據(jù)認(rèn)為對人類健康有顯著威脅的目標(biāo)因子
[0038]1.其中潛在威脅性(目標(biāo))因子的名單可以從美國食品和藥品監(jiān)督管理局的疾病控制和預(yù)防中心(CDC)選擇因子A、B或C名單獲取(參見下面的名單I)
[0039]c.其中所述樣品可能含有據(jù)認(rèn)為對人類、動物或植物健康有威脅，造成社會混亂和經(jīng)濟(jì)傷害的目標(biāo)因子
[0040]1.其中潛在威脅性(目標(biāo))因子的名單可以從CDC因子名單(http: "www.bt.cdc.gov/agent/agentiist.asp)2 獲取
[0041]d.其中得到的樣品可能含有對于通過所選方法進(jìn)行檢測來說濃度過低的試驗(yàn)粒子、目標(biāo)因子或替代物
[0042]1.其中將所述樣品濃縮在較小體積中，可以導(dǎo)致通過下列方法之一或組合來檢測目標(biāo)威脅因子:
[0043]1.其中威脅