高空間分辨激光共焦光譜-質(zhì)譜顯微成像方法與裝置的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于共焦顯微成像技術(shù)、光譜成像技術(shù)和質(zhì)譜成像技術(shù)領(lǐng)域，將激光共焦顯微成像技術(shù)、光譜成像技術(shù)與質(zhì)譜成像技術(shù)相結(jié)合，涉及一種高空間分辨激光共焦光譜一質(zhì)譜顯微成像方法與裝置，可用于生物質(zhì)譜的高分辨成像。
技術(shù)背景
[0002]質(zhì)譜儀(Mass Spectrometry)是將樣品中的組分發(fā)生電離，使生成的不同荷質(zhì)比的帶電原子、分子或分子碎片在電場(chǎng)和磁場(chǎng)的作用下分別聚焦而得到按質(zhì)荷比大小順序排列的圖譜儀器。質(zhì)譜成像是對(duì)樣品二維區(qū)域內(nèi)多個(gè)微小區(qū)域分別進(jìn)行質(zhì)譜分析來檢測(cè)特定質(zhì)荷比(m/z)物質(zhì)的分布。
[0003]自上世紀(jì)80年代中期基質(zhì)輔助激光解吸電離這種高靈敏度和高質(zhì)量檢測(cè)范圍生物質(zhì)譜成像技術(shù)的出現(xiàn)，開拓了質(zhì)譜學(xué)一個(gè)嶄新的領(lǐng)域一生物質(zhì)譜，促使質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用范圍擴(kuò)展到生命科學(xué)研宄的眾多領(lǐng)域，特別是質(zhì)譜在蛋白質(zhì)、核酸、糖蛋白分析等方面的應(yīng)用，不僅為生命科學(xué)研宄提供了新手段，而且也促進(jìn)了質(zhì)譜技術(shù)自身的發(fā)展。
[0004]但現(xiàn)有基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜儀存在以下突出問題:
[0005]I)由于利用簡(jiǎn)單的激光聚焦來解吸電離樣品，因而其仍存在激光聚焦光斑大、質(zhì)譜探測(cè)空間分辨力不高等問題；
[0006]2)無法對(duì)中性原子、分子、中離子及基團(tuán)等進(jìn)行探測(cè)，其結(jié)果制約了樣品質(zhì)譜成分的準(zhǔn)確完整獲?。?br>[0007]3)質(zhì)譜成像所需時(shí)間長(zhǎng)，激光質(zhì)譜儀聚焦光斑軸向位置相對(duì)被測(cè)樣品常發(fā)生漂移冋題。
[0008]而生物樣品“微區(qū)”完整組分信息的準(zhǔn)確獲取對(duì)于生命科學(xué)研宄具有極其重要的意義。事實(shí)上，如何高靈敏地探測(cè)微區(qū)質(zhì)譜信息是目前生物質(zhì)譜領(lǐng)域亟待研宄的重要技術(shù)冋題。
[0009]實(shí)事上，強(qiáng)脈沖激光聚焦到樣品表面會(huì)使樣品離子化，可激發(fā)出帶電的原子、分子、分子碎片和中性的原子、分子、中離子等。如何能夠完整地獲取帶電的原子、分子、分子碎片和中性的原子、分子、中離子的信息，對(duì)于高精度分析樣品的組分具有重要意義。
[0010]利用激光誘導(dǎo)擊穿光譜(LIBS)技術(shù)可測(cè)量等離子體發(fā)射光譜信息，獲得樣品中元素成分。將激光誘導(dǎo)擊穿光譜(LIBS)技術(shù)與質(zhì)譜探測(cè)技術(shù)相結(jié)合，可用來彌補(bǔ)激光質(zhì)譜成像技術(shù)中無法獲得中性原子、分子和中離子信息的不足。
[0011 ] 激光共焦顯微鏡“點(diǎn)照明”和“點(diǎn)探測(cè)”的成像探測(cè)機(jī)制，不僅使其橫向分辨力較同等參數(shù)的光學(xué)顯微鏡改善1.4倍，而且還使共焦顯微鏡極便于與超分辨光瞳濾波技術(shù)、徑向偏振光緊聚焦技術(shù)等結(jié)合來壓縮聚焦光斑，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)高空間分辨顯微成像。
[0012]基于此，本發(fā)明提出一種高空間分辨力的激光共焦光譜-質(zhì)譜顯微成像方法與裝置，其創(chuàng)新在于:首次將具有高空間分辨能力的共焦顯微技術(shù)與激光誘導(dǎo)擊穿光譜(LIBS)技術(shù)和質(zhì)譜探測(cè)技術(shù)相融合，可實(shí)現(xiàn)被測(cè)樣品微區(qū)高空間分辨和高靈敏形態(tài)與組分的成像與探測(cè)。
