用于促進(jìn)軟骨再生修復(fù)的生物基質(zhì)凝膠材料的制備方法、凝膠性能測(cè)定方法及應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】一種用于促進(jìn)軟骨再生修復(fù)的生物基質(zhì)凝膠材料的制備方法、凝膠性能測(cè)定方法及應(yīng)用,其步驟:在人羊膜?PEI體系的混合液與殼聚糖溶液的混合液中加入GP溶液進(jìn)行調(diào)和處理,得到作為生物基質(zhì)凝膠材料的基體的殼聚糖/人羊膜?PEI/GP體系混合液,通過(guò)殼聚糖溶液和GP溶液形成的凝膠中,保持了人羊膜?PEI體系的混合液中的細(xì)胞的活性,促進(jìn)了軟骨再生修復(fù),不再進(jìn)行人工關(guān)節(jié)置換進(jìn)行治療,因此提高了軟骨損傷進(jìn)一步進(jìn)展形成的重度骨關(guān)節(jié)炎的非手術(shù)治療效果。
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于促進(jìn)軟骨再生修復(fù)的生物基質(zhì)凝膠材料的制備方法、凝 膠性能測(cè)定方法及應(yīng)用
[0001] -、技術(shù)領(lǐng)域 本發(fā)明涉及一種生物基質(zhì)凝膠材料的制備方法,尤其是一種用于促進(jìn)軟骨再生修復(fù)的 生物基質(zhì)凝膠材料的制備方法、凝膠性能測(cè)定方法及應(yīng)用。
[0002] 二、【背景技術(shù)】 由于不存在血管和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò),膝關(guān)節(jié)軟骨幾乎沒(méi)有自身修復(fù)能力,特別是形成了大的 損傷部位時(shí),會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)痛以及關(guān)節(jié)功能的喪失,常進(jìn)展為骨關(guān)節(jié)炎。另外,由于老齡或運(yùn) 動(dòng)導(dǎo)致關(guān)節(jié)的過(guò)度使用,膝關(guān)節(jié)軟骨損傷患者越來(lái)越多,嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量,因此 用于促進(jìn)軟骨再生修復(fù)的生物基質(zhì)材料的制備方法是一種重要的生物方法,在現(xiàn)有的用于 促進(jìn)軟骨再生修復(fù)的生物基質(zhì)材料的制備方法中,骨關(guān)節(jié)炎的治療主要著眼于消除患部的 疼痛或炎癥,通過(guò)在患者部位是給予非類(lèi)固醇性抗炎癥藥實(shí)現(xiàn),對(duì)老年患者腎功能降低,從 安全性的角度考慮,難以連續(xù)口服給予非類(lèi)固醇性抗炎癥藥;也可以將軟骨關(guān)節(jié)液的成分 之一透明質(zhì)酸制成制劑得到的產(chǎn)品通過(guò)給予關(guān)節(jié)腔內(nèi),具有改善關(guān)節(jié)的潤(rùn)滑功能、并且抑 制疼痛的作用,但對(duì)于軟骨損傷進(jìn)一步進(jìn)展形成的重度骨關(guān)節(jié)炎,必須進(jìn)行人工關(guān)節(jié)置換 進(jìn)行治療,現(xiàn)在還沒(méi)有一種用于促進(jìn)軟骨再生修復(fù)的生物基質(zhì)凝膠材料的制備方法、凝膠 性能測(cè)定方法及應(yīng)用。
[0003] 三、
【發(fā)明內(nèi)容】
本發(fā)明的客體是一種用于促進(jìn)軟骨再生修復(fù)的生物基質(zhì)凝膠材料的制備方法, 本發(fā)明的客體是一種用于促進(jìn)軟骨再生修復(fù)的生物基質(zhì)凝膠材料的凝膠性能測(cè)定方 法, 本發(fā)明的客體是一種用于促進(jìn)軟骨再生修復(fù)的生物基質(zhì)凝膠材料的應(yīng)用。
[0004] 為了克服上述技術(shù)缺點(diǎn),本發(fā)明的目的是提供一種用于促進(jìn)軟骨再生修復(fù)的生物 基質(zhì)凝膠材料的制備方法、凝膠性能測(cè)定方法及應(yīng)用,因此提高了軟骨損傷進(jìn)一步進(jìn)展形 成的重度骨關(guān)節(jié)炎的非手術(shù)治療效果。
[0005] 為達(dá)到上述目的,本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:一種用于促進(jìn)軟骨再生修復(fù)的生物 基質(zhì)凝膠材料的制備方法,在人羊膜-PEI體系的混合液與殼聚糖溶液的混合液中加入GP溶 液進(jìn)行調(diào)和處理,得到作為生物基質(zhì)凝膠材料的基體的殼聚糖/人羊膜-PEI/GP體系混合 液。
[0006] 由于設(shè)計(jì)了人羊膜-PEI體系的混合液、殼聚糖溶液和GP溶液,通過(guò)殼聚糖溶液和 GP溶液形成的凝膠中,保持了人羊膜-PEI體系的混合液中的細(xì)胞的活性,促進(jìn)了軟骨再生 修復(fù),不再進(jìn)行人工關(guān)節(jié)置換進(jìn)行治療,因此提高了軟骨損傷進(jìn)一步進(jìn)展形成的重度骨關(guān) 節(jié)炎的非手術(shù)治療效果。
[0007] 本發(fā)明設(shè)計(jì)了,按照對(duì)人羊膜-PEI體系的混合液與殼聚糖溶液的混合液的組合混 合液通過(guò)GP溶液的反應(yīng)得到最終生物基質(zhì)凝膠材料為技術(shù)要點(diǎn)。
[0008] 本發(fā)明設(shè)計(jì)了,其步驟是: 第一步驟、人羊膜-PEI體系的制備: (a) 、全溶脫細(xì)胞人羊膜制備:把人羊膜用PBS進(jìn)行血跡清除處理,再用生理鹽水進(jìn)行反 復(fù)清洗,把人羊膜切成1.8-2.2cm X 2.8-3.2cm,加入0.02% EDTA溶液后通過(guò)振搖方式混 合得到中間混合液體I,通過(guò)離心方式把中間混合液體進(jìn)行分離,棄除上清液后,加入〇. 23-0.27 mol醋酸溶液,在溫度為90 °C的水中緩慢搖動(dòng),直至完全溶解中間混合液體Π ,設(shè)定 參數(shù)為轉(zhuǎn)速3800-4200rpm、時(shí)間28-32min對(duì)中間混合液體Π 進(jìn)行離心處理,提取取上清 液,把提取的上清液經(jīng)過(guò)壓力為65.55-69.55KPa、溫度為110.6-119.6°C和時(shí)間8-12min的 消毒處理裝得到中間混合液體m,把中間混合液體m在-18至-22°c保存; (b) 、人羊膜-PEI體系的制備:將PEI溶液稀釋到濃度0.8-1.2%,用NaOH稀溶液調(diào)節(jié)PEI 溶液的pH值為4-6,加入中間混合液體ΙΠ 使PEI濃度設(shè)置為0.4-0.6%得到人羊膜-PEI體系的 混合液,冷凍干燥。
