一種用于檢測(cè)美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體的elisa免疫試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體的ELISA免疫試 劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS)在全球范圍內(nèi)對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該 病于20世紀(jì)八十年代首次幾乎同時(shí)出現(xiàn)在德國(guó)和美國(guó)，此后，PRRS在全球范圍內(nèi)爆發(fā)和 流行。2006年春，在中國(guó)中部暴發(fā)豬高致病性豬繁殖與呼吸綜合征（highly pathogenic PRRS，PHFD)以高達(dá)20%~100%的死亡率引起了社會(huì)廣泛的關(guān)注。
[0003] 豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV)是導(dǎo)致該病主要病原。其屬于動(dòng)脈炎病毒科， 動(dòng)脈炎病毒屬。各種年齡的豬均易感，妊娠母豬感染后可引起流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎及弱胎， 仔豬可發(fā)生呼吸障礙和高病死率，其他豬常呈隱性感染或僅出現(xiàn)輕度的呼吸道癥狀。PRRS 病毒包括歐洲型和美洲型兩種主要抗原型，分別以LV和VR-2332為代表株。由于其對(duì)養(yǎng)豬 業(yè)的嚴(yán)重威脅性，國(guó)際獸疫局（1996)已將本病例為B類傳染病。
[0004] 目前檢測(cè)PRRSV的方法主要有病毒分離鑒定、間接免疫熒光試驗(yàn)和血清中和試驗(yàn) 等診斷方法。以上技術(shù)要么工作量太大，要么要操作活病毒，要么特異性和敏感性不足，要 么診斷時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，影響了疫病控制，要么不能夠方便的進(jìn)行臨床檢測(cè)。因此，開(kāi)發(fā)一種具有 特異性、敏感性良好，適用于臨床檢測(cè)，勞動(dòng)強(qiáng)度不高，檢測(cè)時(shí)間較短，檢測(cè)費(fèi)用較低的抗體 檢測(cè)試劑盒具有良好的應(yīng)用價(jià)值和市場(chǎng)價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的就是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供了一種用于檢測(cè)美洲型豬繁 殖與呼吸綜合征病毒抗體的ELISA免疫試劑盒，通過(guò)純化的該病毒的核蛋白為檢測(cè)抗原， 以標(biāo)準(zhǔn)血清作為對(duì)照，能夠簡(jiǎn)單快速準(zhǔn)確的檢測(cè)待檢豬血清中美洲型豬繁殖與呼吸綜合征 病毒抗體值。
[0006] 本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體的ELISA免疫試 劑盒，包括已包被抗原的酶聯(lián)板，所述包被抗原為美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒的部分 或全部核蛋白基因的重組核蛋白；所述試劑盒還包括兔抗豬的酶標(biāo)二抗，所述酶為辣根過(guò) 氧化物酶。
[0007] 優(yōu)選地，包被抗原時(shí)使用的封閉液為5%脫脂奶粉和5%的馬血清。
[0008] 優(yōu)選地，所述包被抗原的包被濃度為234ng/ml。
[0009] 優(yōu)選地，所述酶標(biāo)二抗的工作濃度為1:20000。
[0010] 優(yōu)選地，所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)血清、顯色液、終止液。
[0011] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供上述試劑盒在檢測(cè)美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒 抗體中的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供應(yīng)用上述試劑盒檢測(cè)美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病 毒抗體的方法，步驟如下：
[0013] (1)取出預(yù)包被抗原的酶標(biāo)板，在不同孔中分別加入陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)血清和陰性標(biāo)準(zhǔn)血 清；然后在其他孔內(nèi)加入稀釋后的待檢豬血清，反應(yīng)，棄反應(yīng)液，洗滌；
[0014] (2)加入1:20000倍稀釋的兔抗豬的酶標(biāo)二抗，反應(yīng)，棄反應(yīng)液，洗滌；
[0015] (3)加入TMB顯色液避光顯色，加入反應(yīng)終止液，在酶標(biāo)儀上讀取OD45tl數(shù)值；
[0016] (4)若陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)血清OD45tl彡0. 45，陰性標(biāo)準(zhǔn)血清OD 45Q〈0. 45，且陽(yáng)性對(duì)照血清 OD45tl/陰性對(duì)照血清OD45tlS 2. 10,則判定為試驗(yàn)成立；若試驗(yàn)成立，依據(jù)待檢豬血清的OD 45Q 數(shù)值進(jìn)行判斷，OD45tlS 0. 45即為陽(yáng)性，反之為陰性。