[0013]本發(fā)明一種高空間分辨激光共焦光譜-質(zhì)譜顯微成像方法與裝置可為生物質(zhì)譜高分辨成像提供一個(gè)全新的有效技術(shù)途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]本發(fā)明的目的是提高質(zhì)譜顯微成像技術(shù)的空間分辨力、抑制成像過程中聚焦光斑相對(duì)樣品的漂移，提出一種高空間分辨激光共焦光譜-質(zhì)譜顯微成像方法與裝置，以期同時(shí)獲得被測(cè)樣品成分空間信息和功能信息。本發(fā)明將激光共焦顯微鏡聚焦光斑的探測(cè)功能與激光聚焦解吸電離功能相融合，利用經(jīng)超分辨技術(shù)處理的共焦顯微鏡的微小聚焦光斑對(duì)樣品進(jìn)行高空間分辨形態(tài)成像，利用質(zhì)譜探測(cè)系統(tǒng)對(duì)共焦顯微系統(tǒng)聚焦光斑解吸電離樣品而產(chǎn)生的帶電分子、原子等進(jìn)行微區(qū)質(zhì)譜成像，利用光譜探測(cè)系統(tǒng)對(duì)共焦顯微系統(tǒng)聚焦光斑解吸電離樣品而產(chǎn)生的等離子體發(fā)射光譜信息進(jìn)行光譜成像，然后再通過探測(cè)數(shù)據(jù)信息的融合與比對(duì)獲得完整的樣品成分信息，繼而實(shí)現(xiàn)被測(cè)樣品微區(qū)高空間分辨和高靈敏形態(tài)與組分的成像與探測(cè)。
[0015]本發(fā)明的目的是通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
[0016]本發(fā)明的一種高空間分辨激光共焦光譜-質(zhì)譜顯微成像方法，其利用高空間分辨共焦顯微系統(tǒng)的聚焦光斑對(duì)樣品進(jìn)行軸向定焦與成像，利用質(zhì)譜探測(cè)系統(tǒng)對(duì)共焦顯微系統(tǒng)聚焦光斑解吸電離樣品而產(chǎn)生的帶電分子、原子等進(jìn)行微區(qū)質(zhì)譜成像，利用光譜探測(cè)系統(tǒng)對(duì)共焦顯微系統(tǒng)聚焦光斑解吸電離樣品而產(chǎn)生的等離子體發(fā)射光譜進(jìn)行探測(cè)，然后再通過探測(cè)數(shù)據(jù)信息的融合與比對(duì)分析繼而實(shí)現(xiàn)被測(cè)樣品微區(qū)高空間分辨和高靈敏形態(tài)與組分的同時(shí)成像與探測(cè)，其包括以下步驟:
[0017]步驟一、使平行光束通過環(huán)形光發(fā)生系統(tǒng)后整形為環(huán)形光束，該環(huán)形光束再沿光輸出方向依次經(jīng)分光鏡、中孔分色器反射進(jìn)入位于光軸折反方向的中孔測(cè)量物鏡并聚焦到被測(cè)樣品上解吸電離產(chǎn)生等離子體羽；
[0018]步驟二、使計(jì)算機(jī)控制由中孔測(cè)量物鏡、與中孔測(cè)量物鏡同軸放置的軸向物鏡掃描器、中孔分色器、分光鏡、位于分光鏡反射光方向集光透鏡和集光透鏡焦點(diǎn)處的光強(qiáng)點(diǎn)探測(cè)器構(gòu)成的激光共焦探測(cè)系統(tǒng)通過軸向物鏡掃描器對(duì)被測(cè)樣品進(jìn)行軸向掃描測(cè)得共焦軸向強(qiáng)度曲線；
[0019]步驟三、將共焦軸向強(qiáng)度曲線沿z向平移s后得到移位共焦軸向強(qiáng)度曲線，然后將移位共焦軸向強(qiáng)度曲線與共焦軸向強(qiáng)度曲線相減處理得到錯(cuò)位相減共焦曲線；
[0020]步驟四、將錯(cuò)位相減共焦曲線的零點(diǎn)位置zA減去平移值s/2得(z a-s/2)，計(jì)算機(jī)依據(jù)(za-s/2)值控制軸向物鏡掃描器使中孔測(cè)量物鏡的聚焦光斑聚焦到被測(cè)樣品上；
[0021]步驟五、利用電離樣品吸管將聚焦光斑解吸電離被測(cè)樣品產(chǎn)生的等離子體羽中的分子、原子和離子吸入質(zhì)譜探測(cè)系統(tǒng)中進(jìn)行質(zhì)譜成像，測(cè)得對(duì)應(yīng)聚焦光斑區(qū)域的質(zhì)譜信息;
