早期腎障礙的評價指標和其測定方法
【專利說明】早期腎障礙的評價指標和其測定方法 【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于確切評價糖尿病所致的腎功能疾?。ㄌ貏e是糖尿病性腎病）的初 期癥狀的評價指標和其測定方法。 【【背景技術】】
[0002] 糖尿病導致由持續(xù)的高血糖所致的血管并發(fā)癥，合并細小血管癥（網(wǎng)膜癥、腎癥、 神經(jīng)障礙）和大血管癥（腦心血管系統(tǒng)疾病）。在其中也是區(qū)分為細小血管癥的糖尿病性 腎病在1998年數(shù)慢性腎小球腎炎是日本的透析療法導入疾病的第1位，在2009年，在全透 析療法導入者數(shù)中占44.5% (1萬6549人），在醫(yī)學一醫(yī)療經(jīng)濟上成為大的問題。再者，透 析療法導入后的5年生存率是約50 %，現(xiàn)在仍然生命預后不良。因此，有早期發(fā)現(xiàn)糖尿病性 腎病的發(fā)癥，早期治療的必要性，但糖尿病性腎病至成為末期缺乏臨床癥狀，不積極進行檢 查時易漏過。從而，從糖尿病發(fā)癥的早期積極進行檢查，持續(xù)發(fā)癥的診斷或病期的評價是不 可或缺的。
[0003] 在糖尿病性腎病的診斷中，由腎活體檢查的組織學診斷是必要的。但是，對全部的 糖尿病患者施行腎活體檢查是困難的，一般而言，除了臨床經(jīng)過或網(wǎng)膜癥等的并發(fā)癥的有 無之外，綜合判斷尿檢查一腎功能檢查所見等而診斷的情況多。因此現(xiàn)在，糖尿病性腎病的 早期診斷由微量白蛋白尿的出現(xiàn)進行。
[0004] 在日本，2005年的日本糖尿病學會和日本腎臟學會的糖尿病性腎病合同委員會 中，"糖尿病腎癥的早期診斷基準"被改訂。根據(jù)此基準，尿中白蛋白測定對象者在通常的試 驗紙法是示尿蛋白陰性或1+程度的陽性的糖尿病患者。尿盡可能測定上午的隨時尿，用免 疫測定法定量尿中白蛋白值（同時也測定尿中肌酸酐值（Cr))、3次測定中2次以上的尿中 白蛋白值是30~299mg/gCr，則作為微量白蛋白尿，診斷為糖尿病性早期腎癥。在僅微量白 蛋白尿中，由于也無法否定糖尿病性腎病以外的諸病態(tài)，尿中IV型膠原值的升高或提示腎 肥大等的糖尿病性腎病變的存在的所見成為診斷的參考。
[0005] 另一方面，初期的慢性腎臟病（CKD :chronic kidney disease)-般而言缺乏自覺 癥狀，自尿異常開始，緩慢地腎功能降低而向末期腎功能衰竭進展。從而，由采尿的尿異常 的發(fā)現(xiàn)成為CKD早期檢測的唯一的手段。在其中也是蛋白尿（包括微量白蛋白尿）與CKD 的進展密切相關，稱為最重要的所見。
[0006] 最近、在糖尿病患者中報告了被稱為"GFRdecliner"（腎小球過濾量：GFR: Glomerular Filtration Rate)或"早期腎功能降低（early renal function decline)" 的進行性的早期腎功能降低。無對其的明確的定義，但在不持續(xù)合并蛋白尿的糖尿病患者 中，盡管腎功能在正常范圍內(nèi)（60mL/min/1.73m 2以上），但進行性腎功能降低，與白蛋白尿 的增減無關系，確認至腎功能衰竭期的病例。在確認不到白蛋白尿的增加的GFRdecliner 的病例中，考慮了治療的開始被延遲，無法充分地阻止向腎功能衰竭期的進行的可能性。 因此，由定期的腎功能的評價，可早期鑒定GFRdecliner，則與白蛋白尿的程度無關系，腎 功能尚在正常時期開始用于腎保護的治療成為可能，期待是否可使其后的腎功能的降低 抑制或改善。由這些，僅用微量白蛋白尿進行糖尿病性腎病的早期診斷有局限，要求作為 GFRdecliner的預測因子的更敏銳的糖尿病性腎病的早期臨床的指標的開發(fā)。
