激光顯微切割系統(tǒng)和用于含有核酸的樣本的檢查方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及根據(jù)獨(dú)立權(quán)利要求的前序部分的激光顯微切割系統(tǒng)、用于這種激光顯微切割系統(tǒng)的電泳單元以及用于含有核酸的樣本的相應(yīng)的檢查方法。
【背景技術(shù)】
[0002]用于通過(guò)所謂的激光顯微切割來(lái)處理生物樣本的方法從1970年代中期就已經(jīng)有了(例如參見(jiàn) Isenberg, G.等人:Cell surgery by laser micro-dissect1n: apreparative method.Journal of Microscopy (顯微學(xué)雜志，采用激光顯顯微切割的細(xì)胞手術(shù):預(yù)備方法)，第107卷，1976年，第19-24頁(yè))，且從那時(shí)起就被持續(xù)地改進(jìn)。
[0003]在激光顯微切割中，可以把細(xì)胞、組織區(qū)域等從樣本(“樣品”、“標(biāo)本”)中隔離出來(lái)，并作為所謂的切片獲得。激光顯微切割的一個(gè)特殊優(yōu)點(diǎn)是，樣本與激光束短暫地接觸，樣本幾乎不因該激光束而改變。在此，可以采用各種不同的方式(例如參見(jiàn)Bancroft, J.D.和 Gamble, M.: Theory and Practice of Histological Techniques.Elsevier Science (Elsevier科學(xué)，組織技術(shù)的理論與實(shí)踐)，2008年，第575頁(yè)，題目“Laser Microdissect1n”(激光顯微切割))來(lái)專門地獲取切片。
[0004]例如可以按照已知的方法，利用紅外或紫外激光束從樣本分離出切片，該切片在重力影響下落入到合適的切片收集容器中。在此，也可以與附著的膜片一起從樣本中切割出切片。而按照所謂的激光捕獲顯微切割，借助相應(yīng)的激光束對(duì)熱塑性膜片加熱。在這種情況下，膜片與樣本的所希望的區(qū)域融合，且可以在后續(xù)步驟中通過(guò)撕開(kāi)而去除。另一替代的方案在于，利用激光束使得切片附著到切片收集容器的頂蓋上。就用于激光顯微切割的公知的倒置顯微鏡系統(tǒng)而言，也可以把向上彈射的切片附著到切片收集容器的、設(shè)有附著涂層的底部上。
[0005]本發(fā)明在此特別是應(yīng)用于如下方法:從樣本中分離出切片，并將切片收集在設(shè)于其下方的切片收集容器中。本發(fā)明尤其適用于無(wú)接觸式的切片收集系統(tǒng)。
[0006]已知的用于激光顯微切割的顯微鏡系統(tǒng)比如由W0 98/14816A1已知，這種系統(tǒng)具有反射光機(jī)構(gòu)，在該反射光機(jī)構(gòu)的光路中耦合激光束。激光束通過(guò)分別使用的顯微鏡物鏡聚焦到樣本上，該樣本放置在可機(jī)動(dòng)地自動(dòng)移動(dòng)的顯微鏡臺(tái)上。切割線的產(chǎn)生方式為，使顯微鏡臺(tái)在切割時(shí)移動(dòng)，以便使樣本相對(duì)于固定不動(dòng)的激光束移動(dòng)。但這尤其具有如下缺點(diǎn):在產(chǎn)生切割線期間，無(wú)法直截了當(dāng)?shù)赜^察樣本，因?yàn)闃颖驹谝曇皟?nèi)移動(dòng)，因而圖像顯得模糊。
[0007]因此，具有激光偏轉(zhuǎn)機(jī)構(gòu)或激光掃描機(jī)構(gòu)的激光顯微切割系統(tǒng)有利地被設(shè)計(jì)用于使得激光束或其照射點(diǎn)偏轉(zhuǎn)到固定不動(dòng)的樣本上面。這種激光顯微切割系統(tǒng)也在本發(fā)明的范圍內(nèi)提供了特殊的優(yōu)點(diǎn)，下面就對(duì)其予以詳述。例如在此前已提到的EP 1 276 586B1中就記載了一種特別有利的激光顯微切割系統(tǒng)，其在激光光路中具有激光掃描機(jī)構(gòu)，該機(jī)構(gòu)帶有可相對(duì)移調(diào)的玻璃楔子。
