一種l-fabp快速檢測試劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥試劑領(lǐng)域，具體涉及一種L-FABP (肝型脂肪酸結(jié)合蛋白)快速檢測試劑及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是臨床各科室最常見的急危重癥之一。從輕微血肌酐升高到嚴(yán)重?zé)o尿性AKI，AKI程度和臨床表現(xiàn)不一而足，AKI與患者病死率、慢性腎臟病(CKD)的發(fā)生以及維持性透析率密切相關(guān)。AKI發(fā)病率逐年增高，已由1988年的610例(每百萬人)增加至2009年的2888例(每百萬人)，全國近10年的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，AKI患者占同期住院患者比例為0.28%~3.19%，而在I⑶中更高達(dá)30%?50% ;病死率為14.5%~41.9%ο危重癥患者尤其老年患者的AKI發(fā)生率日益增加，需要接受腎臟替代治療的AKI死亡率高達(dá)50%~80%，全球每年約有200萬人死于AKI。因此，如何防治AKI的發(fā)生、發(fā)展已成為當(dāng)前腎臟病研宄工作中的一個(gè)重點(diǎn)和熱點(diǎn)。
[0003]目前，我國AKI臨床研宄主要聚焦于AKI流行病學(xué)調(diào)查、早期分類和診斷、AKI早期生物標(biāo)記物研宄、特殊類型AKI的診治及AKI連續(xù)性血液凈化治療等。要想更好地對AKI進(jìn)行定義和分期、實(shí)現(xiàn)早期診斷，研發(fā)更好的腎臟損傷標(biāo)志物是一個(gè)重要研宄方向。在早期診斷方面，目前研宄較多的生物標(biāo)志物包括腎損傷分子(KIM)-l、中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL)、IL-18及半胱氨酸蛋白酶抑制劑C (Cystatin C)等。
[0004]肝型脂肪酸結(jié)合蛋白(L-FABP)是脂肪酸結(jié)合蛋白超家族中的重要成員，主要功能是機(jī)體對脂肪酸的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)及細(xì)胞內(nèi)長鏈脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，以及脂肪酸在細(xì)胞器內(nèi)的再分布利用。L-FABP與腎損傷L-FABP在人腎臟近端腎小管細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。各種原因引起急性腎損傷時(shí)，如缺血/再灌注、造影劑相關(guān)急性腎損傷、敗血癥及感染性休克等，腎小管細(xì)胞內(nèi)顯著升高的游離脂肪酸及其氧化產(chǎn)生的活性氧和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物可造成細(xì)胞內(nèi)ATP衰竭和氧化應(yīng)激，加重腎小管間質(zhì)損傷，改變腎小管細(xì)胞膜通透性促使L-FABP快速溢出。在急性腎損傷動物模型和臨床病例研宄中均發(fā)現(xiàn)，腎組織缺血后I h尿L FABP升高，在早期發(fā)現(xiàn)并準(zhǔn)確測定急性腎小管壞死方面比傳統(tǒng)腎功能標(biāo)志物尿素氮更具優(yōu)勢。造影劑相關(guān)急性腎損傷的尿L-FABP比血肌酐更敏感，幫助醫(yī)師發(fā)現(xiàn)和監(jiān)測注射造影劑前已有腎小管損傷的患者。表明，尿L-FABP可成為預(yù)測早期腎損傷的生物標(biāo)志物。
[0005]中國專利(CN102939541A)提出把對尿液液中肝型脂肪酸結(jié)合蛋白(L-FABP)的檢測作為術(shù)后急性腎損傷的預(yù)測和識別；中國專利(CN103946709A)和美國專利(US20140187652A1)提出基于L-FABP診斷急性事件后或外科手術(shù)后的腎損傷。
[0006]目前，檢測L-FABP的方法主要有膠乳免疫比濁法(中國專利CN1103529225)、基于膠體金的免疫層析法(中國專利CN203881772U)和基于熒光的免疫層析法(中國專利CN204044159)。膠乳比濁法反應(yīng)特異性不好，所需試劑比較復(fù)雜。免疫層析方法操作簡便，但其一方面其靈敏性不高；另一方面由于結(jié)合墊上標(biāo)記物釋放不均一、NC膜的差異大、樣品層析速度不可控等原因?qū)е聶z測結(jié)果精密度不高。
