一種石蠟包埋切片組織的透射電鏡樣品制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于實驗樣品處理技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種石蠟包埋切片組織的樣品制備方法，尤其涉及一種石蠟包埋切片組織的透射電鏡樣品制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]石蠟包埋切片技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)研宄領(lǐng)域中的重要手段，尤其是在臨床病理診斷中具有重要作用。通過對石蠟包埋組織進行切片染色，可以觀測到組織中的形態(tài)學(xué)變化，進而協(xié)助疾病的診斷，明確病因。
[0003]一般石蠟包埋組織切片厚度多為2?5 μ m，切片后通過撈片平鋪于載玻片上用于進一步的HE染色或者進行免疫組織化學(xué)染色等，利用不同結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)不同的顏色以便于協(xié)助觀察和判斷組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。
[0004]一些穿刺組織或者是體積微小的石蠟包埋組織，進行組織切片能得到的切片數(shù)量有限，尤其某些特殊的微小結(jié)構(gòu)進行切片后可能僅能在一張或者數(shù)張切片上呈現(xiàn)，當需要進行多項檢測時，往往由于切片數(shù)量不足而難以進行，因此，常常在不影響原有結(jié)果的前提下，對切片進行二次檢測。
[0005]石蠟包埋組織切片上的組織較好地貼合在載玻片上才能順利進行染色，而用于進一步免疫組織化學(xué)染色的切片由于需要進行多步的漂洗及高溫處理等，更需要組織能緊密地貼合在載玻片上以防止在操作過程中組織脫落而導(dǎo)致實驗失敗，因此常常使用表面做過特殊處理(一般為多聚賴氨酸處理)的載玻片進行撈片平鋪使得切片組織更好地貼合而不易脫落，但這一特點也使得當需要截取載玻片上的組織做進一步研宄時，完好地獲得組織的難度大大增加。
[0006]穿刺組織和體積微小的組織，當需要對切片上局部稀少的更為復(fù)雜和精細的組織細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)做進一步研宄，借助透射電子顯微鏡能觀察到特定的組織細胞的微觀結(jié)構(gòu)，正是越來越多相關(guān)研宄者的需求。但是切片較薄及貼合緊密的特點使得當需要對切片上的特定的部位進行透射電鏡檢測時，難以通過簡單的刮取將組織刮下，而強行刮取載玻片上的組織常常會破壞組織的原有結(jié)構(gòu)，難以定位到待檢測結(jié)構(gòu)，甚至使待檢測結(jié)構(gòu)丟失。
[0007]對載玻片上微小的特定組織結(jié)構(gòu)進行頂扣包埋，能充分利用已有的組織做進一步的透射電鏡檢測，尤其對于僅有的稀少組織的超微結(jié)構(gòu)檢測具有重要的意義。石蠟包埋組織透射電鏡制樣的脫蠟、固定、脫水、浸透和包埋等操作涉及到多種有毒性及揮發(fā)性液體如二甲苯、戊二醛、鋨酸、丙酮等，在面積較大的載玻片上進行開放操作不僅會因液體揮發(fā)導(dǎo)致濃度改變進而影響樣品的脫蠟、固定、脫水、浸透和包埋的效果，毒性揮發(fā)性試劑的大量使用還會對環(huán)境和健康造成影響。在對載玻片上的石蠟包埋切片組織進行頂扣包埋時，也存在包埋面過大導(dǎo)致含有待檢測組織結(jié)構(gòu)的包埋塊無法完整地剝離載玻片的問題。因此，我們對常規(guī)透射電鏡制樣技術(shù)進行了改進，以使得石蠟包埋切片組織超微結(jié)構(gòu)得到更好的呈現(xiàn)，解決了載玻片上的石蠟包埋切片組織在透射電鏡制樣過程中固定、包埋和截取時所出現(xiàn)的問題。同時也對解決該技術(shù)在應(yīng)用于其他研宄領(lǐng)域時所出現(xiàn)的類似問題提供一定的參考。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供一種石蠟包埋切片組織的透射電鏡樣品制備方法。
[0009]本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下:
[0010]一種石蠟包埋切片組織的透射電鏡樣品制備方法，按以下步驟操作:
[0011]1.調(diào)控實驗室溫度至22?30°C，濕度彡45% ；
[0012]2.提供帶有石蠟包埋切片組織的載玻片，載玻片正面有待取樣區(qū)域的石蠟包埋切片組織，待取樣區(qū)域內(nèi)包含待檢測的組織，利用倒置顯微鏡對待取樣檢測的組織進行初步定位;
[0013]3.各種純包埋劑的配制(所用化學(xué)試劑均為分析純):