[0009] 第二步驟、殼聚糖/人羊膜-PEI/GP體系的制備: (a) 、殼聚糖溶液的制備 把脫乙酞度大于90%并且重量為0.18-0.22g的殼聚糖粉溶解到濃度為0.5M的28-32ml 的醋酸溶液中,通過(guò)磁力攪拌的方式至完全溶解,然后用醋酸溶液定容至88-102ml,得到濃 度為2mg/ml的殼聚糖溶液,在室溫進(jìn)行保存,將攪拌均勻的殼聚糖溶液用牛皮紙封口置于 120-122 °C的滅菌鍋中消毒9-11分鐘,待滅菌后的殼聚糖溶液溫度降至室溫后放入3-5 °C冰 箱保存; (b) 、甘油磷酸二鈉即GP溶液的制備 將GP粉末溶解于三蒸水中,獲得質(zhì)量濃度為54-58%的溶液,通過(guò)0.22μπι的濾膜過(guò)濾除 菌后得到GP溶液,在溫度為3-5 °C保存; (c) 、殼聚糖/人羊膜-PEI/GP制備 在超凈臺(tái)中,量取配制好的無(wú)菌殼聚糖溶液與配制好的人羊膜-PEI溶液,把第二步驟 中的(a)步驟得到的殼聚糖溶液與第一步驟中得到的人羊膜-PEI體系的混合液按18-22:1 的比例加入無(wú)菌燒杯中,把燒杯放到冰上進(jìn)行0.9-1.1小時(shí)的超聲處理得到殼聚糖人羊膜 溶液,把燒杯中的殼聚糖人羊膜溶液放到冰上進(jìn)行攪拌并且把把第二步驟中的(b)步驟得 到的GP溶液緩慢逐步滴入到殼聚糖人羊膜溶液中,滴入的過(guò)程中觀察殼聚糖人羊膜溶液是 否存在明顯絮狀物質(zhì)出現(xiàn)并且當(dāng)沒(méi)有明顯絮狀物質(zhì)出現(xiàn)得到的中間混合液體IV,使中間混 合液體IV中的GP的最終濃度為580-620mg/ml并且用飽和磷酸二氫鈉調(diào)節(jié)pH值到6.9-7.2得 到殼聚糖/人羊膜-PEI/GP體系混合液,當(dāng)絮狀物質(zhì)出現(xiàn)就終止GP溶液滴入到殼聚糖人羊膜 溶液的過(guò)程。
[0010] 本發(fā)明設(shè)計(jì)了,其步驟是: 第一步驟、人羊膜-PEI體系的制備: (a)、全溶脫細(xì)胞人羊膜制備:把人羊膜用PBS進(jìn)行血跡清除處理,再用生理鹽水進(jìn)行反 復(fù)清洗,把人羊膜切成2.2cm X 3.2cm,加入0.02% EDTA溶液后通過(guò)振搖方式混合得到中 間混合液體I,通過(guò)離心方式把中間混合液體進(jìn)行分離,棄除上清液后,加入0.24 mol醋酸 溶液,在溫度為90 °C的水中緩慢搖動(dòng),直至完全溶解中間混合液體Π ,設(shè)定參數(shù)為轉(zhuǎn)速 41 OOrpm、時(shí)間3 lmin對(duì)中間混合液體Π 進(jìn)行離心處理,提取取上清液,把提取的上清液經(jīng) 過(guò)壓力為68.0KPa、溫度為111.0°C和時(shí)間9min的消毒處理裝得到中間混合液體ΙΠ ,把中間 混合液體ΙΠ 在-21.5°C保存; (b)、人羊膜-PEI體系的制備:將PEI溶液稀釋到濃度1.1%,用NaOH稀溶液調(diào)節(jié)PEI溶液 的pH值為5.8,加入中間混合液體ΙΠ 使PEI濃度設(shè)置為0.48%得到人羊膜-PEI體系的混合液, 冷凍干燥。
[0011] 第二步驟、殼聚糖/人羊膜-PEI/GP體系的制備: (a) 、殼聚糖溶液的制備 把脫乙酞度95%并且重量為0.19g的殼聚糖粉溶解到濃度為0.5M的28ml的醋酸溶液 中,通過(guò)磁力攪拌的方式至完全溶解,然后用醋酸溶液定容至99ml,得到濃度為2mg/ml的殼 聚糖溶液,在室溫進(jìn)行保存,將攪拌均勻的殼聚糖溶液用牛皮紙封口置于120°C的滅菌鍋中 消毒9分鐘,待滅菌后的殼聚糖溶液溫度降至室溫后放入4.5°C冰箱保存; (b) 、甘油磷酸二鈉即GP溶液的制備 將GP粉末溶解于三蒸水中,獲得質(zhì)量濃度為55%的溶液,通過(guò)0.22μπι的濾膜過(guò)濾除菌后 得到GP溶液,在溫度為4.5 °C保存; (c) 、殼聚糖/人羊膜-PEI/GP制備 在超凈臺(tái)中,量取配制好的無(wú)菌殼聚糖溶液與配制好的人羊膜-PEI溶液,把第二步驟 中的(a)步驟得到的殼聚糖溶液與第一步驟中得到的人羊膜-PEI體系的混合液按21.4:1的 比例加入無(wú)菌燒杯中,把燒杯放到冰上進(jìn)行0.9小時(shí)的超聲處理得到殼聚糖人羊膜溶液,把 燒杯中的殼聚糖人羊膜溶液放到冰上進(jìn)行攪拌并且把把第二步驟中的(b)步驟得到的GP溶 液緩慢逐步滴入到殼聚糖人羊膜溶液中,滴入的過(guò)程中觀察殼聚糖人羊膜溶液是否存在明 顯絮狀物質(zhì)出現(xiàn)并且當(dāng)沒(méi)有明顯絮狀物質(zhì)出現(xiàn)得到的中間混合液體IV,使中間混合液體IV 中的GP的最終濃度為589mg/ml并且用飽和磷酸二氫鈉調(diào)節(jié)pH值到7.0得到殼聚糖/人羊膜-PEI/GP體系混合液,當(dāng)絮狀物質(zhì)出現(xiàn)就終止GP溶液滴入到殼聚糖人羊膜溶液的過(guò)程。
[0012] 本發(fā)明設(shè)計(jì)了,一種用于促進(jìn)軟骨再生修復(fù)的生物基質(zhì)凝膠材料的凝膠性能的測(cè) 定方法,其步驟是: 取1.82.2ml殼聚糖/人羊膜-PEI/GP體系混合液放于安培瓶中,置于35-39°C水浴,每隔 0.8-1.2分鐘倒置觀察流動(dòng)性,取倒置28-32秒殼聚糖/人羊膜-PEI/GP體系混合液不流動(dòng)的 時(shí)間記為凝膠時(shí)間。
[0013] 本發(fā)明設(shè)計(jì)了,一種用于促進(jìn)軟骨再生修復(fù)的生物基質(zhì)凝膠材料的應(yīng)用,把殼聚 糖/人羊膜-PEI/GP體系混合液混合臍血間充質(zhì)干細(xì)胞后注入關(guān)節(jié)腔的軟骨缺損部位,通過(guò) 烤燈加溫,將種子細(xì)胞固定于缺損處發(fā)揮再生修復(fù)作用,使溶膠一細(xì)胞復(fù)合物發(fā)生相變得 到生物基質(zhì)凝膠材料。
[0014] 本技術(shù)方案中,GP溶液是指甘油磷酸二鈉溶液。
[0015] 本發(fā)明的技術(shù)效果在于: 與其他形式的支架相比,安全有效,該支架中含有大量天然的I型膠原蛋白和黏連蛋 白,非常適合軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)以及間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化。另外,支架改性后為 細(xì)胞提供了良好的細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互溝通。從而,能最大程度的促進(jìn)間充質(zhì)干 細(xì)胞向軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)分化,進(jìn)而有利于軟骨損傷修復(fù)。該發(fā)明使用的支架材料為天然細(xì)胞 外基質(zhì)成分,在體內(nèi)降解產(chǎn)物完全無(wú)毒無(wú)害,體內(nèi)使用安全無(wú)副作用,能夠與宿主周?chē)能?骨組織有較好的生物相容性。價(jià)格低廉。與現(xiàn)有技術(shù)相比,該發(fā)明大大降低了軟骨損傷修復(fù) 所需的費(fèi)用?,F(xiàn)有技術(shù)多使用生長(zhǎng)因子來(lái)誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞方向分化,促進(jìn)軟 骨損傷修復(fù)。生長(zhǎng)因子用量較大,價(jià)格非常昂貴。而本發(fā)明使用的生長(zhǎng)因子使用濃度低,價(jià) 格相比有非常大的優(yōu)勢(shì);另外使用的凝膠支架取材簡(jiǎn)單,制作工藝也比現(xiàn)有支架制作技術(shù) 簡(jiǎn)單。因而,可以極大降低軟骨損傷修復(fù)的花費(fèi)。使用簡(jiǎn)單、可靠?,F(xiàn)有的支架體內(nèi)應(yīng)用方 法,需要使用開(kāi)放手術(shù)技術(shù),將支架材料植入體內(nèi),創(chuàng)傷較大且費(fèi)用較高。