[0007]為解決上述問題，如果能利用L-FABP (肝型脂肪酸結(jié)合蛋白)標(biāo)志物的抗體，以微流控技術(shù)為平臺，研發(fā)出一種針對AKI診斷的L-FABP快速檢測試劑。使其與現(xiàn)有檢測試劑相比，具有操作方便、檢測快速、靈敏度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)；將其應(yīng)用于腎損傷的監(jiān)測，可以提高腎損傷診斷的準(zhǔn)確率。則就會受到市場的廣泛歡迎和具有極大的市場價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種L-FABP快速檢測試劑及其制備方法，該方法制備的試劑具有操作方便、檢測快速、靈敏度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，且試劑制作工藝簡便，制作過程對環(huán)境無污染，成本低。
[0009]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:一種L-FABP快速檢測試劑，包括基片和覆蓋在基片上的蓋片，其特征在于，所述基片上依序加工有加樣區(qū)、反應(yīng)區(qū)、檢測區(qū)和廢液區(qū)；所述加樣區(qū)、反應(yīng)區(qū)、檢測區(qū)和廢液區(qū)均由微流通道構(gòu)成；所述加樣區(qū)放置有用于過濾生物樣品的聚酯膜；所述反應(yīng)區(qū)包被有干燥的熒光微球標(biāo)記抗體，該干燥的焚光微球標(biāo)記抗體包括焚光微球標(biāo)記L-FABP多克隆抗體和焚光微球標(biāo)記羊抗鼠IgG(immunoglobulin G，免疫球蛋白G)抗體；所述檢測區(qū)包被有檢測線和控制線，所述檢測線包被有L-FABP多克隆抗體；所述控制線包被有鼠IgG抗體；所述廢液區(qū)為具有毛細(xì)作用的微流通道構(gòu)成。
[0010]一種L-FABP快速檢測試劑的制備方法包括以下步驟:
步驟 SI，制備焚光微球標(biāo)記 L-FABP (liver-type fatty acid binding protein，肝型脂肪酸結(jié)合蛋白)多克隆抗體和熒光微球標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體；
步驟S2，制備出布滿微流通道的基片和蓋片；
步驟S3，在基片上制備出加樣區(qū)、反應(yīng)區(qū)、檢測區(qū)和廢液區(qū)；
步驟S4，L-FABP快速檢測試劑的組裝。
[0011]優(yōu)選的技術(shù)方案，所述步驟SI中制備熒光微球標(biāo)記L-FABP多克隆抗體和熒光微球標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體的過程如下:
一、制備熒光微球標(biāo)記L-FABP多克隆抗體
步驟 S01，取 50mM 且 PH 值為 5.0 的 MEST (2- (N-morpholino) ethanesulfonicacid-tween, 2 - (N-嗎啉)乙磺酸-吐溫)，將L-FABP多克隆抗體稀釋為體積為10ul，濃度為2mg/ml的抗體溶液；
步驟S02，取10ul的0.02g/100ml的熒光微球，加到步驟SOl制得的抗體溶液中，超聲作用I分鐘；
步驟S03，室溫下，攪拌孵育15分鐘；
步驟S04，加入5ul的0.5g/ml的EDC，超聲作用I分鐘；
步驟S05，加入0.4ul的IM的氫氧化鈉，調(diào)節(jié)pH為6.5 土 0.2，室溫下攪拌反應(yīng)3小時(shí)；超聲作用I分鐘，再加入20ul的IM的甘氨酸，反應(yīng)30分鐘；
步驟S06，在20000g的離心力作用下離心10分鐘，棄去上清液并用200ul的PBS(Phosphate Buffered Saline,磷酸鹽緩沖液)重懸，超聲作用I分鐘；
步驟S07，重復(fù)步驟S06兩次后，最后將熒光微球用10ul的1%PBSA (含1%牛血清白蛋白(BSA)的磷酸鹽緩沖液)溶解重懸，即制得熒光微球標(biāo)記L-FABP多克隆抗體； 二、制備熒光微球標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體
步驟S101，取50mM且PH值為5.0的MEST，將羊抗鼠IGG抗體稀釋為體積為lOOul，濃度為2mg/ml的抗體溶液；
步驟S102，取10ul的2%的熒光微球，加到步驟SlOl制得的抗體溶液中，超聲作用I分鐘；
步驟S103，室溫下，攪拌孵育15分鐘；
