石蠟包埋對照物懸液的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種制作、使用方便、對照物形態(tài)完美的石蠟包埋對照物懸液的制備方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]免疫組化、原位雜交等原位切片染色技術(shù)應(yīng)用十分廣泛，在實際工作中應(yīng)該建立有效的陽性陰性對照，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確，對醫(yī)師的準(zhǔn)確診斷和患者能夠獲得恰當(dāng)?shù)闹委熦?fù)責(zé)。我們原有的方法所獲得的對照物主要為完整的單細(xì)胞或由完整細(xì)胞組成的組織微粒，在用于組織切片對照時，因組織切片一般為3-4微米厚，小于完整細(xì)胞的一半以上，因此存在一定不足之處，尤其是針對細(xì)胞膜陽性的免疫組化染色時，使用者認(rèn)為膜陽性不夠滿意。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種制作、使用方便、對照物形態(tài)完美的石蠟包埋對照物懸液的制備方法及應(yīng)用。
[0004]所述的石蠟包埋對照物懸液的制備方法，其特征在于包括如下步驟:
1)石蠟包埋對照物切片脫蠟進(jìn)行免疫組化、原位雜交等，觀察切片中某種細(xì)胞豐富的成分，確定那些抗體陽性、核酸擴(kuò)增或異常的對照物蠟塊，對照切片修去不需要的組織備用；
2)選定步驟I)得到的對照物蠟塊，按常規(guī)免疫組化、原位雜交組織切片厚度進(jìn)行切片，便于用于組織切片免疫組化、原位雜交染色觀察時保持同樣的組織厚度，連續(xù)切完組織，將切下來的對照物切片移入不會被有機(jī)溶劑溶解的容器中備用；
3)向步驟2)的容器中加入能夠溶解石蠟的溶劑，離心洗滌3次，除去不溶于水的溶劑，再加入梯度酒精離心處理，通過震蕩、切割攪拌、超聲波或移液器吸頭破碎對照物切片，100-300 μ m過濾，得到對照物切片碎肩，有水化及不水化兩種處理，梯度酒精按高濃度到低濃度的順序，所述的梯度酒精離心處理時濃度從高到低；
4)不水化處理:將步驟3)得到的對照物切片碎肩加入低濃度酒精保存，依據(jù)點涂器具的不同及實際效果調(diào)整組織碎肩大小及濃度，所述的低濃度酒精為10%-30%的酒精，如進(jìn)行點涂物內(nèi)部組合時可選擇碎肩較小的對照物；
5)水化處理:將步驟3)得到的對照物切片碎肩徹底水化，加入蒸餾水或PBS或TBS緩沖液沖洗，離心沉積，將沉積物用能用于抗原保存的液體按體積比為1:1-3的比例稀釋，也可按實際使用情況調(diào)整濃度保存?zhèn)溆谩?br>[0005]所述的石蠟包埋對照物懸液的制備方法，其特征在于所述的對照物包括組織切片、細(xì)胞系、實體瘤或陽性組織冰凍切片。
[0006]所述的石蠟包埋對照物懸液的制備方法，其特征在于步驟2)中的切片厚度為3-4微米。
[0007]所述的石蠟包埋對照物懸液的制備方法，其特征在于步驟2)中容器為離心管。
[0008]所述的石蠟包埋對照物懸液的制備方法，其特征在于步驟2)中在切片前將對照物蠟塊用利器劃成0.2-3mm的組織片。
[0009]所述的石蠟包埋對照物懸液的制備方法，其特征在于步驟3)中所述的溶劑為純凈二甲苯或石油醚。
[0010]所述的石蠟包埋對照物懸液在對免疫組化等原位組織檢測染色過程中作為對照物的應(yīng)用。
[0011]所述的石蠟包埋對照物懸液的應(yīng)用，其特征在于在對免疫組化等使用時，能采用多種組合對照。
[0012]所述的石蠟包埋對照物懸液的應(yīng)用，其特征在于組合對照包括:切片微粒/單細(xì)胞與非切片組織微粒/單細(xì)胞或培養(yǎng)細(xì)胞組合、點涂物內(nèi)部或外部組合。
