一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒脂質體稀釋液凍干制品及其制備方法
【專利摘要】一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒脂質體稀釋液凍干制品及其制備方法，屬于獸用生物制品技術領域。每1000mlPBS溶液中含有以下組分：黃芪皂苷Ⅲ 2?8g、蘆薈多糖5?10g、姜黃素2?6g、脂質體10?15g、葡萄糖10?15g和甘露醇10?15g。本發(fā)明所制備的脂質體稀釋液凍干制品可以降低半成品的批間差異。本發(fā)明所制備的脂質體稀釋液凍干制品可以促進豬繁殖與呼吸綜合征病毒的繁殖，提高病毒含量，增強疫苗的免疫原性。
【專利說明】
一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒脂質體稀釋液凍干制品及其制 備方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于獸用生物制品技術領域，具體涉及一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒脂質 體稀釋液凍干制品及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome， PRRS)，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起豬的一種高度接觸性傳染病，不同年 齡、品種和性別的豬均能感染，該病以母豬繁殖障礙、仔豬呼吸道癥狀、免疫抑制、高感染 率、高死亡率為特征的一種高致病性疫病。該病已給全球養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的經濟損失，為了 有效地控制該病，國內外已開發(fā)出多種用于預防PRRS的疫苗。
[0003] 脂質體是一種具有同生物膜性質類似的磷脂雙分子層結構載體，而中藥脂質體系 指將中藥的有效成分包封于類脂質雙分子層而制成的一種超微型球狀藥物載體制劑。該藥 物載體具有靶向、緩釋給藥的優(yōu)勢，而且脂質體對正常細胞和組織無損害和抑制作用，還可 以表現出良好的細胞親和性和組織相容性。脂質體在體內易降解、無毒性和無免疫原性，其 作為一種藥物載體不僅可以提高藥物治療指數，還能夠降低藥物毒性和減少藥物毒副作用 等優(yōu)點。
[0004] 黃芪是一味重要的中藥，具有益衛(wèi)固表、利水清腫、托毒生肌、補中益氣等功效，民 間常用于治療自汗、盜汗、血痹、浮腫、痛疽不潰或潰久不斂、內份帶虛、脾虛泄瀉及一切氣 衰血虛之癥。黃芪皂苷為黃芪的主要活性成分之一，黃芪皂苷不僅可以促進淋巴增殖和抗 體的增加，還能促進體液和細胞免疫應答反應。
[0005] 多糖是中藥活性成分之一，大量研究表明，多糖及糖復合物在生物體內不僅是作 為能量資源和構成材料，更重要的是它存在于一切細胞膜結構中，參與生命現象中細胞的 各種活動。多糖類物質是所有生命有機體的重要組成部分，具有清除自由基、提高抗氧化 酶活性和抑制脂質過氧化的能力 獸用生物制品質量評定最重要的指標之一就是批次間的穩(wěn)定性，然而在實際生產過程 中難以控制半成品的批次間穩(wěn)定性，究其原因主要是在接種活體生物時的比例不確定，也 就是說接種量不穩(wěn)定導致生產出半成品有較大的差異。本發(fā)明宗旨在于解決豬繁殖與呼吸 綜合征病毒增殖過程中批次間差異大以及病毒含量過低的難題。

【發(fā)明內容】

[0006] 針對現有技術存在的問題，本發(fā)明的目的在于設計提供一種豬繁殖與呼吸綜合征 病毒脂質體稀釋液凍干制品及其制備方法的技術方案。
[0007] 所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒脂質體稀釋液凍干制品，其特征在于每 1000 mlPBS溶液中含有以下組分:黃芪皂苷ΙΠ 2-8g、蘆薈多糖5-10g、姜黃素 2-6g、脂質體 10-15g、葡萄糖10-15g和甘露醇10-15g。
[0008] 所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒脂質體稀釋液凍干制品，其特征在于每 1000 mlPBS溶液中含有以下組分:黃芪皂苷ΙΠ 4-6g、蘆薈多糖6-8g、姜黃素3-5g、脂質體12-14g、葡萄糖12-14g和甘露醇12-14g。