[0008]在兩種情況下，S卩，無(wú)論在使得顯微鏡臺(tái)在其中移動(dòng)的激光顯微切割系統(tǒng)中，還是在具有激光掃描機(jī)構(gòu)的激光顯微切割系統(tǒng)中，通常都利用脈動(dòng)式激光進(jìn)行工作，其中，利用每個(gè)激光脈沖在樣本中產(chǎn)生孔。使這種孔彼此相鄰，可選地具有適當(dāng)?shù)闹丿B，就產(chǎn)生了切割線。
[0009]激光顯微切割可以用來(lái)得到單細(xì)胞或限定的組織區(qū)域，即含有核酸的樣本的切片。然后可以對(duì)相應(yīng)的切片進(jìn)行不同的分子生物學(xué)的分析處理。
[0010]為了檢查在單細(xì)胞或一定的組織區(qū)域中的DNA損傷(特別是單鏈斷裂或雙鏈斷裂、復(fù)制、刪減、聚合等)，例如已知有單細(xì)胞-凝膠電泳(例如參見(jiàn)Wood，D.K.等人:Singlecell trapping and DNA damage analysis using microwell arrays (米用微波陣列的單細(xì)胞收集和DNA損傷分析)，美國(guó)科學(xué)院院刊，第107卷，2010年，第10008-10013頁(yè))。單細(xì)胞-凝膠電泳(也稱為“彗星分析”)的依據(jù)是，相應(yīng)的DNA損傷、例如DNA中的鏈斷裂，在其幾何形狀特性方面引起差異，進(jìn)而在電泳中的迀移特性或移動(dòng)性方面引起差異。
[0011]在這種情況下通常會(huì)觀察到，受損的DNA片段在通常使用的瓊脂糖凝膠中相比于未受損的DNA片段更易活動(dòng)。這體現(xiàn)在彗星尾巴式的移動(dòng)圖像上。通過(guò)單細(xì)胞-凝膠電泳，可以辨別出多種不同的DNA損傷，其中，例如也可以采用DNA修復(fù)酶或其它試劑，以便能看到本身不可探測(cè)的損傷。對(duì)于概況，可參見(jiàn)Wood等人的前述文章。
[0012]然而，單細(xì)胞-凝膠電泳通常只能少量進(jìn)行，而且可再現(xiàn)性比較差。所用的圖像處理和分析方法繁瑣、耗時(shí)、有出錯(cuò)隱患。雖然Wood等人的文章提出了用于大規(guī)模-單細(xì)胞-凝膠電泳的方法，其中使用了帶有多個(gè)凝膠袋槽的電泳凝膠，其隨后可以進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)-大規(guī)模-單細(xì)胞-篩選技術(shù)，卻無(wú)法采用那里公開(kāi)的方法特別是有針對(duì)性地將一定的細(xì)胞或一定種類的細(xì)胞引入到一定的凝膠袋槽中。在該方法中，全部的凝膠都用細(xì)胞懸浮液涂層，各個(gè)細(xì)胞隨機(jī)地沉降到分別存在的凝膠袋槽中。
[0013]因此，本發(fā)明將改善相應(yīng)的單細(xì)胞-凝膠電泳方法的實(shí)施。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]在這種背景下，本發(fā)明提出具有獨(dú)立權(quán)利要求的特征的激光顯微切割系統(tǒng)、用于這種激光顯微切割系統(tǒng)的電泳單元以及用于含有核酸的樣本的相應(yīng)的檢查方法。優(yōu)選的設(shè)計(jì)分別為從屬權(quán)利要求以及后續(xù)說(shuō)明書的主題。
[0015]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)
[0016]本發(fā)明是基于一種本已公知的激光顯微切割系統(tǒng)。這種激光顯微切割系統(tǒng)包括顯微鏡，該顯微鏡具有反射光機(jī)構(gòu)、顯微鏡物鏡和激光器單元，其中，激光器單元的激光束的光路穿過(guò)反射光機(jī)構(gòu)和顯微鏡物鏡，并在可調(diào)節(jié)的相交點(diǎn)與顯微鏡物鏡的載物面相交。根據(jù)本發(fā)明，激光顯微切割系統(tǒng)的特征在于，在載物面的下面附接著或者通過(guò)耦接件能夠附接帶有電泳凝膠的電泳單元，其中，電泳凝膠具有至少一個(gè)凝膠袋槽，激光顯微切割系統(tǒng)包括定位件，用于使得電泳凝膠平行于載物面且相對(duì)于限定的參考位置定位，從而能把能夠設(shè)置在載物面中的樣本的、通過(guò)激光器單元的激光束得到的切片收集在至少一個(gè)凝膠袋槽中。
[0017]換句話說(shuō)，這種激光顯微切割系統(tǒng)包括:顯微鏡，其帶有反射光機(jī)構(gòu)，用于通過(guò)顯微鏡的顯微鏡物鏡將激光束聚焦到要切割的、特別是含有核酸的樣本上；以及用于借助聚焦的激光束從含有核酸的樣本中分離出切片的器件。