該發(fā)明使用的ECM 改性材料和透明質(zhì)酸鈉混合凝膠可以注射進(jìn)體內(nèi)軟骨缺損處,然后在紫外點(diǎn)光源的照射下 原位成膠,操作簡(jiǎn)單、方便,創(chuàng)傷小且花費(fèi)低廉,非常適合臨床軟骨損傷修復(fù)的應(yīng)用,大大提 高了臨床可推廣性。殼聚糖生物性能優(yōu)越,具有天然的抗菌性,可生物降解性,良好的組織 相容性,而且在結(jié)構(gòu)上與糖胺聚糖和關(guān)節(jié)軟骨中的透明質(zhì)酸具有相似的結(jié)構(gòu),所以被廣泛 應(yīng)用到軟骨缺損修復(fù)。但是,單獨(dú)的使用殼聚糖成骨作用有限且力學(xué)性能較差。羊膜基質(zhì)中 含有大量的膠原、纖粘連蛋白和層粘連蛋白等成份,是一種廉價(jià)易得、力學(xué)性能優(yōu)良的組織 工程材料。其中I型膠原纖維和黏連蛋白表面有特殊的細(xì)胞識(shí)別信號(hào)(特定氨基酸序列), 可促進(jìn)細(xì)胞分化,構(gòu)成的基質(zhì)有利于保持軟骨細(xì)胞的形態(tài),誘導(dǎo)下骨細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化 增殖。本發(fā)明將天然的生物性能好的材料羊膜基質(zhì)與殼聚糖進(jìn)行有效的物理交聯(lián),最大限 度的保持各自的自然屬性,發(fā)揮各自材料的優(yōu)點(diǎn),彌補(bǔ)對(duì)方的缺點(diǎn),構(gòu)建一種能發(fā)揮多種功 效的智能的復(fù)合型可注射水凝膠支架材料。該發(fā)明材料操作簡(jiǎn)單、方便、力學(xué)強(qiáng)度大、凝膠 時(shí)間短,創(chuàng)傷小且花費(fèi)低廉,非常適合臨床軟骨損傷修復(fù)的應(yīng)用,大大提高了臨床可推廣 性。在軟骨損傷部位的實(shí)際再生醫(yī)療臨床中,從細(xì)胞與機(jī)體的親和性、容易采用的程度、治 療效果等角度考慮并不適合實(shí)際應(yīng)用。骨關(guān)節(jié)炎是容易產(chǎn)生病態(tài)惡化的一種疾病。因此,對(duì) 于骨關(guān)節(jié)炎的治療藥物,需求兼具在磨損中保護(hù)軟骨的效果、抑制磨損或炎癥導(dǎo)致的軟骨 退行性改變的效果、修復(fù)軟骨損傷部位的效果、抑制炎癥或疼痛的效果等復(fù)合性的效果。通 過(guò)將含有I型膠原纖維和黏連蛋白的羊膜基質(zhì)進(jìn)行陽(yáng)離子聚合物改性,使改性后的羊膜基 質(zhì)溶于殼聚糖凝膠系統(tǒng)形成新的可注射型生物基質(zhì)材料。該材料容易結(jié)合軟骨修復(fù)所需的 其他材料如干細(xì)胞、細(xì)胞誘導(dǎo)因子、透明質(zhì)酸等,共同組成具流動(dòng)性的組合物應(yīng)用于軟骨損 傷部位,無(wú)需過(guò)度的外科方法,通過(guò)簡(jiǎn)便的方法即可促進(jìn)軟骨再生。本發(fā)明的組合物在包埋 有胎盤(pán)源間充質(zhì)干細(xì)胞時(shí),獲得了明顯優(yōu)異的軟骨再生。還發(fā)現(xiàn),在不包埋這些細(xì)胞時(shí),本 發(fā)明的組合物也獲得良好的透明軟骨再生。另外,將含有的組合物應(yīng)用于骨關(guān)節(jié)炎模型的 軟骨損傷部位,發(fā)現(xiàn)可抑制軟骨退行性改變、獲得保護(hù)軟骨的效果。
[0016] 在本技術(shù)方案中,人羊膜-PEI體系的混合液、殼聚糖溶液和GP溶液為重要技術(shù)特 征,在用于促進(jìn)軟骨再生修復(fù)的生物基質(zhì)凝膠材料的制備方法、凝膠性能測(cè)定方法及應(yīng)用 的技術(shù)領(lǐng)域中,具有新穎性、創(chuàng)造性和實(shí)用性,在本技術(shù)方案中的術(shù)語(yǔ)都是可以用本技術(shù)領(lǐng) 域中的專(zhuān)利文獻(xiàn)進(jìn)行解釋和理解。
[0017] 四、【具體實(shí)施方式】 根據(jù)審查指南,對(duì)本發(fā)明所使用的諸如"具有"、"包含"以及"包括"術(shù)語(yǔ)應(yīng)當(dāng)理解為不 配出一個(gè)或多個(gè)其它元件或其組合的存在或添加。
[0018] 在本發(fā)明的描述中,需要說(shuō)明的是,術(shù)語(yǔ)"中心"、"上"、"下"、"左"、"右"、"豎直"、 "水平"、"內(nèi)"、"外"等指示的方位或位置關(guān)系為方位或位置關(guān)系,僅是為了便于描述本發(fā)明 和簡(jiǎn)化描述,而不是指示或暗示所指的裝置或元件必須具有特定的方位、以特定的方位構(gòu) 造和操作,因此不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。此外,術(shù)語(yǔ)"第一"、"第二"、"第三"僅用于描述 目的,而不能理解為指示或暗示相對(duì)重要性。
[0019] 在本發(fā)明的描述中,需要說(shuō)明的是,除非另有明確的規(guī)定和限定,術(shù)語(yǔ)"安裝"、"相 連"、"連接"應(yīng)做廣義理解,例如,可以是固定連接,也可以是可拆卸連接,或一體地連接;可 以是機(jī)械連接,也可以是電連接;可以是直接相連,也可以通過(guò)中間媒介間接相連,可以是 兩個(gè)元件內(nèi)部的連通。對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言,可以具體情況理解上述術(shù)語(yǔ)在本 發(fā)明中的具體含義。
[0020] 此外,下面所描述的本發(fā)明不同實(shí)施方式中所涉及的技術(shù)特征只要彼此之間未構(gòu) 成沖突就可以相互結(jié)合。
[0021] 下面結(jié)合實(shí)施例,對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步描述,以下實(shí)施例旨在說(shuō)明本發(fā)明而不是對(duì)本 發(fā)明的進(jìn)一步限定。
[0022] -種用于促進(jìn)軟骨再生修復(fù)的生物基質(zhì)凝膠材料的制備方法, 第一個(gè)實(shí)施例,其步驟是: 第一步驟、人羊膜-PEI體系的制備: (a) 、全溶脫細(xì)胞人羊膜制備:把人羊膜用PBS進(jìn)行血跡清除處理,再用生理鹽水進(jìn)行反 復(fù)清洗,把人羊膜切成1.8cm X 2.8cm,加入0.02% EDTA溶液后通過(guò)振搖方式混合得到中 間混合液體I,通過(guò)離心方式把中間混合液體進(jìn)行分離,棄除上清液后,加入0.23 mol醋酸 溶液,在溫度為90 °C的水中緩慢搖動(dòng),直至完全溶解中間混合液體Π ,設(shè)定參數(shù)為轉(zhuǎn)速 3800rpm、時(shí)間28min對(duì)中間混合液體Π 進(jìn)行離心處理,提取取上清液,把提取的上清液經(jīng) 過(guò)壓力為65.55KPa、溫度為110.6Γ和時(shí)間8min的消毒處理裝得到中間混合液體ΙΠ ,把中間 混合液體ΙΠ 在-18°C保存; (b) 、人羊膜-PEI體系的制備:將PEI溶液稀釋到濃度0.8%,用NaOH稀溶液調(diào)節(jié)PEI溶液 的pH值為4,加入中間混合液體ΙΠ 使PEI濃度設(shè)置為0.4%得到人羊膜-PEI體系的混合液,冷 凍干燥。