[0017] 本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明提供的美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒的間接 ELISA檢測(cè)試劑盒可以準(zhǔn)確的測(cè)定美洲型豬繁殖障礙與呼吸綜合征病毒的抗體，其操作簡(jiǎn) 單，所需I. 5h，僅為法國(guó)LISSEU公司的檢測(cè)美洲型PRRSA的ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)方法的 一半，且與其具有良好的一致性，可以用于大量樣品檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說(shuō)明書的一部分，與本發(fā)明的實(shí) 施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中：
[0019] 圖1為原核表達(dá)系統(tǒng)純化產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果，其中M為蛋白marker ;1為 空白，2為純化的豬繁殖與呼吸綜合征病毒的核蛋白基因。
[0020] 圖2為原核表達(dá)系統(tǒng)純化產(chǎn)物的western blot檢測(cè)結(jié)果，1對(duì)照，2為表達(dá)的豬繁 殖與呼吸綜合征病毒的核蛋白基因。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。
[0022] 實(shí)施例1
[0023] 本發(fā)明的豬繁殖與呼吸綜合征病毒的ELISA試劑盒的組成及制備方法為：
[0024] 1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的核蛋白的制備、包被及封閉：
[0025] 美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒的部分或全部核蛋白基因的重組核蛋白接種大 腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)在37°C培養(yǎng)16h，收集培養(yǎng)物利用鎳柱進(jìn)行重組蛋白純化，包被時(shí)用包被 液（包被液為碳酸氫鹽緩沖液，PH9. 6)稀釋成234ng/ml，取50 μ 1/孔的量加到酶聯(lián)板上， 4°C包被過(guò)夜；以PBST洗滌3遍，每孔加入100 μ 1封閉液（5%脫脂奶粉和5%的馬血清）， 37°C放置2h。棄掉洗滌液，PBST洗滌3遍，采用鋁箔袋真空封口，4°C保存。該封閉液能很 好地封閉非特異型反應(yīng)。
[0026] 2、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清的制備：
[0027] 以美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒按照免疫程序接種20kg的豬，采集免疫前和 免疫后2周的血清，分離血清，測(cè)定血清抗體效價(jià)，無(wú)菌分裝備用。OD 45tlS 0. 45為合格。
[0028] 3、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清的制備：
[0029] 選用20kg左右、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒抗體陰性的健康斷奶仔豬4頭，無(wú)菌采 血，分離血清，一 25°C保存。按《中華人民共和國(guó)獸藥典》進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)，豬繁殖與呼吸綜合 癥病毒抗體〇D45(l< 0. 215為合格。
[0030] 4、酶標(biāo)記物：兔抗豬的酶標(biāo)二抗。含有淡紅色指示劑。指示劑是為了在檢測(cè)時(shí)防 止漏加，同時(shí)指示抗體稀釋液的PH值；所述的酶為辣根過(guò)氧化物酶（HRP)。
[0031] 5、標(biāo)準(zhǔn)陰陽(yáng)性血清和待檢血清稀釋度的選擇：
[0032] 棋盤滴定確定標(biāo)準(zhǔn)陰陽(yáng)性血清和待檢血清稀釋度為1:200。
[0033] 6、抗原抗體最適宜濃度的選擇：
[0034] 棋盤滴定確定酶標(biāo)抗體的工作濃度為1:20000,標(biāo)準(zhǔn)陰陽(yáng)性血清和待檢血清稀釋 度為1:200,相應(yīng)抗原的最適包被濃度為234ng/ml。
[0035] 7、TMB顯色液1瓶，購(gòu)自Sigma公司。
[0036] 8、終止液1瓶，為I. 25M的硫酸。
[0037] 9、25XPBST 為 1 瓶。
[0038] 10、樣品稀釋液1瓶，為含2%吐溫-20的PBS，且含有淡綠色指示劑。指示劑是為 了在檢測(cè)時(shí)，防止漏加，同時(shí)指示血清稀釋液的PH值。
[0039] 11、真空包裝鋁箔盒包裝的試劑盒2個(gè)。
[0040] 12、說(shuō)明書一份。
[0041] 試劑盒的組成具體參見(jiàn)表1，按照表1所列的美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒中 和抗體競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)試劑盒內(nèi)容，裝配試劑盒，組成后裝于4°C保存。