[0009] 所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒脂質體稀釋液凍干制品，其特征在于所述的 脂質體通過以下步驟制得:稱取大豆卵磷脂、膽固醇，用氯仿進行溶解，并使其混合均勻，并 通過減壓法去除溶液中氯仿，制備脂質體膜溶液;取pH值為7.0~8.0的枸緣酸和枸緣酸鉀 緩沖溶液，將該緩沖溶液加入到脂質體膜溶液中，脫水后用勻漿機制備成脂質體。
[0010] 所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒脂質體稀釋液凍干制品，其特征在于所述的 PBS溶液通過以下步驟制得:取氯化鈉6-10g、氯化鉀0.05-0.5g、磷酸氫二鈉1-1.2g、磷酸二 氫鉀0.05-0.5g、氯化鈣0.05-0.2g、含6個結晶水的氯化鎂0.05-0.2g;將以上各成分混合 后，溶于1000 ml雙蒸水中，經116°C，高壓滅菌30分鐘即得。
[0011] 所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒脂質體稀釋液凍干制品的制備方法，其特征 在于包括以下步驟:取所述重量的組分充分混合后，加入到1000ml pH 7的I3BS溶液中水 化，再經過0.22um的濾器進行過濾，分裝于凍干瓶中，先在-40°C下預凍4-8h，再放真空凍干 機中干燥，即得到豬繁殖與呼吸綜合征病毒脂質體稀釋液凍干制品。
[0012] 所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒脂質體稀釋液凍干制品的制備方法，其特征 在于所述的PBS溶液通過以下步驟制得:取氯化鈉6-10g、氯化鉀0.05-0.5g、磷酸氫二鈉1-1.2g、磷酸二氫鉀0.05-0.5g、氯化鈣0.05-0.2g、含6個結晶水的氯化鎂0.05-0.2g;將以上 各成分混合后，溶于1000 ml雙蒸水中，經116°C，高壓滅菌30分鐘即得。
[0013] 本發(fā)明中黃芪皂苷m由成都曼思特生物科技有限公司生產銷售，蘆薈多糖由蘭州 沃特萊斯生物科技有限公司生產銷售，姜黃素由百靈威科技有限公司生產銷售。
[0014] 本發(fā)明具有以下有益效果： 1、 本發(fā)明所制備的脂質體稀釋液凍干制品可以降低半成品的批間差異 2、 本發(fā)明所制備的脂質體稀釋液凍干制品可以促進豬繁殖與呼吸綜合征病毒的繁殖， 提高病毒含量，增強疫苗的免疫原性。
【具體實施方式】
[0015] 為了使本發(fā)明更加容易理解，下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解， 這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，下列實施例中未提及的具體實 驗方法，通常按常規(guī)實驗方法進行。
[0016] 實施例1:PBS溶液的制備 取氯化鈉6-10g、氯化鉀0.05-0.5g、磷酸氫二鈉1-1.2g、磷酸二氫鉀0.05-0.5g、氯化鈣 0.05-0.2g、含6個結晶水的氯化鎂0.05-0.2g; 將以上各成分混合后，溶于1000ml雙蒸水中，經116°C，高壓滅菌30分鐘即得。
[0017]實施例2:脂質體的制備 稱取大豆卵磷脂6g、膽固醇2g，用500ml氯仿進行溶解，并使其混合均勻，并通過減壓法 去除溶液中氯仿，制備脂質體膜溶液；取PH值為7.0~8.0的枸緣酸和枸緣酸鉀緩沖溶液 200ml，將該緩沖溶液加入到脂質體膜溶液中，脫水后用勻漿機制備成脂質體。
[0018]實施例3:脂質體的制備 稱取大豆卵磷脂4g、膽固醇4g，用500ml氯仿進行溶解，并使其混合均勻，并通過減壓法 去除溶液中氯仿，制備脂質體膜溶液；取PH值為7.0~8.0的枸緣酸和枸緣酸鉀緩沖溶液 200ml，將該緩沖溶液加入到脂質體膜溶液中，脫水后用勻漿機制備成脂質體。
[0019] 實施例4: 一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒脂質體稀釋液凍干制品的制備 取黃芪皂苷m2g、蘆薈多糖5g、姜黃素2g、脂質體(實施例2制得）10g、葡萄糖10g、甘露 醇 l〇g; 取所述重量的組分充分混合后，加入到1000ml pH 7的PBS溶液(實施例1制得）中水 化，再經過0.22um的濾器進行過濾，分裝于凍干瓶中，先在-40°C下預凍6h，再放真空凍干機 中干燥，即得到豬繁殖與呼吸綜合征病毒脂質體稀釋液凍干制品。