[0013]所述的石蠟包埋對照物懸液的應(yīng)用，其特征在于方法如下:在將對照物進(jìn)行免疫組化、原位雜交等對照物切片時將對照物懸液點滴、涂敷與待測樣品旁，待測樣品為組織片或細(xì)胞片時，先觀察對照物，陽性及陰性成分結(jié)果是否正確，陽性部位，膜陽性、漿陽性、核陽性是否正確、陽性強(qiáng)度如何:
I)對照物結(jié)果正確，再觀察待查樣品片結(jié)果，確定結(jié)果的陽性或陰性。
[0014]2)在確定陽性強(qiáng)度時，由于對照物進(jìn)行過與待測組織樣品同樣厚度的切片處理，已知陽性強(qiáng)度的對照物陽性程度變化時，以此調(diào)整待查片陽性強(qiáng)度的結(jié)果；
3)對已知對照物結(jié)果不正確時要尋找原因，是否少加某一步試劑、是否加錯了主要試劑、是否抗體已失效。
[0015]通過采用上述技術(shù)，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下:
1)經(jīng)過本發(fā)明的方法，采用石蠟包埋，能使對照物細(xì)胞及微粒的厚度與待測樣品切片厚度一致，改善了閱片觀察者的感官感覺，用該方法為組織切片等免疫組化等原位玻片檢測方法建立一一對照，特別是陽性強(qiáng)度對照時更有可比性，提高了準(zhǔn)確性；
2)利用該方法制作的對照物可以分明微切片的組織層次與結(jié)構(gòu)，起到組織芯片的作用，利用正常組織、某些良性腫瘤可以看清陽性與陰性細(xì)胞的預(yù)期分布，作為對照物對觀察判斷者來說更為直觀，可以利用細(xì)胞成分、結(jié)果復(fù)雜的組織作為提取對照物的組織來源，如用乳腺的纖維腺瘤制作的微切片懸浮對照物，可以看清CK7、CK8、CK5/6、P63、S-100、⑶10、SMA, ER、PR等陽性細(xì)胞的分布是否正確。
【附圖說明】
[0016]圖1為現(xiàn)有方法制作的對照物示意圖；
圖2為本發(fā)明制作的對照物示意圖；
圖3為待測陽性樣本組織切片的免疫組化細(xì)胞膜陽性情況圖。
【具體實施方式】
[0017]以下結(jié)合說明書附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此:
實施例1:石蠟包埋組織切片對照懸液的制備方法如下，其對照物為組織切片: 1)石蠟包埋組織切片脫蠟進(jìn)行免疫組化、原位雜交等，觀察切片中某種細(xì)胞豐富的成分，最好是腫瘤組織，或有特殊組織結(jié)構(gòu)的組織，如乳腺纖維腺瘤組織，確定特定抗體陽性(蛋白表達(dá))、核酸擴(kuò)增或異常的組織蠟塊；
2)選定這些組織蠟塊，按通常免疫組化、原位雜交組織切片厚度一樣進(jìn)行切片，厚度可以是3-4微米，這樣便于用于組織切片免疫組化、原位雜交染色觀察時保持同樣的組織厚度，連續(xù)切片至足夠量或切完組織，該切片不進(jìn)入熱水中展片，將切下來的蠟片移入離心管中；本發(fā)明中，切片前可以將蠟塊用利器劃成0.2-3mm大小的組織片；
3)向步驟2)的離心管中加入純凈二甲苯，用于溶解石蠟，通過震蕩、攪拌、超聲波或移液器吸頭破碎組織切片，并離心洗滌3次，除去不溶于水的純凈二甲苯，再分別加入100%、95%,80%的酒精進(jìn)行離心處理，得到切片碎肩；該切片碎肩有兩種處理，可以不水化，也可以水化；
4)不水化處理:步驟3)得到的切片碎肩可以不用加入蒸餾水水化，直接加入低濃度酒精中保存，本發(fā)明所用的酒精濃度為10%，使用時，可以依據(jù)點涂器具的不同及實際效果調(diào)整組織碎肩大小及濃度，該實施例中，步驟2)的組織切片可以不經(jīng)脫蠟直接懸浮于低濃度酒精中備用；
5)水化處理:步驟3)得到的切片碎肩徹底水化，入蒸餾水或PBS緩沖液沖洗，離心沉積，最后將沉積物用抗原保存液按1:3稀釋，也可按實際使用情況調(diào)整濃度保存?zhèn)溆谩?