[0023]第二步驟、殼聚糖/人羊膜-PEI/GP體系的制備: (a) 、殼聚糖溶液的制備 把脫乙酞度大于90%并且重量為0.18g的殼聚糖粉溶解到濃度為0.5M的28ml的醋酸溶 液中,通過(guò)磁力攪拌的方式至完全溶解,然后用醋酸溶液定容至88ml,得到濃度為2mg/ml的 殼聚糖溶液,在室溫進(jìn)行保存,將攪拌均勻的殼聚糖溶液用牛皮紙封口置于120°C的滅菌鍋 中消毒9分鐘,待滅菌后的殼聚糖溶液溫度降至室溫后放入3°C冰箱保存; (b) 、甘油磷酸二鈉即GP溶液的制備 將GP粉末溶解于三蒸水中,獲得質(zhì)量濃度為54%的溶液,通過(guò)0.22μπι的濾膜過(guò)濾除菌后 得到GP溶液,在溫度為3 °C保存; (c) 、殼聚糖/人羊膜-PEI/GP制備 在超凈臺(tái)中,量取配制好的無(wú)菌殼聚糖溶液與配制好的人羊膜-PEI溶液,把第二步驟 中的(a)步驟得到的殼聚糖溶液與第一步驟中得到的人羊膜-PEI體系的混合液按18:1的比 例加入無(wú)菌燒杯中,把燒杯放到冰上進(jìn)行0.9小時(shí)的超聲處理得到殼聚糖人羊膜溶液,把燒 杯中的殼聚糖人羊膜溶液放到冰上進(jìn)行攪拌并且把把第二步驟中的(b)步驟得到的GP溶液 緩慢逐步滴入到殼聚糖人羊膜溶液中,滴入的過(guò)程中觀察殼聚糖人羊膜溶液是否存在明顯 絮狀物質(zhì)出現(xiàn)并且當(dāng)沒(méi)有明顯絮狀物質(zhì)出現(xiàn)得到的中間混合液體IV,使中間混合液體IV中 的GP的最終濃度為580mg/ml并且用飽和磷酸二氫鈉調(diào)節(jié)pH值到6.9得到殼聚糖/人羊膜_ PEI/GP體系混合液,當(dāng)絮狀物質(zhì)出現(xiàn)就終止GP溶液滴入到殼聚糖人羊膜溶液的過(guò)程。
[0024]第二個(gè)實(shí)施例,其步驟是: 第一步驟、人羊膜-PEI體系的制備: (a) 、全溶脫細(xì)胞人羊膜制備:把人羊膜用PBS進(jìn)行血跡清除處理,再用生理鹽水進(jìn)行反 復(fù)清洗,把人羊膜切成2.2cm X 3.2cm,加入0.02% EDTA溶液后通過(guò)振搖方式混合得到中 間混合液體I,通過(guò)離心方式把中間混合液體進(jìn)行分離,棄除上清液后,加入0.27 mol醋酸 溶液,在溫度為90 °C的水中緩慢搖動(dòng),直至完全溶解中間混合液體Π ,設(shè)定參數(shù)為轉(zhuǎn)速 4200rpm、時(shí)間32min對(duì)中間混合液體Π 進(jìn)行離心處理,提取取上清液,把提取的上清液經(jīng) 過(guò)壓力為69.55KPa、溫度為119.6Γ和時(shí)間12min的消毒處理裝得到中間混合液體ΙΠ ,把中 間混合液體ΙΠ 在-22°C保存; (b) 、人羊膜-PEI體系的制備:將PEI溶液稀釋到濃度1.2%,用NaOH稀溶液調(diào)節(jié)PEI溶液 的pH值為6,加入中間混合液體ΙΠ 使PEI濃度設(shè)置為0.6%得到人羊膜-PEI體系的混合液,冷 凍干燥。
[0025]第二步驟、殼聚糖/人羊膜-PEI/GP體系的制備: (a) 、殼聚糖溶液的制備 把脫乙酞度91%并且重量為0.22g的殼聚糖粉溶解到濃度為0.5M的32ml的醋酸溶液 中,通過(guò)磁力攪拌的方式至完全溶解,然后用醋酸溶液定容至102ml,得到濃度為2mg/ml的 殼聚糖溶液,在室溫進(jìn)行保存,將攪拌均勻的殼聚糖溶液用牛皮紙封口置于122°C的滅菌鍋 中消毒11分鐘,待滅菌后的殼聚糖溶液溫度降至室溫后放入5°C冰箱保存; (b) 、甘油磷酸二鈉即GP溶液的制備 將GP粉末溶解于三蒸水中,獲得質(zhì)量濃度為58%的溶液,通過(guò)0.22μπι的濾膜過(guò)濾除菌后 得到GP溶液,在溫度為5 °C保存; (c) 、殼聚糖/人羊膜-PEI/GP制備 在超凈臺(tái)中,量取配制好的無(wú)菌殼聚糖溶液與配制好的人羊膜-PEI溶液,把第二步驟 中的(a)步驟得到的殼聚糖溶液與第一步驟中得到的人羊膜-PEI體系的混合液按22:1的比 例加入無(wú)菌燒杯中,把燒杯放到冰上進(jìn)行1.1小時(shí)的超聲處理得到殼聚糖人羊膜溶液,把燒 杯中的殼聚糖人羊膜溶液放到冰上進(jìn)行攪拌并且把把第二步驟中的(b)步驟得到的GP溶液 緩慢逐步滴入到殼聚糖人羊膜溶液中,滴入的過(guò)程中觀察殼聚糖人羊膜溶液是否存在明顯 絮狀物質(zhì)出現(xiàn)并且當(dāng)沒(méi)有明顯絮狀物質(zhì)出現(xiàn)得到的中間混合液體IV,使中間混合液體IV中 的GP的最終濃度為620mg/ml并且用飽和磷酸二氫鈉調(diào)節(jié)pH值到7.2得到殼聚糖/人羊膜-PEI/GP體系混合液,當(dāng)絮狀物質(zhì)出現(xiàn)就終止GP溶液滴入到殼聚糖人羊膜溶液的過(guò)程。
[0026]第三個(gè)實(shí)施例,其步驟是: 第一步驟、人羊膜-PEI體系的制備: (a)、全溶脫細(xì)胞人羊膜制備:把人羊膜用PBS進(jìn)行血跡清除處理,再用生理鹽水進(jìn)行反 復(fù)清洗,把人羊膜切成1.8-2.2cm X 2.8-3.2cm,加入0.02% EDTA溶液后通過(guò)振搖方式混 合得到中間混合液體I,通過(guò)離心方式把中間混合液體進(jìn)行分離,棄除上清液后,加入〇. 23-0.27 mol醋酸溶液,在溫度為90 °C的水中緩慢搖動(dòng),直至完全溶解中間混合液體Π ,設(shè)定 參數(shù)為轉(zhuǎn)速3800-4200rpm、時(shí)間28-32min對(duì)中間混合液體Π 進(jìn)行離心處理,提取取上清 液,把提取的上清液經(jīng)過(guò)壓力為65.55-69.55KPa、溫度為110.6-119.6°C和時(shí)間8-12min的 消毒處理裝得到中間混合液體m,把中間混合液體m在-18至-22°c保存; (b)、人羊膜-PEI體系的制備:將PEI溶液稀釋到濃度0.8-1.2%,用NaOH稀溶液調(diào)節(jié)PEI 溶液的pH值為4-6,加入中間混合液體ΙΠ 使PEI濃度設(shè)置為0.4-0.6%得到人羊膜-PEI體系的 混合液,冷凍干燥。
[0027]第二步驟、殼聚糖/人羊膜-PEI/GP體系的制備: (a) 、殼聚糖溶液的制備 把脫乙酞度大于90%并且重量為0.18-0.22g的殼聚糖粉溶解到濃度為0.5M的28-32ml 的醋酸溶液中,通過(guò)磁力攪拌的方式至完全溶解,然后用醋酸溶液定容至88-102ml,得到濃 度為2mg/ml的殼聚糖溶液,在室溫進(jìn)行保存,將攪拌均勻的殼聚糖溶液用牛皮紙封口置于 120-122 °C的滅菌鍋中消毒9-11分鐘,待滅菌后的殼聚糖溶液溫度降至室溫后放入3-5 °C冰 箱保存; (b) 、甘油磷酸二鈉即GP溶液的制備 將GP粉末溶解于三蒸水中,獲得質(zhì)量濃度為54-58%的溶液,通過(guò)0.22μπι的濾膜過(guò)濾除 菌后得到GP溶液,在溫度為3-5 °C保存; (c) 、殼聚糖/人羊膜-PEI/GP制備 在超凈臺(tái)中,量取配制好的無(wú)菌殼聚糖溶液與配制好的人羊膜-PEI溶液,把第二步驟 中的(a)步驟得到的殼聚糖溶液與第一步驟中得到的人羊膜-PEI體系的混合液按18-22:1 的比例加入無(wú)菌燒杯中,把燒杯放到冰上進(jìn)行0.9-1.1小時(shí)的超聲處理得到殼聚糖人羊膜 溶液,把燒杯中的殼聚糖人羊膜溶液放到冰上進(jìn)行攪拌并且把把第二步驟中的(b)步驟得 到的GP溶液緩慢逐步滴入到殼聚糖人羊膜溶液中,滴入的過(guò)程中觀察殼聚糖人羊膜溶液是 否存在明顯絮狀物質(zhì)出現(xiàn)并且當(dāng)沒(méi)有明顯絮狀物質(zhì)出現(xiàn)得到的中間混合液體IV,使中間混 合液體IV中的GP的最終濃度為580-620mg/ml并且用飽和磷酸二氫鈉調(diào)節(jié)pH值到6.9-7.2得 到殼聚糖/人羊膜-PEI/GP體系混合液,當(dāng)絮狀物質(zhì)出現(xiàn)就終止GP溶液滴入到殼聚糖人羊膜 溶液的過(guò)程。