[0020] 實施例5:-種豬繁殖與呼吸綜合征病毒脂質體稀釋液凍干制品的制備 取黃芪皂苷m4g、蘆薈多糖6g、姜黃素3g、脂質體(實施例3制得）12g、葡萄糖13g、甘露 醇 12g; 取所述重量的組分充分混合后，加入到1000ml pH 7的PBS溶液(實施例1制得）中水 化，再經過0.22um的濾器進行過濾，分裝于凍干瓶中，先在-40°C下預凍4h，再放真空凍干機 中干燥，即得到豬繁殖與呼吸綜合征病毒脂質體稀釋液凍干制品。
[0021] 實施例6:-種豬繁殖與呼吸綜合征病毒脂質體稀釋液凍干制品的制備 取黃芪皂苷m8g、蘆薈多糖10g、姜黃素6g、脂質體(實施例3制得)15g、葡萄糖15g、甘露 醇 15g; 取所述重量的組分充分混合后，加入到1000ml pH 7的PBS溶液(實施例1制得）中水 化，再經過0.22um的濾器進行過濾，分裝于凍干瓶中，先在-40°C下預凍8h，再放真空凍干機 中干燥，即得到豬繁殖與呼吸綜合征病毒脂質體稀釋液凍干制品。
[0022]試驗例1本發(fā)明的應用 1材料 1.1豬繁殖與呼吸綜合征病毒脂質體稀釋液凍干制品 按本發(fā)明實施例4-6制得 1.2豬繁殖與呼吸綜合征病毒(CH-Ia株），Marc-145細胞 1.3 25日齡健康斷奶仔豬，ELISA檢測PRRS抗體均為陰性檢測偽狂犬抗體、抗原雙 陰性 2方法 2.1包封率的測定 分別取空白的凍干脂質體和處理過的脂質體凍干粉，在磷酸鹽緩沖液中進行復溶，超 速離心，取上清按一定比例稀釋后，測定其吸光度(參考獸藥典），平均每個樣品測3次，算其 平均值。
[0023] 2.2形態(tài)觀察和粒徑 脂質體稀釋液凍干粉在PBS緩沖液復溶后，在透射電鏡（X20000)下觀察 2.3細胞培養(yǎng)及接毒 按常規(guī)細胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)Marc-145細胞;在細胞傳代后均分4組，每組3瓶，將本發(fā)明實 施例4-6制備的脂質體稀釋液凍干制品置于PH7磷酸鹽緩沖液中進行復溶，分別將 20160701、20160702、20160703 三種不同批次的病毒稀釋成 1000 TCID5〇/ml、1500 TCID50/ ml、2000 TCIDso/mhA組，采用本發(fā)明實施例4制備的脂質體稀釋液對3種不同批次的PRRSV 進行稀釋接種;B組，采用本發(fā)明實施例5制備的脂質體稀釋液對3種不同批次PRRSV進行稀 釋接種;C組，采用本發(fā)明實施例6制備的脂質體稀釋液對3不同批次PRRSV進行稀釋接種;D 組，對照組，采用無血清的細胞培養(yǎng)液對3不同批次PRRSV進行稀釋接種，將以上各組分別置 于37°C、5% C02細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h之后進行收毒。
[0024] 2.4 TCID5O測定 將傳代消化后的細胞稀釋成IO5~IO6個/m L之后，轉入96孔培養(yǎng)板中，按0. 2 m L /孔;將收獲的四組病毒液分別作連續(xù)的10倍稀釋，按0.2 mL /孔接種，置于37°C中吸附 2h后，加入含2%血清的DMEM細胞維持液中，置于37°C，5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細胞病 變并記錄，按Reed-Muench法計算TCID50。
[0025] 2.5免疫原性測定 將收獲2.3提到的培養(yǎng)72h 20160701批次三組病毒液經檢驗合格，分別進行滅活、乳化 后制作成疫苗成品用來測定疫苗的免疫原性。將斷奶仔豬分為4組，每組6頭，第I組采用經 本發(fā)明實施例4制備的脂質體稀釋液處理過的PRRSV滅活乳化后制成的疫苗進行免疫;第Π 組采用經本發(fā)明實施例5制備的脂質體稀釋液處理過的PRRSV滅活乳化后制成的疫苗免疫； 第ΙΠ 組為采用經本發(fā)明實施例6制備的脂質體稀釋液處理過的PRRSV滅活乳化后制成的疫 苗免疫;第IV組，疫苗對照組，未經脂質體處理滅活后制成的疫苗免疫;先后免疫2次，第一 次免疫2ml/頭；間隔20d后，進行第2次免疫，按同等劑量進行免疫。各組均在首免第14 d、 21d、28d、35 d、45d、60d、90d、120d、180d采血并分離血清，用ELISA方法進行測定。