[0018]本發(fā)明在此尤其應(yīng)用在所謂的無(wú)接觸式激光顯微切割系統(tǒng)中。這種系統(tǒng)的特征在于，切片并不附著在膜片等物上，而是基于重力從樣本向下掉落。在此，樣本在直立系統(tǒng)中設(shè)置在載物片的底面上，并利用激光束穿過(guò)載物片從其頂面對(duì)樣本予以處理。
[0019]借助反射光機(jī)構(gòu)將來(lái)自激光光源的激光束耦合到顯微鏡的觀察光路中。激光束利用顯微鏡物鏡聚集到樣本上，該顯微鏡物鏡也用于觀察含有核酸的樣本。
[0020]為了避免誤解，這里需要強(qiáng)調(diào)，在本發(fā)明的范圍內(nèi)使用的激光顯微切割系統(tǒng)使用在顯微術(shù)方面適宜地已經(jīng)預(yù)備好的、含有核酸的樣本。所述樣本例如可以是通過(guò)切片機(jī)從較大的組織塊中切割出來(lái)的薄切片。這種組織塊例如可以是固定的器官或者是相應(yīng)器官的活組織檢查部。本發(fā)明的激光顯微切割系統(tǒng)因而并非用于獲取含有核酸的樣本，而是用于其處理以及從中隔離出一定的區(qū)域。不言而喻，本發(fā)明也可以使用其它含有核酸的、并非通過(guò)切片機(jī)得到的樣本，例如使用涂片、浸軟片等。
[0021]只有在預(yù)備顯微學(xué)的樣本時(shí)才使用切片機(jī)。為此，切片機(jī)也可以具有激光器。通過(guò)切片機(jī)得到的切片如上所述被放置到載物片上，可選地在那里固定、染色等。然后所述切片才能被提供應(yīng)用在本發(fā)明的激光顯微切割系統(tǒng)中。切片機(jī)在其操作方面與激光顯微切割系統(tǒng)的根本區(qū)別尤其在于，那里能得到具有盡可能均勻的切片厚度的切片。因此，切片機(jī)被設(shè)計(jì)用來(lái)產(chǎn)生大量相同的、具有平行切割面的切片，而激光顯微切割系統(tǒng)則被設(shè)計(jì)用于按照與樣本有關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)、例如按照可視標(biāo)準(zhǔn)切割出切片。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員不會(huì)將針對(duì)切片機(jī)采用的技術(shù)方案轉(zhuǎn)用至激光顯微切割系統(tǒng)。
[0022]另外，切片機(jī)不包括如下顯微鏡:在所述顯微鏡的觀察光路中耦合激光束。因此，在切片機(jī)中，激光束也絕不會(huì)通過(guò)也用于觀察的顯微鏡物鏡聚焦到受處理的樣本比如組織塊上。
[0023]此外，在本發(fā)明的范圍內(nèi)有利地使用帶有激光掃描機(jī)構(gòu)的激光顯微切割系統(tǒng)。在帶有激光掃描機(jī)構(gòu)的激光顯微切割系統(tǒng)中，顯微鏡臺(tái)在分離出切片期間即在切割過(guò)程期間相對(duì)于x-y方向(即在垂直于顯微鏡物鏡光軸的方向上)固定不動(dòng)地布置。
[0024]有些激光顯微切割系統(tǒng)的顯微鏡臺(tái)(掃描臺(tái))在切割過(guò)程期間機(jī)動(dòng)地移動(dòng)，這種顯微鏡臺(tái)特別是對(duì)于高倍率物鏡來(lái)說(shuō)必需具有高的位置精確度，以便能夠?qū)崿F(xiàn)精確的切害J，與這種激光顯微切割系統(tǒng)相比，帶有激光掃描機(jī)構(gòu)的激光顯微切割系統(tǒng)已證明更為簡(jiǎn)單，且制造成本低廉，并具有精密優(yōu)勢(shì)。
[0025]在一種特別有利的實(shí)施方式中，激光掃描機(jī)構(gòu)具有兩個(gè)厚的、朝向光軸傾斜的、且可彼此獨(dú)立地圍繞光軸轉(zhuǎn)動(dòng)的、玻璃的楔形板，這些楔形板通過(guò)其楔角引起光束偏轉(zhuǎn)。通過(guò)玻璃楔形板的轉(zhuǎn)動(dòng)，所產(chǎn)生的激光束相對(duì)于光軸的偏轉(zhuǎn)角度可改變。在激光掃描機(jī)構(gòu)的出口，由于玻璃楔形板的厚度和傾斜位置，激光束相對(duì)于光軸具有側(cè)向光束偏移，且對(duì)于所有偏轉(zhuǎn)角度來(lái)說(shuō)都到達(dá)顯微