[0028]第四個(gè)實(shí)施例,其步驟是: 第一步驟、人羊膜-PEI體系的制備: (a) 、全溶脫細(xì)胞人羊膜制備:把人羊膜用PBS進(jìn)行血跡清除處理,再用生理鹽水進(jìn)行反 復(fù)清洗,把人羊膜切成2.0cm X 3.0cm,加入0.02% EDTA溶液后通過(guò)振搖方式混合得到中 間混合液體I,通過(guò)離心方式把中間混合液體進(jìn)行分離,棄除上清液后,加入0.25 mol醋酸 溶液,在溫度為90 °C的水中緩慢搖動(dòng),直至完全溶解中間混合液體Π ,設(shè)定參數(shù)為轉(zhuǎn)速 4000rpm、時(shí)間30min對(duì)中間混合液體Π 進(jìn)行離心處理,提取取上清液,把提取的上清液經(jīng) 過(guò)壓力為67.55KPa、溫度為114.6Γ和時(shí)間lOmin的消毒處理裝得到中間混合液體ΙΠ ,把中 間混合液體ΙΠ 在-20°C保存; (b) 、人羊膜-PEI體系的制備:將PEI溶液稀釋到濃度1.0%,用NaOH稀溶液調(diào)節(jié)PEI溶液 的pH值為5,加入中間混合液體ΙΠ 使PEI濃度設(shè)置為0.5%得到人羊膜-PEI體系的混合液,冷 凍干燥。
[0029]第二步驟、殼聚糖/人羊膜-PEI/GP體系的制備: (a)、殼聚糖溶液的制備 把脫乙酞度93%并且重量為0.20g的殼聚糖粉溶解到濃度為0.5M的30ml的醋酸溶液 中,通過(guò)磁力攪拌的方式至完全溶解,然后用醋酸溶液定容至92ml,得到濃度為2mg/ml的殼 聚糖溶液,在室溫進(jìn)行保存,將攪拌均勻的殼聚糖溶液用牛皮紙封口置于121°C的滅菌鍋中 消毒10分鐘,待滅菌后的殼聚糖溶液溫度降至室溫后放入4°C冰箱保存; (b) 、甘油磷酸二鈉即GP溶液的制備 將GP粉末溶解于三蒸水中,獲得質(zhì)量濃度為56%的溶液,通過(guò)0.22μπι的濾膜過(guò)濾除菌后 得到GP溶液,在溫度為4 °C保存; (c) 、殼聚糖/人羊膜-PEI/GP制備 在超凈臺(tái)中,量取配制好的無(wú)菌殼聚糖溶液與配制好的人羊膜-PEI溶液,把第二步驟 中的(a)步驟得到的殼聚糖溶液與第一步驟中得到的人羊膜-PEI體系的混合液按20:1的比 例加入無(wú)菌燒杯中,把燒杯放到冰上進(jìn)行1.0小時(shí)的超聲處理得到殼聚糖人羊膜溶液,把燒 杯中的殼聚糖人羊膜溶液放到冰上進(jìn)行攪拌并且把把第二步驟中的(b)步驟得到的GP溶液 緩慢逐步滴入到殼聚糖人羊膜溶液中,滴入的過(guò)程中觀察殼聚糖人羊膜溶液是否存在明顯 絮狀物質(zhì)出現(xiàn)并且當(dāng)沒(méi)有明顯絮狀物質(zhì)出現(xiàn)得到的中間混合液體IV,使中間混合液體IV中 的GP的最終濃度為600mg/ml并且用飽和磷酸二氫鈉調(diào)節(jié)pH值到7.0得到殼聚糖/人羊膜-PEI/GP體系混合液,當(dāng)絮狀物質(zhì)出現(xiàn)就終止GP溶液滴入到殼聚糖人羊膜溶液的過(guò)程。
[0030] 第五個(gè)實(shí)施例,其步驟是: 第一步驟、人羊膜-PEI體系的制備: (a) 、全溶脫細(xì)胞人羊膜制備:把人羊膜用PBS進(jìn)行血跡清除處理,再用生理鹽水進(jìn)行反 復(fù)清洗,把人羊膜切成2.2cm X 3.2cm,加入0.02% EDTA溶液后通過(guò)振搖方式混合得到中 間混合液體I,通過(guò)離心方式把中間混合液體進(jìn)行分離,棄除上清液后,加入0.24 mol醋酸 溶液,在溫度為90 °C的水中緩慢搖動(dòng),直至完全溶解中間混合液體Π ,設(shè)定參數(shù)為轉(zhuǎn)速 41 OOrpm、時(shí)間3 lmin對(duì)中間混合液體Π 進(jìn)行離心處理,提取取上清液,把提取的上清液經(jīng) 過(guò)壓力為68.0KPa、溫度為111.0°C和時(shí)間9min的消毒處理裝得到中間混合液體ΙΠ ,把中間 混合液體ΙΠ 在-21.5°C保存; (b) 、人羊膜-PEI體系的制備:將PEI溶液稀釋到濃度1.1%,用NaOH稀溶液調(diào)節(jié)PEI溶液 的pH值為5.8,加入中間混合液體ΙΠ 使PEI濃度設(shè)置為0.48%得到人羊膜-PEI體系的混合液, 冷凍干燥。
[0031] 第二步驟、殼聚糖/人羊膜-PEI/GP體系的制備: (a) 、殼聚糖溶液的制備 把脫乙酞度95%并且重量為0.19g的殼聚糖粉溶解到濃度為0.5M的28ml的醋酸溶液 中,通過(guò)磁力攪拌的方式至完全溶解,然后用醋酸溶液定容至99ml,得到濃度為2mg/ml的殼 聚糖溶液,在室溫進(jìn)行保存,將攪拌均勻的殼聚糖溶液用牛皮紙封口置于120°C的滅菌鍋中 消毒9分鐘,待滅菌后的殼聚糖溶液溫度降至室溫后放入4.5°C冰箱保存; (b) 、甘油磷酸二鈉即GP溶液的制備 將GP粉末溶解于三蒸水中,獲得質(zhì)量濃度為55%的溶液,通過(guò)0.22μπι的濾膜過(guò)濾除菌后 得到GP溶液,在溫度為4.5 °C保存; (c) 、殼聚糖/人羊膜-PEI/GP制備 在超凈臺(tái)中,量取配制好的無(wú)菌殼聚糖溶液與配制好的人羊膜-PEI溶液,把第二步驟 中的(a)步驟得到的殼聚糖溶液與第一步驟中得到的人羊膜-PEI體系的混合液按21.4:1的 比例加入無(wú)菌燒杯中,把燒杯放到冰上進(jìn)行0.9小時(shí)的超聲處理得到殼聚糖人羊膜溶液,把 燒杯中的殼聚糖人羊膜溶液放到冰上進(jìn)行攪拌并且把把第二步驟中的(b)步驟得到的GP溶 液緩慢逐步滴入到殼聚糖人羊膜溶液中,滴入的過(guò)程中觀察殼聚糖人羊膜溶液是否存在明 顯絮狀物質(zhì)出現(xiàn)并且當(dāng)沒(méi)有明顯絮狀物質(zhì)出現(xiàn)得到的中間混合液體IV,使中間混合液體IV 中的GP的最終濃度為589mg/ml并且用飽和磷酸二氫鈉調(diào)節(jié)pH值到7.0得到殼聚糖/人羊膜-PEI/GP體系混合液,當(dāng)絮狀物質(zhì)出現(xiàn)就終止GP溶液滴入到殼聚糖人羊膜溶液的過(guò)程。
[0032] -種用于促進(jìn)軟骨再生修復(fù)的生物基質(zhì)凝膠材料的的凝膠性能的測(cè)定方法, 第一個(gè)實(shí)施例,其步驟是: 取1.82.2ml殼聚糖/人羊膜-PEI/GP體系混合液放于安培瓶中,置于35°C水浴,每隔0.8 分鐘倒置觀察流動(dòng)性,取倒置28秒殼聚糖/人羊膜-PEI/GP體系混合液不流動(dòng)的時(shí)間記為凝 膠時(shí)間。
[0033] 采用倒置法測(cè)定其凝膠時(shí)間:凝膠時(shí)間定義為由溶膠轉(zhuǎn)變?yōu)槟z所需的時(shí)間,當(dāng) 體系處于流動(dòng)液體狀態(tài)時(shí)定義為溶膠態(tài),當(dāng)體系處于不流動(dòng)半固體時(shí)定義為凝膠態(tài)。結(jié)果 表明在此條件下,本發(fā)明材料最終凝膠溫度可縮短到2.5分鐘。
[0034]殼聚糖/人羊膜-PEI/GP體系混合液的生物相容性的檢測(cè): 取健康成年SD大白鼠12只,用2%的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,在大鼠脊柱兩側(cè)背部皮 下,相互間隔為1.0Cm,將消毒好的殼聚糖/人羊膜-PEI/GP體系混合液1.0mL分別注入大鼠 皮下。在室溫下喂養(yǎng)。