[0026] 3 結果 3.1包封率結果 按照公式:包封率（％ )=系統(tǒng)中包封的藥量(Al)/系統(tǒng)中包封與未包封的總藥量(A2) X 100%，結果見表1。
[0027]表1包封率測定結果
3.2形態(tài)觀察和粒徑測定 脂質體稀釋液凍干制品為多室脂質體，粒度規(guī)則，為圓形，粒徑基本一致，結果見表2。 [0028] 表2形態(tài)觀察和粒徑測定結果
3.4血清抗體檢測結果 表4抗體測定結果
4結論 綜上所述，本發(fā)明豬繁殖與呼吸綜合征病毒脂質體稀釋液凍干制品具有良好的包封 率，且粒度規(guī)則，粒徑基本一致;能夠很好的保證半成品接種量的穩(wěn)定性，降低豬繁殖與呼 吸綜合征病毒滅活疫苗半成品間的批次差異;提高疫苗的血清抗體效價，增強疫苗的免疫 原性。
【主權項】
1. 一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒脂質體稀釋液凍干制品，其特征在于每lOOOrnlPBS溶 液中含有以下組分:黃芪皂苷m 2-8g、蘆薈多糖5-10g、姜黃素2-6g、脂質體10-15g、葡萄糖 10-15g 和甘露醇 10-15g。2. 如權利要求1所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒脂質體稀釋液凍干制品，其特征 在于每lOOOrnlPBS溶液中含有以下組分:黃芪皂苷ΙΠ 4-6g、蘆薈多糖6-8g、姜黃素3-5g、月旨 質體12-14g、葡萄糖12-14g和甘露醇12-14g。3. 如權利要求1或2所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒脂質體稀釋液凍干制品，其特 征在于所述的脂質體通過以下步驟制得:稱取大豆卵磷脂、膽固醇，用氯仿進行溶解，并使 其混合均勻，并通過減壓法去除溶液中氯仿，制備脂質體膜溶液;取pH值為7.0~8.0的枸緣 酸和枸緣酸鉀緩沖溶液，將該緩沖溶液加入到脂質體膜溶液中，脫水后用勻漿機制備成脂 質體。4. 如權利要求1或2所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒脂質體稀釋液凍干制品，其特 征在于所述的PBS溶液通過以下步驟制得:取氯化鈉6-10g、氯化鉀0.05-0.5g、磷酸氫二鈉 1-1.2g、磷酸二氫鉀0.05-0.5g、氯化鈣0.05-0.2g、含6個結晶水的氯化鎂0.05-0.2g;將以 上各成分混合后，溶于l〇〇〇ml雙蒸水中，經116°C，高壓滅菌30分鐘即得。5. 如權利要求1或2所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒脂質體稀釋液凍干制品的制 備方法，其特征在于包括以下步驟:取所述重量的組分充分混合后，加入到l〇〇〇ml pH 7的 PBS溶液中水化，再經過0.22um的濾器進行過濾，分裝于凍干瓶中，先在-40°C下預凍4-8h， 再放真空凍干機中干燥，即得到豬繁殖與呼吸綜合征病毒脂質體稀釋液凍干制品。6. 如權利要求5所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒脂質體稀釋液凍干制品的制備方 法，其特征在于所述的PBS溶液通過以下步驟制得:取氯化鈉6-10g、氯化鉀0.05-0.5g、磷酸 氫二鈉1-1.2g、磷酸二氫鉀0.05-0.5g、氯化鈣0.05-0.2g、含6個結晶水的氯化鎂0. Οδ-Ο.2g; 將以上各成分混合后，溶于 1000ml 雙蒸水中 ，經 116°C，高壓滅菌 30 分鐘即得。
【文檔編號】A61K47/26GK106074404SQ201610678206
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年8月17日 公開號201610678206.9, CN 106074404 A, CN 106074404A, CN 201610678206, CN-A-106074404, CN106074404 A, CN106074404A, CN201610678206, CN201610678206.9
【發(fā)明人】沈建軍, 張秀文, 李陽
【申請人】浙江美保龍生物技術有限公司