[0022]步驟六、利用由中孔測(cè)量物鏡、軸向物鏡掃描器、中孔分色器、分光鏡、位于分光鏡反射光方向的集光透鏡和集光透鏡焦點(diǎn)處的光強(qiáng)點(diǎn)探測(cè)器構(gòu)成的激光共焦探測(cè)系統(tǒng)對(duì)中孔測(cè)量物鏡聚焦到被測(cè)樣品的微區(qū)進(jìn)行成像，測(cè)得對(duì)應(yīng)聚焦光斑區(qū)域的形態(tài)信息；
[0023]步驟七、利用光譜探測(cè)系統(tǒng)對(duì)經(jīng)中孔分色器透射、中孔反射鏡反射和光譜收集透鏡收集的激光誘導(dǎo)擊穿光譜進(jìn)行探測(cè)，測(cè)得對(duì)應(yīng)聚焦光斑區(qū)域的組分信息；
[0024]步驟八、計(jì)算機(jī)將激光共焦探測(cè)系統(tǒng)測(cè)得的激光聚焦微區(qū)的形態(tài)信息、光譜探測(cè)系統(tǒng)同時(shí)探測(cè)的激光聚焦微區(qū)的激光誘導(dǎo)擊穿光譜、質(zhì)譜探測(cè)系統(tǒng)同時(shí)探測(cè)的激光聚焦微區(qū)的質(zhì)譜信息進(jìn)行融合處理，繼而得到聚焦光斑微區(qū)的形態(tài)、光譜和質(zhì)譜信息；
[0025]步驟九、計(jì)算機(jī)控制二維工作臺(tái)使中孔測(cè)量物鏡對(duì)準(zhǔn)被測(cè)樣品的下一個(gè)待測(cè)區(qū)域，然后按步驟二?步驟八進(jìn)行操作，得到下一個(gè)待測(cè)聚焦區(qū)域的形態(tài)、光譜和質(zhì)譜信息；
[0026]步驟十、重復(fù)步驟九直到被測(cè)樣品上的所有待測(cè)點(diǎn)均被測(cè)到，然后利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行處理即可得到被測(cè)樣品形態(tài)、光譜和質(zhì)譜信息。
[0027]本發(fā)明的高空間分辨激光共焦光譜-質(zhì)譜顯微成像方法中，包括步驟一可以為使平行光束通過沿光軸方向放置的矢量光束發(fā)生系統(tǒng)、分光鏡和光瞳濾波器后整形為環(huán)形光束，該環(huán)形光束再經(jīng)中孔分色器反射進(jìn)入中孔測(cè)量物鏡并聚焦到被測(cè)樣品上解吸電離產(chǎn)生等離子體羽。
[0028]本發(fā)明高空間分辨激光共焦光譜-質(zhì)譜顯微成像方法中，包括步驟四可以為計(jì)算機(jī)依據(jù)共焦軸向強(qiáng)度曲線最大值M對(duì)應(yīng)的位置zB值來控制軸向物鏡掃描器使中孔測(cè)量物鏡的聚焦光斑聚焦到被測(cè)樣品上。
[0029]本發(fā)明的高空間分辨激光共焦光譜-質(zhì)譜顯微成像方法中，包括步驟九可為計(jì)算機(jī)控制二維掃描振鏡系統(tǒng)使中孔測(cè)量物鏡對(duì)準(zhǔn)被測(cè)樣品的下一個(gè)待測(cè)區(qū)域，然后按步驟二?步驟八進(jìn)行操作，得到下一個(gè)待測(cè)聚焦區(qū)域的形態(tài)、光譜和質(zhì)譜信息。
[0030]本發(fā)明的一種高空間分辨激光共焦光譜-質(zhì)譜顯微成像裝置，包括激光點(diǎn)光源系統(tǒng)、沿光軸方向放置的準(zhǔn)直透鏡、環(huán)形光發(fā)生系統(tǒng)、分光鏡、中孔分色器和沿折轉(zhuǎn)光軸方向放置的聚焦光斑到被測(cè)樣品的中孔測(cè)量物鏡，包括用于探測(cè)中孔測(cè)量物鏡聚焦光斑反射光強(qiáng)度信號(hào)的集光透鏡和位于集光透鏡焦點(diǎn)的光強(qiáng)點(diǎn)探測(cè)器以及用于探測(cè)中孔測(cè)量物鏡聚焦光斑解析電離的等離子體羽組分的電離樣品吸管和質(zhì)譜探測(cè)系統(tǒng)，還包括探測(cè)激光誘導(dǎo)擊穿光譜的中孔分色器、位于中孔分色器透射光方向的中孔反射鏡、位于中孔反射鏡反射光方向的光譜收集透鏡和光譜收集透鏡焦點(diǎn)處的光譜探測(cè)系統(tǒng)。
[0031]本發(fā)明的一種高空間分辨激光共焦光譜-質(zhì)譜顯微成像裝置中，包括環(huán)形光發(fā)生系統(tǒng)可用沿光軸方向放置的產(chǎn)生矢量光