[0035]術(shù)后2、4、6、8、12周注射部位切開(kāi),觀察植入物與周?chē)M織的關(guān)系。
[0036]試驗(yàn)結(jié)果表明應(yīng)用本發(fā)明的新型生物基質(zhì)凝膠材料進(jìn)行移植修復(fù)12周之后,體 式顯微鏡和光鏡觀察,植入物與自身組織結(jié)合緊密,表明軟骨修復(fù)支架材料具有良好的生 物相容性,是一種有效的治療關(guān)節(jié)軟骨缺損的材料。
[0037]具體檢測(cè)數(shù)據(jù)詳見(jiàn)表1 表1交聯(lián)后的生物相容性
殼聚糖/人羊膜-PEI/GP體系混合液的體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn): 將發(fā)明的殼聚糖/人羊膜-PEI/GP體系混合液0.2g溶入5ml生理鹽水溶液中,充分混勻, 4°C下靜置10分鐘。人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞計(jì)數(shù)后,加入3 X106細(xì)胞充分混勻。對(duì)照組注射玻 璃酸鈉。
[0038]取成年新西蘭大白兔,無(wú)菌狀態(tài)下在新西蘭大白兔右側(cè)后肢髕股關(guān)節(jié)面上用眼科 環(huán)鉆鉆出直徑約3.0mm深約2mm的軟骨缺損,分層縫合傷口制成軟骨損傷模型。術(shù)后5d每 只肌肉注射抗生素防感染。術(shù)后4周行關(guān)節(jié)穿刺,證實(shí)刺入關(guān)節(jié)腔后,注入0.5ml殼聚糖/人 羊膜-PEI/GP體系混合液復(fù)合材料,4周重復(fù)1次。對(duì)照組關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射0.5ml玻璃酸鈉復(fù)合 物。
[0039] 于受損部位上方10_15cm處放置升溫裝置(如烤燈)使缺損區(qū)域的溫度保持37 °C條件下6分鐘。術(shù)后12周處死兔取材,進(jìn)行大體觀察及組織學(xué)觀察。
[0040] 大體觀察可見(jiàn):試驗(yàn)組關(guān)節(jié)面較光滑,修復(fù)組織與周?chē)浌钦狭己?,色澤相近?空白對(duì)照組:缺損處凹陷,邊界清晰,缺損邊緣有少量修復(fù)。
[0041] 組織學(xué)觀察可見(jiàn):試驗(yàn)組為透明軟骨樣修復(fù),修復(fù)組織表面平整,與周?chē)浌钦?緊密、厚度相近,細(xì)胞密度稍大;空白對(duì)照組:所得修復(fù)組織為纖維樣組織,表面毛糙,細(xì)胞 外基質(zhì)排列紊亂。
[0042]具體對(duì)照結(jié)果如表2 表2.軟骨缺損修復(fù)效果比較表
第二個(gè)實(shí)施例,其步驟是: 取1.82.2ml殼聚糖/人羊膜-PEI/GP體系混合液放于安培瓶中,置于39°C水浴,每隔1.2 分鐘倒置觀察流動(dòng)性,取倒置32秒殼聚糖/人羊膜-PEI/GP體系混合液不流動(dòng)的時(shí)間記為凝 膠時(shí)間。
[0043]第三個(gè)實(shí)施例,其步驟是: 取1.82.2ml殼聚糖/人羊膜-PEI/GP體系混合液放于安培瓶中,置于35-39°C水浴,每隔 0.8-1.2分鐘倒置觀察流動(dòng)性,取倒置28-32秒殼聚糖/人羊膜-PEI/GP體系混合液不流動(dòng)的 時(shí)間記為凝膠時(shí)間。
[0044] 第四個(gè)實(shí)施例,其步驟是: 取1.82.2ml殼聚糖/人羊膜-PEI/GP體系混合液放于安培瓶中,置于37°C水浴,每隔1.0 分鐘倒置觀察流動(dòng)性,取倒置30秒殼聚糖/人羊膜-PEI/GP體系混合液不流動(dòng)的時(shí)間記為凝 膠時(shí)間。
[0045] -種用于促進(jìn)軟骨再生修復(fù)的生物基質(zhì)凝膠材料的應(yīng)用,把殼聚糖/人羊膜-PEI/ GP體系混合液混合臍血間充質(zhì)干細(xì)胞后注入關(guān)節(jié)腔的軟骨缺損部位,通過(guò)烤燈加溫,將種 子細(xì)胞固定于缺損處發(fā)揮再生修復(fù)作用,使溶膠一細(xì)胞復(fù)合物發(fā)生相變得到生物基質(zhì)凝膠 材料。
[0046] 生物基質(zhì)凝膠材料具有使用方便、操作簡(jiǎn)單、治療過(guò)程無(wú)損傷、療效確切等優(yōu)點(diǎn)。
[0047] -種用于促進(jìn)軟骨再生修復(fù)的生物基質(zhì)凝膠材料的制備方法的其它方式的實(shí)施 例: 人羊膜-PEI體系的制備 全溶脫細(xì)胞人羊膜制備:征得剖腹產(chǎn)患者的知情同意后,獲得其剖腹產(chǎn)后的人羊膜,用 PBS清除血跡,并反復(fù)清洗。把人羊膜切成2cm X 3cm,加入0.02% EDTA溶液后振搖。離心 后棄上清液,加入0.25 mol醋酸溶液后在90 °C水中緩慢搖動(dòng),直至完全溶解。由于粘度較 大,難以濾過(guò)除菌。在醋酸中處理完,4000rpm離心30min吸取上清,經(jīng)67.55KPa( 115.6度) 高壓滅菌lOmin后分裝,-20°C保存。
[0048] 人羊膜-PEI體系的制備:將PEI溶液稀釋到濃度1%,用NaOH稀溶液調(diào)節(jié)pH值4-6時(shí) 加入一定量的全溶人羊膜溶液使PEI濃度保持在0.5%即得混合體系,冷凍干燥。
[0049] 實(shí)施例1殼聚糖/人羊膜-PEI/GP體系的制備 1)殼聚糖溶液的配制和消毒 天平準(zhǔn)確稱(chēng)取〇.2g脫乙酞度大于90%的殼聚糖粉分散于30ml 0.5mol/L的醋酸溶液中, 磁力攪拌至完全溶解,然后用醋酸溶液定容至l〇〇ml,得2mg/ml殼聚糖溶液,室溫保存。將 攪拌均勻的殼聚糖溶液牛皮紙封口置于121°C的高溫高壓滅菌鍋中消毒10分鐘,待滅菌后 的殼聚糖溶液溫度降至室溫后放入4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0050] 2)甘油磷酸二鈉(GP)的配制和消毒 將GP粉末溶解于三蒸水中,獲得質(zhì)量濃度為56%的溶液,0.22μπι的濾膜過(guò)濾除菌,4°C保 存。
[0051 ] 3)殼聚糖/人羊膜-PEI/GP制備 超凈臺(tái)中,量取配制好的無(wú)菌殼聚糖溶液與配制好的人羊膜-PEI溶液按的比例加入無(wú) 菌燒杯中,于冰上超聲1小時(shí)備用。于冰上攪拌,將先前配制好的無(wú)菌的GP溶液緩慢逐步滴 入到配制好的殼聚糖人羊膜溶液中,滴入的過(guò)程中觀察溶液無(wú)明顯絮狀物質(zhì)出現(xiàn),否則視 為失敗。得到的殼聚糖/人羊膜-PEI/GP體系中,GP的最終濃度為600mg/ml,用飽和磷酸二氫 鈉調(diào)節(jié)pH值到6.9-7.2之間。
[0052]實(shí)施例2殼聚糖/人羊膜-PEI/GP體系凝膠性能測(cè)定 采用倒置法測(cè)定其凝膠時(shí)間:凝膠時(shí)間定義為由溶膠轉(zhuǎn)變?yōu)槟z所需的時(shí)間,當(dāng)體系 處于流動(dòng)液體狀態(tài)時(shí)定義為溶膠態(tài),當(dāng)體系處于不流動(dòng)半固體時(shí)定義為凝膠態(tài)。取2.0ml溶 膠放于安培瓶中,置于37°C水浴,每隔1分鐘倒置觀察流動(dòng)性,取倒置30秒溶膠不流動(dòng)的時(shí) 間記為凝膠時(shí)間。結(jié)果表明在此條件下,本發(fā)明材料最終凝膠溫度可縮短到2.5分鐘。