[0042] 表1美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒中和抗體競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)試劑盒
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于檢測(cè)美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體的ELISA免疫試劑盒，包括已包 被抗原的酶聯(lián)板，其特征在于：所述包被抗原為美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒的部分或 全部核蛋白基因的重組核蛋白；所述試劑盒還包括兔抗豬的酶標(biāo)二抗，所述酶為辣根過(guò)氧 化物酶。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體的ELISA免疫 試劑盒，其特征在于：包被抗原時(shí)使用的封閉液為5%脫脂奶粉和5%的馬血清。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用于檢測(cè)美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體的ELISA 免疫試劑盒，其特征在于：所述包被抗原的包被濃度為234ng/ml。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用于檢測(cè)美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體的ELISA 免疫試劑盒，其特征在于：所述酶標(biāo)二抗的工作濃度為1:20000。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的用于檢測(cè)美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體的ELISA 免疫試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)血清、顯色液、終止液。
6. 權(quán)利要求1-5所述的試劑盒在檢測(cè)美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體中的應(yīng)用。
7. 應(yīng)用權(quán)利要求1-5所述的試劑盒檢測(cè)美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體的方法， 其特征在于：步驟如下： (1) 取出預(yù)包被抗原的酶標(biāo)板，在不同孔中分別加入陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)血清和陰性標(biāo)準(zhǔn)血清；然 后在其他孔內(nèi)加入稀釋后的待檢豬血清，反應(yīng)，棄反應(yīng)液，洗滌； (2) 加入1:20000倍稀釋的兔抗豬的酶標(biāo)二抗，反應(yīng)，棄反應(yīng)液，洗滌； (3) 加入TMB顯色液避光顯色，加入反應(yīng)終止液，在酶標(biāo)儀上讀取OD45(l數(shù)值； (4) 若陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)血清OD45Q> 0. 45,陰性標(biāo)準(zhǔn)血清OD 45Q〈0. 45,且陽(yáng)性對(duì)照血清OD45(/陰 性對(duì)照血清〇D45(l> 2. 10,則判定為試驗(yàn)成立；若試驗(yàn)成立，依據(jù)待檢豬血清的OD 45(|數(shù)值進(jìn) 行判斷，〇D45(l> 0. 45即為陽(yáng)性，反之為陰性。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體的ELISA免疫試劑盒，包括已包被抗原的酶聯(lián)板，所述包被抗原為美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒的部分或全部核蛋白基因的重組核蛋白；所述試劑盒還包括兔抗豬的酶標(biāo)二抗，所述酶為辣根過(guò)氧化物酶。本發(fā)明提供的美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒的間接ELISA檢測(cè)試劑盒可以準(zhǔn)確的測(cè)定美洲型豬繁殖障礙與呼吸綜合征病毒的抗體，其操作簡(jiǎn)單，所需1.5h，僅為法國(guó)LISSEU公司的檢測(cè)美洲型PRRSA的ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)方法的一半，且與其具有良好的一致性，可以用于大量樣品檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查。
【IPC分類】G01N33-68, G01N33-569
【公開(kāi)號(hào)】CN104678104
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510002979
【發(fā)明人】丁耀忠, 張中旺, 張 杰, 周建華, 張永光
【申請(qǐng)人】中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所
【公開(kāi)日】2015年6月3日
【申請(qǐng)日】2015年1月5日