[0007] 但是，對于與白蛋白尿的程度無關系，腎功能尚在正常時期時開始用于腎保護的 治療成為可能的指標或測定方法，尚處于未進行充分的探討的情況。再有，關注到血中的特 定的蛋白質(zhì)，進行著檢查糖尿病性疾病的進行度。例如，報告有通過測定血中的脂聯(lián)素，早 期判斷糖尿病的進展度的方法（非專利文獻1)。
[0008] 【現(xiàn)有技術文獻】
[0009] 【非專利文獻】
[0010] 非專利文獻1 :橋田誠一等，"高靈敏度脂聯(lián)素測定法的開發(fā)和向其運動一營養(yǎng)指 導的應用"德島文理大學研宄紀要第78號7~20頁（2009年） 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0011]【發(fā)明要解決的技術課題】
[0012] 本發(fā)明的目的是提供用于早期檢測腎障礙、進行適宜的生活指導、使腎障礙緩 解一退縮的腎障礙風險的指標和其測定評價方法。
[0013] 【解決課題的技術方案】
[0014] 本發(fā)明人應用利用非專利文獻1的免疫復合物轉(zhuǎn)移測定方法（ICT-EIA法）的高 分子脂聯(lián)素測定方法，作為新的腎變異的指標對尿中高分子脂聯(lián)素的可能性進行了探討 (PCT/JP2012/055736)。其中，本發(fā)明人進行再探討，評價探討具體的患者的數(shù)據(jù)。結果，由 患者的腎小球過濾能力的差異，在血中和尿中的脂聯(lián)素濃度見到差異。即，腎小球過濾能力 變差，則尿中脂聯(lián)素濃度變高，所以相對于血中的脂聯(lián)素濃度求出尿中濾出的脂聯(lián)素比時， 得知在腎小球過濾能力差的患者中，與健康人比較示數(shù)十倍高的值。因此，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)尿 中/血中脂聯(lián)素比可成為與白蛋白尿的傾向不同的新的腎障礙的早期指標。
[0015] 再者，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在健康者的尿中脂聯(lián)素值中單分子脂聯(lián)素所占的比例高，所 以由不測定單分子脂聯(lián)素的脂聯(lián)素測定方法更加明白尿中/血中脂聯(lián)素比的差。即發(fā)現(xiàn)， 通過更特異性地測定HMW脂聯(lián)素，測定評價尿中/血中脂聯(lián)素比，以此尿中/血中脂聯(lián)素比 作為指標，可作為腎障礙的早期指標使用。本發(fā)明人基于以上的見解完成本發(fā)明。
[0016] SP，本發(fā)明的要點如下。
[0017] (1)腎功能的評價指標，其特征在于是用免疫復合物轉(zhuǎn)移測定方法（ICT-EDUi) 測定的尿中的脂聯(lián)素濃度的測定值除以血中的脂聯(lián)素濃度的數(shù)值。
[0018] (2)上述（1)所述的腎功能的評價指標，其中上述脂聯(lián)素濃度是高分子量（HMW)脂 聯(lián)素濃度。
[0019] (3)上述（1)或（2)的腎功能的評價指標，其特征在于是上述（1)或（2)的數(shù)值乘 以IO 4的數(shù)值。
[0020] (4)腎功能疾病的進行度評價方法，其特征在于，使用上述⑴~⑶所述的評價 指標。
[0021] (5)上述（4)所述的腎功能疾病的進行度評價方法，其特征在于，腎功能疾病是糖 尿病性腎病。
[0022] (6)腎功能疾病的預防或治療方法，其特征在于，使用上述⑴~⑶的評價指標， 對于腎功能疾病患者及/或其罹患危險者進行介入療法。
[0023] (7)上述（6)所述的腎功能疾病的預防或治療方法，其特征在于，腎功能疾病是糖 尿病性腎病。
[0024] (8)上述（6)或（7)所述的糖尿病性疾病的預防或治療方法，其中介入療法是就餐 療法、運動療法或藥物療法。
[0025] 【發(fā)明效果】