[0053]實(shí)施例3生物相容性的檢測(cè) 1)取健康成年SD大白鼠12只,用2%的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,在大鼠脊柱兩側(cè)背部 皮下,相互間隔為1.〇cm,將消毒好的凝膠l.OmL分別注入大鼠皮下。在室溫下喂養(yǎng)。
[0054] 2)術(shù)后2、4、6、8、12周注射部位切開(kāi),觀察植入物與周?chē)M織的關(guān)系。
[0055]試驗(yàn)結(jié)果表明應(yīng)用本發(fā)明的新型生物基質(zhì)凝膠材料進(jìn)行移植修復(fù)12周之后,體 式顯微鏡和光鏡觀察,植入物與自身組織結(jié)合緊密,表明軟骨修復(fù)支架材料具有良好的生 物相容性,是一種有效的治療關(guān)節(jié)軟骨缺損的材料。
[0056]具體檢測(cè)數(shù)據(jù)詳見(jiàn)表1
實(shí)施例5.體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 1)將發(fā)明的凝膠〇. 2g溶入5ml生理鹽水溶液中,充分混勻,4°C下靜置10分鐘。人臍血間 充質(zhì)干細(xì)胞計(jì)數(shù)后,加入3 X 106細(xì)胞充分混勻。對(duì)照組注射玻璃酸鈉。
[0057] 2)取成年新西蘭大白兔,無(wú)菌狀態(tài)下在新西蘭大白兔右側(cè)后肢髕股關(guān)節(jié)面上用眼 科環(huán)鉆鉆出直徑約3.Omm深約2mm的軟骨缺損,分層縫合傷口制成軟骨損傷模型。術(shù)后5d 每只肌肉注射抗生素防感染。術(shù)后4周行關(guān)節(jié)穿刺,證實(shí)刺入關(guān)節(jié)腔后,注入0.5ml復(fù)合材 料,4周重復(fù)1次。對(duì)照組關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射0.5ml玻璃酸鈉復(fù)合物。
[0058] 3)于受損部位上方10-15cm處放置升溫裝置(如烤燈)使缺損區(qū)域的溫度保持37°C 條件下6分鐘。術(shù)后12周處死兔取材,進(jìn)行大體觀察及組織學(xué)觀察。
[0059] 大體觀察可見(jiàn):試驗(yàn)組關(guān)節(jié)面較光滑,修復(fù)組織與周?chē)浌钦狭己?,色澤相近?空白對(duì)照組:缺損處凹陷,邊界清晰,缺損邊緣有少量修復(fù)。
[0060] 組織學(xué)觀察可見(jiàn):試驗(yàn)組為透明軟骨樣修復(fù),修復(fù)組織表面平整,與周?chē)浌钦?緊密、厚度相近,細(xì)胞密度稍大;空白對(duì)照組:所得修復(fù)組織為纖維樣組織,表面毛糙,細(xì)胞 外基質(zhì)排列紊亂。
[0061 ]具體對(duì)照結(jié)果如表2
利用本發(fā)明制備的可注射軟骨再生生物基質(zhì)材料混合臍血間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)關(guān)節(jié)腔 注入軟骨缺損部位,通過(guò)烤燈加溫使溶膠一細(xì)胞復(fù)合物發(fā)生相變,從而將種子細(xì)胞固定于 缺損處發(fā)揮再生修復(fù)作用,此材料具有使用方便、操作簡(jiǎn)單、治療過(guò)程無(wú)損傷、療效確切等 優(yōu)點(diǎn) 本發(fā)明具有下特點(diǎn): 1、由于設(shè)計(jì)了人羊膜-PEI體系的混合液、殼聚糖溶液和GP溶液,通過(guò)殼聚糖溶液和GP 溶液形成的凝膠中,保持了人羊膜-PEI體系的混合液中的細(xì)胞的活性,促進(jìn)了軟骨再生修 復(fù),不再進(jìn)行人工關(guān)節(jié)置換進(jìn)行治療,因此提高了軟骨損傷進(jìn)一步進(jìn)展形成的重度骨關(guān)節(jié) 炎的非手術(shù)治療效果。
[0062] 2、由于設(shè)計(jì)了殼聚糖溶液和GP溶液,形成的凝膠不對(duì)患者產(chǎn)生生理刺激。
[0063] 3、由于設(shè)計(jì)了人羊膜-PEI體系的混合液,保持的再生細(xì)胞的活性好。
[0064] 4、由于設(shè)計(jì)了醋酸,對(duì)人羊膜的損害小。
[0065] 5、由于設(shè)計(jì)了NaOH稀溶液和飽和磷酸二氫鈉,進(jìn)行分步進(jìn)行pH值調(diào)節(jié),滿足了制 備工藝的要求,提高了生物基質(zhì)凝膠材料的活性。
[0066] 6、由于設(shè)計(jì)了對(duì)結(jié)構(gòu)形狀進(jìn)行了數(shù)值范圍的限定,使數(shù)值范圍為本發(fā)明的技術(shù)方 案中的技術(shù)特征,不是通過(guò)公式計(jì)算或通過(guò)有限次試驗(yàn)得出的技術(shù)特征,試驗(yàn)表明該數(shù)值 范圍的技術(shù)特征取得了很好的技術(shù)效果。
[0067] 7、由于設(shè)計(jì)了本發(fā)明的技術(shù)特征,在技術(shù)特征的單獨(dú)和相互之間的集合的作用, 通過(guò)試驗(yàn)表明,本發(fā)明的各項(xiàng)性能指標(biāo)為現(xiàn)有的各項(xiàng)性能指標(biāo)的至少為1.7倍,通過(guò)評(píng)估具 有很好的市場(chǎng)價(jià)值。
[0068]還有其它的與人羊膜-PEI體系的混合液、殼聚糖溶液和GP溶液的相同或相近似的 技術(shù)特征都是本發(fā)明的實(shí)施例之一,并且以上所述實(shí)施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組 合,為滿足專(zhuān)利法、專(zhuān)利實(shí)施細(xì)則和審查指南的要求,不再對(duì)上述實(shí)施例中的各個(gè)技術(shù)特征 所有可能的組合的實(shí)施例都進(jìn)行描述。
[0069]上述實(shí)施例只是本發(fā)明所提供的用于促進(jìn)軟骨再生修復(fù)的生物基質(zhì)凝膠材料的 制備方法、凝膠性能測(cè)定方法及應(yīng)用的一種實(shí)現(xiàn)形式,根據(jù)本發(fā)明所提供的方案的其他變 形,增加其中的成份或步驟,或者將本發(fā)明用于其他的與本發(fā)明接近的技術(shù)領(lǐng)域,均屬于本 發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于促進(jìn)軟骨再生修復(fù)的生物基質(zhì)凝膠材料的制備方法,其特征是:其步驟:在 人羊膜-PEI體系的混合液與殼聚糖溶液的混合液中加入GP溶液進(jìn)行調(diào)和處理,得到作為生 物基質(zhì)凝膠材料的基體的殼聚糖/人羊膜-PEI/GP體系混合液。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于促進(jìn)軟骨再生修復(fù)的生物基質(zhì)凝膠材料的制備方法,其 特征是:按照對(duì)人羊膜-PEI體系的混合液與殼聚糖溶液的混合液的組合混合液通過(guò)GP溶液 的反應(yīng)得到最終生物基質(zhì)凝膠材料為技術(shù)要點(diǎn)。