步驟 S104，加入 5ul 的 0.5g/ml 的 EDC( 1- (3-DimethyIaminopropyI) -3-ethylcarbodiimidea-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺)，超聲作用I分鐘；
步驟S105，加入0.4ul的IM的氫氧化鈉，調(diào)節(jié)pH為6.5 土 0.2，室溫下攪拌反應(yīng)3小時(shí)；超聲作用I分鐘，再加入20ul的IM的甘氨酸，反應(yīng)30分鐘；
步驟S106，在20000g的離心力作用下離心10分鐘，棄去上清液并用200ul的PBS重懸，超聲作用I分鐘；
步驟S107，重復(fù)步驟S106兩次后，最后將熒光微球用10ul的1%PBSA溶解重懸，即制得熒光微球標(biāo)記羊抗鼠IGG抗體。
[0012]進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案，所述步驟S2中制備出布滿微流通道的基片和蓋片如下: 步驟S21，在70攝氏度條件下，恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干COC基片；
步驟S22，使用注塑成型法以帶有凸起微通道結(jié)構(gòu)的金屬材料作為陽模，制備出帶微流通道的COC基片和COC蓋片，且該帶微流通道的COC基片注塑成型有預(yù)設(shè)加樣區(qū)、預(yù)設(shè)反應(yīng)區(qū)、預(yù)設(shè)檢測區(qū)、廢液區(qū)；所述預(yù)設(shè)檢測區(qū)帶有預(yù)設(shè)檢測線位置和預(yù)設(shè)控制線位置。
更進(jìn)一步優(yōu)選方案，步驟S3中反應(yīng)區(qū)的制備過程如下:使用含有1%BSA的0.0lM的PBS, 1000倍稀釋熒光微球標(biāo)記L-FABP多克隆抗體；使用含有1%BSA的0.0lM的PBS，10000倍稀釋熒光微球標(biāo)記羊抗鼠IGG抗體；將稀釋后的熒光微球標(biāo)記L-FABP多克隆抗體和稀釋后的羊抗鼠IGG抗體混合，得到兩種抗體的混合物；使用噴點(diǎn)儀將1ul所述混合物噴點(diǎn)于帶有微流通道COC基片上預(yù)設(shè)反應(yīng)區(qū)的中心，再在37°C攝氏度條件下干燥24小時(shí)，即制得試劑的反應(yīng)區(qū)。
[0013]再更進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案，步驟S3中檢測區(qū)的制備過程如下:使用噴點(diǎn)儀在帶微流通道的COC基片的預(yù)設(shè)檢測區(qū)的預(yù)設(shè)檢測線位置滴加2ul含有1%蔗糖的0.0lM的PBS，且抗體濃度為2mg/ml的L-FABP多克隆抗體；使用噴點(diǎn)儀在帶微流通道的COC基片的預(yù)設(shè)檢測區(qū)的預(yù)設(shè)控制線位置滴加2ul含有1%蔗糖的0.0lM的PBS，且抗體濃度為2mg/ml鼠IgG抗體；然后在37°C干燥3小時(shí)，即制得帶檢測線和控制線的檢測區(qū)。
[0014]步驟S4中L-FABP快速檢測試劑的組裝過程為:在COC基片的加樣區(qū)加入濾血膜，再將COC蓋片覆蓋在COC基片上，使用焊接的方式將COC基片和COC蓋片封合起來，且所述COC基片和COC蓋片上的微流通道形成閉合的通道，即完成試劑的組裝。
[0015]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)的有益效果為:本發(fā)明利用優(yōu)化的針對L-FABP (肝型脂肪酸結(jié)合蛋白)標(biāo)志物的抗體，以微流控技術(shù)為平臺，開發(fā)出針對AKI診斷的L-FABP快速檢測試劑。與現(xiàn)有檢測試劑相比，具有操作方便、檢測快速、靈敏度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用于腎損傷的監(jiān)測，可以提高腎損傷診斷的準(zhǔn)確率。
【具體實(shí)施方式】
[0016]為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚明了，下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】，對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)該理解，這些描述只是示例性的，而并非要限制本發(fā)明的范圍。此夕卜，在以下說明中，省略了對公知結(jié)構(gòu)和技術(shù)的描述，以避免不必要地混淆本發(fā)明的概念。
[0017]實(shí)施例1
一種L-FABP快速檢測試劑的制備方法包括以下步驟