[0026] 由本發(fā)明的ICT-EIA法取所得到的尿中和血中的脂聯(lián)素濃度的比，通過將其作為 腎功能的評價指標，從而與白蛋白尿的程度無關系，腎功能尚在正常時期時開始用于腎保 護的治療變得可能。結果，通過使用本發(fā)明的腎功能的評價指標的評價方法，作為糖尿病性 疾病的診斷，對于特別是問題多的糖尿病性腎病的早期發(fā)現(xiàn)或糖尿病罹患危險者的腎功能 障礙的判斷或介入療法后的效果判斷也有用。 【【附圖說明】】
[0027] 圖1是表示本發(fā)明中使用的免疫復合物轉(zhuǎn)移酶聯(lián)免疫測定法（ICT-EIA法）的概 略的圖。
[0028] 圖2是關于受試者A~D的腎功能進行CKD階段分類的圖。受試者A和B是健康 人，受試者C和D中預計腎功能的降低。
[0029] 圖3是使用受試者A~D的血清樣品和尿樣品，由Superdex柱依分子量進行分級 分離，探討血中及尿中脂聯(lián)素分子存在樣式的圖。魯：表示血中的脂聯(lián)素濃度（左軸）、?: 表示透析尿中的脂聯(lián)素濃度（右軸）。級分No. 46前后的峰是HMW脂聯(lián)素，級分No. 51前后 的峰是MMW脂聯(lián)素，級分No. 58前后的峰是LMW脂聯(lián)素。另外，低分子區(qū)域的級分No. 78前 后的峰對應于單分子脂聯(lián)素。
[0030] 圖4是測定受試者50名的尿中脂聯(lián)素濃度（ng/mgCr)和腎功能指標的eGFROnL/ min/1. 73m2)，評價其相關關系的有無的圖。顯示尿中的脂聯(lián)素濃度與eGFR成負的相關關 系。
[0031] 圖5是表示，集約圖4中得到的評價數(shù)據(jù)，整理為eGFR的各階段（Gl、G2、G3a)，在 各階段之中的尿中脂聯(lián)素濃度的平均值和偏差的圖。尿中脂聯(lián)素濃度在階段G2相比階段 Gl更顯著地變高。
[0032] 圖6是表示，與圖5同樣地集約圖4中得到的評價數(shù)據(jù)，整理為eGFR的各階段（Gl、 G2、G3a)，在各階段之中的尿中白蛋白濃度的平均和偏差的圖。尿中白蛋白濃度在階段G3a 相比階段G2更顯著地變高。
[0033] 圖7是以上述的eGFR的階段Gl中的尿中脂聯(lián)素濃度和尿中白蛋白濃度的各平均 作為1，算定階段G2和G3a的各受試者的尿中脂聯(lián)素濃度和尿中白蛋白濃度的相對值，將該 數(shù)值在eGFR的每各階段表示的圖。
[0034] 【實施方式】
[0035]【本發(fā)明的第一的實施方式】
[0036] 本發(fā)明的第一的實施方式是涉及腎功能的評價指標的發(fā)明，其特征在于，使用用 免疫復合物轉(zhuǎn)移測定方法（ICT-EIA法）評價的血中和尿中的脂聯(lián)素濃度的數(shù)值，取其比 (尿中的脂聯(lián)素濃度/血中的脂聯(lián)素濃度）。
[0037] 本發(fā)明的"免疫復合物轉(zhuǎn)移酶聯(lián)免疫測定方法（ICT-EIA法）"是關于非競爭 結合法（夾心）酶免疫測定法（EIA)的高靈敏度化的改良方法的方法（參照非專利文 獻1)。如圖1所示，用ICT-EIA法可降低使用的抗體的非特異吸附（背景），所以多種高 分子生理活性物質(zhì)的amol水平以下（zmol)的測定變得可能（參照Hashida S，et al.， Biotechnology Annual Review Vol. I, (1995)pp 403-451, Elsevier Science Publishers B. V. , Amsterdam) 〇
[0038] 本發(fā)明的"脂聯(lián)素"是指自脂肪細胞分泌的脂肪細胞因子之一，是由244個的氨基 酸組成的蛋白質(zhì)，被報告在血中以3聚體（LMW :低分子量）作為基本結構，存在6聚體（MMW : 中分子量）、18聚體（HMW:高分子量）等數(shù)種的多聚體。其血中濃度以高達5~10 μ g/mL 的濃度存在，被報告有抗動脈硬化作用或胰島素抵抗性改善作用等的生理活性。再者近年、 這些的生理作用和多聚體結構的作用被關注，高分子多聚體水平或高分子多聚體/總量比 是，在