[0014]1)618包埋劑的配制:按重量份數(shù)分別將12份618、8份DDSA、1份DBP、0.5份DMP-30逐樣加入量杯中，充分攪拌60?90min混勻，放置于真空干燥箱中靜置待氣泡排出，parafilm封口膜封閉，真空干燥器中備用，或者放置_20°C冰箱保存，使用前提前拿出解凍至室溫或放置37°C干燥箱解凍備用，其中618為環(huán)氧樹脂，DDSA為2-十二烯基琥珀酸酐，DBP為鄰苯二甲酸二丁酯，DMP-30為2-4-6-三-(二甲胺基甲基)苯酚；618包埋劑以下簡稱第一包埋劑；
[0015]2) SPI — Pon? 812包埋劑的配制:將按重量份數(shù)分別將10份SP1- Ροη812、2.2份DDSA、8份NMA和0.3份DMP - 30逐樣加入量杯中，充分攪拌60?90min混勻，放置于真空干燥箱中靜置待氣泡排出，parafi Im封口膜封閉，真空干燥器中備用，或者放置_20°C冰箱保存，使用前提前拿出解凍至室溫或放置37°C干燥箱解凍備用，其中618為環(huán)氧樹脂，DDSA為2-十二烯基琥珀酸酐，NMA為甲基納迪克酸酐，DMP-30為2_4_6_三-(二甲胺基甲基)苯酚；SPI — Pon? 812包埋劑以下簡稱第二包埋劑；
[0016]3) Spurr (4221)包埋劑的配制:按重量份數(shù)分別將10份ERL 4221、5份DER 736、26份NSA和0.3份DMAE逐樣加入量杯中，充分攪拌60?90min混勻，放置于真空干燥箱中靜置待氣泡排出，parafilm封口膜封閉，真空干燥器中備用，或者放置_20°C冰箱保存，使用前提前拿出解凍至室溫或放置37°C干燥箱解凍備用，其中ERL 4221為環(huán)氧樹脂，DER736為聚乙二醇環(huán)氧樹脂，NSA為壬烯基琥珀酸酐，DMAE為二甲乙醇胺；Spurr(4221)包埋劑以下簡稱第三包埋劑；
[0017]4.EP管隔離圈的制備:將EP管剪除管蓋，截取管口及其下長度為I?2mm的完整一圈管作為隔離圈備用，所述EP管為錐形eppendorf離心管；
[0018]5.頂扣包埋用EP管或預(yù)制包埋塊的制備:
[0019]I)頂扣包埋用EP管的制備:將上步驟制備EP管隔離圈余下的EP管繼續(xù)往下截除小段，直至剩余的管能套入EP管隔離圈，并將EP管底部尖端截除，最后剩余的管作為頂扣包埋用EP管備用，切下的EP管底部尖端備用于最后密閉頂扣包埋用EP管；
[0020]2)預(yù)制包埋塊的制備:將配置好的第一包埋劑、第二包埋劑和第三包埋劑分別滴加入EP管中，將滴滿包埋劑的EP管放入烘箱進行聚合以得到包埋塊，其中滴滿純包埋劑為第一包埋劑的EP管放入烘箱進行聚合時溫度、時間條件為35°C、12h，45°C、12h，60°C、24h ;滴滿純包埋劑為第二包埋劑的EP管放入烘箱進行聚合時溫度、時間條件為37°C、12h，45°C、12h，60°C、24h ;滴滿純包埋劑為第三包埋劑的EP管放入烘箱進行聚合時溫度、時間條件為70°C、8?16h ;聚合完成后取出EP管中的包埋塊備用；
[0021]6.脫蠟和水化:將步驟2的載玻片放置于50mL離心管或50mL玻璃立缸，加入100%的二甲苯，使載玻片上的石蠟包埋組織全部浸沒于二甲苯中，密閉離心管或玻璃立缸后放于烘箱中60 °C進行脫蠟3次，每次5?20min，再依次用體積濃度為100%、95%、90%、80%、70%和50%的乙醇溶液進行水化處理，每種濃度處理I?10s，最后用雙蒸水處理I ?1s ；
[0022]7.放置EP管隔離圈:將步驟6脫蠟和水化后的載玻片，在倒置顯微鏡的幫助下用標記筆于載玻片背面將組織待取樣區(qū)域圈定，根據(jù)圈定的載玻片標記范圍，于載玻片正面圍繞待取樣區(qū)域?qū)⒔M織的周邊擦干，用鑷子夾取步驟4的EP管隔離圈粘合于圈定的待取樣區(qū)域上；
[0023]8.固定和漂洗:于步驟7的載玻片上的EP管隔離圈內(nèi)滴加前固定液，parafilm封口膜封閉后4°C進行前固定10?60min，用PBS緩沖液漂洗3次，每次5?20min，再滴加后固定液，parafilm封口膜封閉后4°C進行后固定10?60min，用PBS緩沖液漂洗3次，每次5?20min，得到固定和漂洗后的樣品；所述前固定液是質(zhì)量濃度為3%的戊二醛、所述后固定液是質(zhì)量濃度為I %的鋨酸、所述PBS緩沖液是0.lmol/L pH7.4的磷酸鈉緩沖液；
[0024]9.脫水和浸透:對上步驟固定和漂洗后的樣品依次用4°C體積濃度為50%、70%、80%、90%的乙醇溶液進行處理，每次5?2011^11，接著用4°0體積比為1:1的90%乙醇溶液和90%的丙酮溶液混合液對樣品進行處理5?20min，然后用4°C體積濃度為90%的丙酮溶液處理5?20min，再用100%丙酮溶液處理3次，每次5?lOmin，再分別用100%丙酮和純包埋劑體積比為2: 1、1: 1、1: 2的混合液對樣品進行梯度浸透，依次于37°C處理樣品30min，吸除丙酮和包埋劑的混合液后，用純包埋