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于促進(jìn)軟骨再生修復(fù)的生物基質(zhì)凝膠材料的制備方法,其 特征是:其步驟是: 第一步驟、人羊膜-PEI體系的制備: (a) 、全溶脫細(xì)胞人羊膜制備:把人羊膜用PBS進(jìn)行血跡清除處理,再用生理鹽水進(jìn)行反 復(fù)清洗,把人羊膜切成1.8-2.2cm X 2.8-3.2cm,加入0.02% EDTA溶液后通過(guò)振搖方式混 合得到中間混合液體I,通過(guò)離心方式把中間混合液體進(jìn)行分離,棄除上清液后,加入〇. 23- 0.27 mol醋酸溶液,在溫度為90 °C的水中緩慢搖動(dòng),直至完全溶解中間混合液體Π ,設(shè)定 參數(shù)為轉(zhuǎn)速3800-4200rpm、時(shí)間28-32min對(duì)中間混合液體Π 進(jìn)行離心處理,提取取上清 液,把提取的上清液經(jīng)過(guò)壓力為65.55-69.55KPa、溫度為110.6-119.6°C和時(shí)間8-12min的 消毒處理裝得到中間混合液體m,把中間混合液體m在-18至-22°c保存; (b) 、人羊膜-PEI體系的制備:將PEI溶液稀釋到濃度0.8-1.2%,用NaOH稀溶液調(diào)節(jié)PEI 溶液的pH值為4-6,加入中間混合液體ΙΠ 使PEI濃度設(shè)置為0.4-0.6%得到人羊膜-PEI體系的 混合液,冷凍干燥, 第二步驟、殼聚糖/人羊膜-PEI/GP體系的制備: (a)、殼聚糖溶液的制備 把脫乙酞度大于90%并且重量為0.18-0.22g的殼聚糖粉溶解到濃度為0.5M的28-32ml 的醋酸溶液中,通過(guò)磁力攪拌的方式至完全溶解,然后用醋酸溶液定容至88-102ml,得到濃 度為2mg/ml的殼聚糖溶液,在室溫進(jìn)行保存,將攪拌均勻的殼聚糖溶液用牛皮紙封口置于 120-122 °C的滅菌鍋中消毒9-11分鐘,待滅菌后的殼聚糖溶液溫度降至室溫后放入3-5 °C冰 箱保存; (b )、甘油磷酸二鈉即GP溶液的制備 將GP粉末溶解于三蒸水中,獲得質(zhì)量濃度為54-58%的溶液,通過(guò)0.22μπι的濾膜過(guò)濾除 菌后得到GP溶液,在溫度為3-5 °C保存; (c) 、殼聚糖/人羊膜-PEI/GP制備 在超凈臺(tái)中,量取配制好的無(wú)菌殼聚糖溶液與配制好的人羊膜-PEI溶液,把第二步驟 中的(a)步驟得到的殼聚糖溶液與第一步驟中得到的人羊膜-PEI體系的混合液按18-22:1 的比例加入無(wú)菌燒杯中,把燒杯放到冰上進(jìn)行0.9-1.1小時(shí)的超聲處理得到殼聚糖人羊膜 溶液,把燒杯中的殼聚糖人羊膜溶液放到冰上進(jìn)行攪拌并且把把第二步驟中的(b)步驟得 到的GP溶液緩慢逐步滴入到殼聚糖人羊膜溶液中,滴入的過(guò)程中觀察殼聚糖人羊膜溶液是 否存在明顯絮狀物質(zhì)出現(xiàn)并且當(dāng)沒(méi)有明顯絮狀物質(zhì)出現(xiàn)得到的中間混合液體IV,使中間混 合液體IV中的GP的最終濃度為580-620mg/ml并且用飽和磷酸二氫鈉調(diào)節(jié)pH值到6.9-7.2得 到殼聚糖/人羊膜-PEI/GP體系混合液,當(dāng)絮狀物質(zhì)出現(xiàn)就終止GP溶液滴入到殼聚糖人羊膜 溶液的過(guò)程。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于促進(jìn)軟骨再生修復(fù)的生物基質(zhì)凝膠材料的制備方法,其 特征是:其步驟是: 第一步驟、人羊膜-PEI體系的制備: (a)、全溶脫細(xì)胞人羊膜制備:把人羊膜用PBS進(jìn)行血跡清除處理,再用生理鹽水進(jìn)行反 復(fù)清洗,把人羊膜切成2.2cm X 3.2cm,加入0.02% EDTA溶液后通過(guò)振搖方式混合得到中 間混合液體I,通過(guò)離心方式把中間混合液體進(jìn)行分離,棄除上清液后,加入0.24 mol醋酸 溶液,在溫度為90 °C的水中緩慢搖動(dòng),直至完全溶解中間混合液體Π ,設(shè)定參數(shù)為轉(zhuǎn)速 41OOrpm、時(shí)間3 Imin對(duì)中間混合液體Π 進(jìn)行離心處理,提取取上清液,把提取的上清液經(jīng) 過(guò)壓力為68.OKPa、溫度為111.(TC和時(shí)間9min的消毒處理裝得到中間混合液體ΙΠ ,把中間 混合液體ΙΠ 在-21.5°C保存; (b )、人羊膜-PEI體系的制備:將PEI溶液稀釋到濃度1.1 %,用NaOH稀溶液調(diào)節(jié)PEI溶液 的pH值為5.8,加入中間混合液體ΙΠ 使PEI濃度設(shè)置為0.48%得到人羊膜-PEI體系的混合液, 冷凍干燥, 第二步驟、殼聚糖/人羊膜-PEI/GP體系的制備: (a)、殼聚糖溶液的制備 把脫乙酞度95%并且重量為0.19g的殼聚糖粉溶解到濃度為0.5M的28ml的醋酸溶液 中,通過(guò)磁力攪拌的方式至完全溶解,然后用醋酸溶液定容至99ml,得到濃度為2mg/ml的殼 聚糖溶液,在室溫進(jìn)行保存,將攪拌均勻的殼聚糖溶液用牛皮紙封口置于120°C的滅菌鍋中 消毒9分鐘,待滅菌后的殼聚糖溶液溫度降至室溫后放入4.5°C冰箱保存; (b )、甘油磷酸二鈉即GP溶液的制備 將GP粉末溶解于三蒸水中,獲得質(zhì)量濃度為55%的溶液,通過(guò)0.22μπι的濾膜過(guò)濾除菌后 得到GP溶液,在溫度為4.5 °C保存; (c)、殼聚糖/人羊膜-PEI/GP制備 在超凈臺(tái)中,量取配制好的無(wú)菌殼聚糖溶液與配制好的人羊膜-PEI溶液,把第二步驟 中的(a)步驟得到的殼聚糖溶液與第一步驟中得到的人羊膜-PEI體系的混合液按21.4:1的 比例加入無(wú)菌燒杯中,把燒杯放到冰上進(jìn)行0.9小時(shí)的超聲處理得到殼聚糖人羊膜溶液,把 燒杯中的殼聚糖人羊膜溶液放到冰上進(jìn)行攪拌并且把把第二步驟中的(b)步驟得到的GP溶 液緩慢逐步滴入到殼聚糖人羊膜溶液中,滴入的過(guò)程中觀察殼聚糖人羊膜溶液是否存在明 顯絮狀物質(zhì)出現(xiàn)并且當(dāng)沒(méi)有明顯絮狀物質(zhì)出現(xiàn)得到的中間混合液體IV,使中間混合液體IV 中的GP的最終濃度為589mg/ml并且用飽和磷酸二氫鈉調(diào)節(jié)pH值到7.0得到殼聚糖/人羊膜-PEI/GP體系混合液,當(dāng)絮狀物質(zhì)出現(xiàn)就終止GP溶液滴入到殼聚糖人羊膜溶液的過(guò)程。5. -種用于促進(jìn)軟骨再生修復(fù)的生物基質(zhì)凝膠材料的凝膠性能的測(cè)定方法,其步驟 是: 取1.82.2ml殼聚糖/人羊膜-PEI/GP體系混合液放于安培瓶中,置于35-39°C水浴,每隔 0.8-1.2分鐘倒置觀察流動(dòng)性,取倒置28-32秒殼聚糖/人羊膜-PEI/GP體系混合液不流動(dòng)的 時(shí)間記為凝膠時(shí)間。6. -種用于促進(jìn)軟骨再生修復(fù)的生物基質(zhì)凝膠材料的應(yīng)用,把殼聚糖/人羊膜-PEI/GP體 系混合液混合臍血間充質(zhì)干細(xì)胞后注入關(guān)節(jié)腔的軟骨缺損部位,通過(guò)烤燈加溫,將種子細(xì)胞 固定于缺損處發(fā)揮再生修復(fù)作用,使溶膠一細(xì)胞復(fù)合物發(fā)生相變得到生物基質(zhì)凝膠材料。
【文檔編號(hào)】A61L27/36GK105903077SQ201610230098
【公開(kāi)日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2016年4月14日
【發(fā)明人】田麗娜, 羅光會(huì), 梁峰, 朱麟, 楊繼建
【申請(qǐng)人】山東景源生物科技有限公司